Articolo metodologico

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

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DOI:

10.3791/58055

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16 maggio 2019

 ,  ,  , 
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

In questo articolo

Sommario

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell'embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l'uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.

Abstract

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs), come la coltura embrionale in vitro o la crioconservazione degli embrioni, influenzano i modelli di sviluppo naturale con conseguenze perinatale e postnatale. Per garantire l'innocuità delle applicazioni ART, sono necessari studi su modelli animali. Inoltre, come ultimo passo, gli studi sullo sviluppo degli embrioni richiedono una valutazione della loro capacità di sviluppare una progenie sana a lungo termine. Qui, il trasferimento dell'embrione nell'utero è indispensabile per eseguire qualsiasi esperimento correlato alle arti.

Il coniglio è stato usato come organismo modello per studiare la riproduzione dei mammiferi per oltre un secolo. Oltre alla sua vicinanza filogenetica alla specie umana e alle sue piccole dimensioni e ai bassi costi di manutenzione, ha importanti caratteristiche riproduttive come l'ovulazione indotta, una cronologia dello sviluppo embrionale precoce simile all'uomo e una breve gestazione che ci permettono di studiare facilmente le conseguenze dell'applicazione ART. Inoltre, le arti (come l'iniezione intracitoplasmatica dello sperma, la coltura embrionale o la crioconservazione) vengono applicate con un'adeguata efficienza in questa specie.

Utilizzando la tecnica di trasferimento dell'embrione laparoscopica e il protocollo di crioconservazione presentato in questo articolo, descriviamo 1) come trasferire gli embrioni attraverso una tecnica facile, minimamente invasiva e 2) un protocollo efficace per lo stoccaggio a lungo termine di coniglio per fornire capacità logistiche flessibili nel tempo e la capacità di trasportare il campione. I risultati ottenuti dopo il trasferimento di embrioni di coniglio in diverse fasi evolutive indicano che la morula è la fase ideale per il recupero e il trasferimento degli embrioni di coniglio. Pertanto, è necessario un trasferimento di embrioni oviductal, giustificando la procedura chirurgica. Inoltre, le morule di coniglio sono con successo vetrificata e laparoscopicamente trasferite, dimostrando l'efficacia delle tecniche descritte.

Introduzione

Con l'obiettivo di bypassare l'infertilità umana o migliorare la diffusione del bestiame di alto valore genetico e preservare le risorse genetiche animali, una serie di tecniche denominate collettivamente tecnologie di riproduzione assistita, come la superovulazione, in fecondazione in vitro, coltura embrionale, o crioconservazione, sono stati sviluppati1,2. Attualmente, vengono somministrati trattamenti ormonali per stimolare le ovaie e produrre un gran numero di follicoli ovarici antrici1. Gli ovociti raccolti da questi follicoli possono essere maturati, fertilizzati e sviluppati in vitro fino a quando non sono criopriservati o trasferiti alle madri surrogato3. Tuttavia, durante questi trattamenti, gameti e zigoti sono esposti a una serie di processi non fisiologici che potrebbero richiedere l'adattamento dell'embrione per sopravvivere in queste condizioni4,5. Questo adattamento è possibile a causa della plasticità embrionale precoce, che consente cambiamenti embrionali nell'espressione genica e nella programmazione dello sviluppo6. Tuttavia, queste modifiche possono influenzare le fasi successive dello sviluppo embrionale fino all'età adulta, ed è ora ampiamente accettata che metodi, tempi, procedure di crioconservazione o condizioni di coltura mostrano risultati diversi sul destino dell'embrione7 , 8. Pertanto, per chiarire gli effetti specifici indotti delle arti, l'uso di modelli animali ben caratterizzati è inevitabile.

La prima nascita documentata dal vivo risultante dal trasferimento di embrioni di mammiferi ha avuto luogo nel 18909. Oggi, il trasferimento di embrioni (ET) a una femmina surrogata è un passo cruciale nello studio degli effetti indotti dall'arte durante il preimpianto nelle successive fasi di sviluppo dell'embrione10. Le tecniche ET dipendono dalle dimensioni e dalla struttura anatomica di ogni animale. Nel caso di modelli animali di grandi dimensioni, è stato possibile eseguire ET con tecniche di ET non chirurgiche transcervicali, ma in specie di dimensioni più ridotte la cateterizzazione della cervice è più complessa e le tecniche chirurgiche sono frequentemente utilizzate11. Tuttavia, l'ET chirurgico può causare emorragie che potrebbero compromettere lo sviluppo dell'impianto e dell'embrione, poiché il sangue può invadere il lume uterino, causando la morte embrionale10. Le tecniche di et non chirurgiche transcervicali sono ancora applicate in esseri umani, babooni, bovini, suini e topi12,13,14,15,16,17, ma chirurgico Gli ETS sono ancora utilizzati in specie come capre, ovini o altri animali che presentano ulteriori difficoltà10,18,19,20,21, come i conigli (due indipendenti) o topi (di piccole dimensioni). Tuttavia, i metodi di trasferimento chirurgico tendono ad essere gradualmente sostituiti da metodi meno invasivi. L'endoscopia è stata utilizzata per trasferire embrioni, ad esempio, in conigli, suini e piccoli ruminanti18,19,20. Questi metodi endoscopici minimamente invasivi possono essere utilizzati per trasferire embrioni nell'Anulla attraverso l'infundibulum, che è essenziale nei conigli e ha dimostrato effetti benefici in alcune specie20. Ciò si basa sull'importanza del corretto dialogo tra embrione e madre durante i primi stadi embrionali nell'ovidotto. Come accennato in precedenza, il rimodellamento embrionale che si svolge nei conigli durante la migrazione embrionale attraverso l'ovidotto è essenziale per ottenere embrioni in grado di impiantare22,23.

Modelli animali di dimensioni maggiori, come i bovini, sono interessanti perché le caratteristiche biochimiche e preimpiantanti sono simili a quelle della specie umana24. Tuttavia, gli animali di grandi dimensioni sono troppo costosi da usare nelle prove preliminari, e i roditori sono considerati un modello ideale (76 gli organismi modello% sono roditori) per la ricerca di laboratorio25. Tuttavia, il modello di coniglio fornisce alcuni vantaggi rispetto ai roditori negli studi sulla riproduzione, poiché alcuni processi biologici riproduttivi esposti dagli esseri umani sono più simili nei conigli rispetto a quelli nei topi. L'uomo e i conigli presentano un'attivazione del genoma embrionale cronologico simile, la gastrulazione e la struttura della placenta hemochorial. Inoltre, utilizzando conigli è possibile conoscere l'esatta tempistica di fecondazione e fasi di gravidanza a causa della loro ovulazione indotta25. I cicli di vita dei conigli sono brevi, completando la gestazione in 31 giorni e raggiungendo la pubertà a circa 4-5 mesi; l'animale è facile da maneggiare grazie al suo comportamento docile e non aggressivo, e il suo mantenimento è molto economico rispetto alle spese degli animali più grandi. Inoltre, è fondamentale ricordare che i conigli hanno un utero duplex con due cervidi indipendenti11,25. Questo colloca il coniglio in una posizione preferenziale, poiché gli embrioni provenienti dai diversi gruppi sperimentali possono essere trasferiti nello stesso animale, ma in un altro corno uterino. Questo ci permette di confrontare entrambi gli effetti sperimentali, riducendo il fattore materno dai risultati.

Oggi, i metodi ET non chirurgici non sono in uso nel coniglio. Alcuni studi condotti alla fine degli anni '90 utilizzando una tecnica transcervicale hanno portato a bassi tassi di consegna che vanno da 5,5% a 20,0%11,26 contro 50-65% con metodi chirurgici, tra cui la procedura di laparoscopia descritta da Besenfelder e Brem18. I bassi tassi di successo di questi metodi ET non chirurgici nei conigli coincidono con la mancanza del necessario rimodellamento dell'embrione nell'ovidotto, che viene evitato nell'ET transcervicale. Qui, descriviamo un'efficace procedura laparoscopica ET minimamente invasiva utilizzando conigli come organismo modello. Questa tecnica fornisce un modello per ulteriori ricerche sulla riproduzione in animali di grandi dimensioni e umani.

Poiché i conigli hanno una finestra temporale particolarmente ristretta per l'impianto embrionale, l'ET in questa specie richiede un alto grado di sincronia tra la fase evolutiva dell'embrione all'ET e lo stato fisiologico del ricevente27. In alcuni casi, dopo un trattamento riproduttivo che rallenta lo sviluppo dell'embrione (come la coltura in vitro ) o altera la ricettività endometriale (come i trattamenti di superovulazione), non vi è alcuna sincronia tra l'embrione e l'utero materno. Queste situazioni possono influire negativamente sui risultati. Per rispondere in questi contesti, descriviamo un efficace protocollo di vitrificazione del coniglio morula che ci permette di mettere in pausa, organizzare e riprendere gli esperimenti. Questo processo è logisticamente auspicabile per gli studi sulla riproduzione e ci dà la capacità di stoccaggio a lungo termine di embrioni, permettendo il loro trasporto. La procedura laparoscopica e le strategie di criopriservazione consentono una migliore pianificazione degli studi con meno animali. Così, la nostra metodologia offre vantaggi igienici ed economici ed è conforme al concetto di 3Rs (sostituzione, riduzione e perfezionamento) della ricerca animale con l'obiettivo dichiarato di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento. Così, con questi metodi, i conigli costituiscono un organismo modello ideale per saggi riproduttivi in vivo .

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali utilizzate in questo studio sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE CEE per gli esperimenti sugli animali e riviste e approvate dal comitato etico per la sperimentazione con gli animali dell'Universitat Politècnica de València, Spagna (codice di ricerca: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detiene un certificato di autorizzazione emesso dall'amministrazione governativa Valenciana per sperimentare sugli animali. XGD è autorizzata a sorvegliare in situ il benessere e la cura degli animali durante l'esperimento.

1. trasferimento degli embrioni

  1. Preparazione delle femmine riceventi
    1. Utilizzare solo femmine sessualmente mature (> 4,5 mesi di età).
    2. Una settimana prima di ET, adattare le femmine a un regime di 16 ore di luce/8 h scuro per avviare la crescita follicolare e una maggiore ricettività femminile.
    3. Selezionare le femmine destinatarie, osservando la turgidità e il colore della vulva. Se la vulva è turgida e rossastra, la femmina è ricettiva.
    4. Indurre pseudogravidanza (ovulazione) da una singola iniezione intramuscolare di 1 μg di buserelin acetato (analogo sintetico dell'ormone di rilascio di gonadotropina) indipendentemente dal peso corporeo.
      Nota: normalmente, 0,8 μg è una dose adatta per l'induzione dell'ovulazione in conigli di medie dimensioni (4-5 kg), quindi 1 μg generalmente garantisce l'ovulazione.
    5. Indurre l'ovulazione come molti giorni prima dell'età degli embrioni da trasferire (ad esempio, 70-72 h dopo la morula fresca ET).
  2. Anestesia e analgesia
    1. Pesare il coniglio e caricare i seguenti anestetici e analgesici.
      1. In una siringa da 1 ml con un ago 30g: carico xilazina (5mg/kg) e buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg). In un'altra siringa da 1 mL con un ago pericranico 23G, il carico di chetamina cloridrato (35 mg/kg).
    2. Tenga il coniglio e inietti la miscela di Xylazine-buprenorfina per via intramuscolare.
    3. Inserire l'ago pericranico con ketamina nella vena marginale dell'orecchio, introducendo lentamente tutti i contenuti della siringa per via endovenosa.
    4. Fissare l'ago e lasciarlo inserito in tutti i passaggi rimanenti per somministrare più anestesia, se necessario.
    5. Lasciare il coniglio nella gabbia (pulito e senza altri animali) su un palco caldo.
    6. Una volta incosciente, applicare l'unguento oculare per evitare la secchezza dell'occhio e controllare l'assenza del freflex palpebrale.
      Nota: questo protocollo fornisce un piano di anestesia chirurgico per un minimo di 30 min. Se è necessario un tempo più lungo, iniettare ulteriori dosaggi con la metà della quantità di chetamina cloridrato descritta in 1.2.1 dopo 30 min.
    7. Monitorare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del pedale e il movimento respiratorio. Cambiamenti nel modello di respirazione ad un tasso irregolare e più veloce indicano la perdita del piano corretto di anestesia.
    8. Monitorare il colore delle membrane mucose (occhi, labbra, ecc.), la frequenza respiratoria (30-60 respiratori al minuto), la frequenza cardiaca (120-325 battute al minuto) e la temperatura rettale (38-39,6 ° c).
    9. Otto ore prima del trasferimento, trattenere il cibo dagli animali per evitare la maggiore dimensione dell'intestino e l'attività fino a quando il processo ET è finito. Lasciare libero l'accesso all'acqua.
  3. Preparazione embrionale
    1. Riscaldare il supporto di manipolazione dell'embrione a 25 ° c: base medium (BM), costituito da soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina.
    2. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, risciacquare gli embrioni freschi o scongelati (fase 2) con BM.
    3. Utilizzando guanti sterili, collegare un catetere epidurale 17G opportunamente configurato a una siringa da 1 mL.
    4. Aspirate 1 cm di BM nel catetere, seguita da una piccola bolla d'aria.
    5. Aspirare 5-7embrioni in un volume di 10 μL di BM, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
    6. Terminare il caricamento del catetere aspirando 1 cm di BM.
  4. Trasferimento embrionale
    1. Si consideri l'uso di guanti sterili, abito e maschera per garantire un ambiente asettico.
    2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia, e pulirli con 70% etanolo.
    3. Eseguire l'anestesia come precedentemente dettagliato (passo 1,2), controllando la perdita di riflessi.
    4. Radersi la pelliccia dall'addome ventrale con un rasoio elettrico.
    5. Preparare l'addome ventrale in modo asettico.
      1. Pulire l'area chirurgica e rimuovere i peli residui. Lavare l'area chirurgica con un sapone gluconato di clorexidina. Disinfettare l'area con la soluzione di clorexidina ed etanolo 96 º (3 volte).
    6. Posizionare l'animale su un tavolo chirurgico caldo, nella posizione di Trendelenburg (testa in giù a 45 °) per garantire che lo stomaco e l'intestino si trovano cranialmente. Considerare l'evacuazione della vescica se è turgida. Se qualche visceri sono danneggiati nel processo, l'animale può morire. È quindi importante averli posizionati correttamente (Figura 1).
    7. Coprire l'area utilizzando un asciugamano sterile, con un foro (Fenestration) esponendo la zona rasata, per separare il sito chirurgico da eventuali aree contaminanti potenziali.
    8. Inserire un trocar endoscopico di 5 cm nella cavità addominale, 2 cm di caudale al processo xifoideo, e Insuflaggio attraverso di essa la cavità peritoneale con un insufflatore meccanico di regolazione della pressione.
      Nota: la pressione intra-addominale deve essere 8-12 mmHg con CO2 (Figura 1a).
    9. Inserire la fotocamera dell'endoscopio attraverso il trocar endoscopico (Figura 1B).
      Nota: identificare il tratto riproduttivo, determinando lo stato e la posizione dell'infundibulum e dell'ampolla prima di et per facilitare i passi successivi.
    10. Inserire l'ago epidurale da 17 G nella regione inguinali tra 2-3 cm di profondità (Figura 1B).
    11. Identificare l'ingresso dell'infundibulum (Figura 2a, 2B).
    12. Inserire il catetere caricato (passo 1,3) attraverso l'ago epidurale nell'addome (Figura 1C).
    13. Individuare l'ovidotto e inserire 1-2 cm di catetere epidurale attraverso l'infundibulum nell'ampolla (Figura 2a-2C). Non progredire molto lontano nell'ovidotto per prevenire danni ed emorragie.
    14. Rilasciare gli embrioni nell'ovidotto premendo delicatamente lo stantuffo della siringa accoppiato al catetere (Figura 2D-2F). Entrambe le bolle d'aria devono uscire dal catetere.
    15. Rimuovere il catetere subito dopo che gli embrioni sono stati rilasciati.
    16. Sciacquare il catetere, aspirando e rilasciando il mezzo di manipolazione per verificare l'assenza degli embrioni e confermare il trasferimento di successo.
    17. Ripetere i passaggi 1.4.11 a 1.4.16 nell'altro lato dell'utero, se lo si desidera.
    18. Rimuovere l'ago epidurale e la fotocamera endoscopio.
    19. Rilasciare CO2 attraverso il trocar endoscopico. Se il gas in eccesso rimane nell'addome dell'animale, avrà dolore e disagio.
    20. Rimuovere il trocar endoscopico dalla cavità addominale. Rimuovere l'asciugamano chirurgico.
    21. Interrompere l'anestesia.
    22. Pulire l'incisione fatta dal trocar con la soluzione di clorexidina. Chiudere l'incisione fatta dal trocar con un alluminio micronizzato e una medicazione in plastica.
  5. Assistenza postoperatoria
    1. Trattare gli animali con antibiotici: 10 mg/kg di enrofloxacina, per via sottocutanea, ogni 24 ore per 5 giorni.
    2. Somministrare analgesici: buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg), intramuscolarmente, ogni 12 ore per 3 giorni; Meloxicam (0,2 mg/kg), per via sottocutanea, ogni 24 ore per 3 giorni.
    3. Monitorare gli animali per almeno 30 minuti dopo l'intervento chirurgico (a seconda dell'animale e la dose di anestesia utilizzata) assicurandosi che recuperano le loro condizioni fisiologiche.
    4. Identificare il destinatario (ad esempio, il tatuaggio dell'orecchio) e gli animali domestici singolarmente in una gabbia pulita con le condizioni ambientali appropriate.

figure-protocol-1
Figura 1: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (Vista esterna). A) inserimento del trocar endoscopico (una porta). B) inserimento della telecamera endoscopica e dell'ago epidurale (freccia nera). C) inserimento del catetere di trasferimento embrionale (freccia bianca) attraverso l'ago epidurale. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-protocol-2
Figura 2: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (vista interna). A: Inserimento del catetere attraverso l'ago epidurale nella zona addominale. Asterisco indica l'infundibulum. B, C, D: Il catetere caricato con gli embrioni viene inserito nella regione dell'Anulla attraverso l'infundibulum. e, F: Rilascio degli embrioni, confermata dalla visualizzazione di un ovidotto gonfio. Questa cifra è stata adattata da Marco-Jiménez et al. 38. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

2. vetrificazione e riscaldamento dell'embrione

  1. Eseguire tutte le manipolazioni a temperatura ambiente (circa 22 ° c) per ridurre la tossicità della soluzione di vetrificazione a temperature più calde.
    Nota: gli embrioni possono essere spostati utilizzando la pipetta automatica 0.1-2 μL in questo protocollo, ma altri dispositivi simili per muovere gli embrioni trascinando il volume minimo possono essere adatti.
  2. Vitrify gli embrioni in una procedura di addizione in due fasi:
    1. Collocare gli embrioni per 2 minuti in una soluzione equilibrando costituita da glicole etilenico al 10% (v/v) e 10% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
    2. Spostare gli embrioni (dal punto 2.2.1) per 1 minuto in soluzione di vetrificazione costituita da glicole etilenico al 20% (v/v) e 20% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
  3. Caricare gli embrioni in un 125 μL di plastica ministraw (che contiene un terminale chiuso con un tappo di cotone e uno aperto estremo). Il processo viene schematizzato in Figura 3.
    1. Accoppiare l'estremità chiusa di 0,125 μL con il microdispenser appropriato (ad esempio Captroll III®).
    2. Aspirate BM fino a 1/3 della lunghezza della paglia, seguendo una piccola bolla d'aria.
    3. Aspirare gli embrioni in un volume di 40 μL di soluzione di vetrificazione, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
    4. Aspirate BM fino a quando la prima frazione liquida (Step 2.3.2) raggiunge il cotone.
    5. Chiudere l'estremità aperta con una spina di paglia.
  4. Eseguire il passaggio 2.2.2 mentre si sta facendo il passo 2,3 per garantire che non siano trascorsi più di un minuto, il che sarebbe tossico per gli embrioni.
  5. Immergere il ministraw direttamente in azoto liquido per ottenere la vetrificazione.
  6. Conservare il ministero in un Dewar per l'azoto per il tempo desiderato.
  7. Scongelare gli embrioni in un unico passaggio.
    1. Posizionare il ministraw orizzontalmente di 10 cm dal vapore di azoto liquido per 20-30 s.
    2. Quando il processo di cristallizzazione inizia all'interno del ministraw, immergere il ministero in un bagno d'acqua a 25 ° c per 10-15 s.
    3. Togliere la spina del ministero e tagliare il tappo di cotone.
    4. Con un microdispenser accoppiato, espellere tutto il contenuto di ministrazione in una piastra contenente 0,33 M di saccarosio in soluzione a 25 ° c in BM per 5 minuti.
      Nota: questo passaggio deve essere fatto rapidamente per ridurre l'esposizione embrionale alla soluzione di vetrificazione.
    5. Spostare gli embrioni in una nuova lastra contenente la soluzione BM per altri 5 min.
    6. Si consideri solo embrioni non danneggiati (con pelo di mucina intatto e zona pellucida) per continuare con l'ET.
      Nota: prendere in considerazione che negli embrioni scongelati, i trasferimenti asincroni (ad esempio, 60-62 h nei trasferimenti di morula) possono migliorare i risultati consentendo una risincronizzazione tra l'embrione e l'endometrio materno.

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Figura 3: schematizzazione della paglia caricata correttamente. A) BM si riferisce al mezzo di manipolazione dell'embrione impiegato durante la vetrificazione. Gli embrioni devono essere caricati in soluzione di vetrificazione. B) aspetto macroscopico della paglia caricata con un dettaglio ingrandito della posizione embrionale. Questo dispositivo di grande volume ci permette di vitrifichiamo grande numero di embrioni, a differenza dei dispositivi di volume minimo. Inoltre, la manipolazione di questo dispositivo è più facile rispetto ai dispositivi di volume minimo, mentre i risultati sono simili nei conigli41. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Risultati

Il trasferimento laparoscopico minimamente invasivo di embrioni freschi o vetrificati pone il coniglio tra i migliori modelli di animali per gli studi riproduttivi. La tabella 1 Mostra i risultati dell'et fresco in diverse fasi evolutive (Figura 4) degli embrioni trasferiti. Il tasso di sopravvivenza alla nascita (percentuale di embrioni risultanti in un cucciolo) ha dimostrato l'efficacia della tecnica laparoscopica descritta in questo docum...

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Discussione

Dal primo caso documentato di nascita dal vivo degli embrioni trasferiti9, questa tecnica e le specie di coniglio sono diventate cruciali negli studi sulla riproduzione. Inoltre, gli studi di ricerca sull'embrione che coinvolgono manipolazione, produzione, crioconservazione, ecc. richiedono come ultimo passo la valutazione della capacità embrionale per generare una progenie sana a pieno termine. Pertanto, la tecnica di trasferimento degli embrioni è indispensabile13

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Ministero dell'economia e della competitività della Spagna (AGL2017-85162-C2-1-R) e del programma di ricerca Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versione testuale inglese riveduta da N. MacOwan English Language Service

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovina (BSA)VWR332
Buprenorfina cloridratoAlvet Escartí626Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Buserelin AcetatoSigma AldrichB3303
Clorexidina digluconato saponeAlvet Escartí0265DCCJ500B
Soluzione di clorexidina digluconatoAlvet Escartí0265DCCA500B
CO2Air Liquide99921CO2 N48.
Incubatore a CO2Fisher scientific15385194
Dimetil SolfossidoSigma AldrichW387509
Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)Sigma AldrichD5773Senza cloruro di calcio.
Rasoio elettricoOster Golden A5078005-140-002
Telecamera per endoscopioOptomic Spain S.AOP-714
Trocar per endoscopio con valvola a foglietto in siliconeKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.30114GKModello di trocar leggero.
EnrofloxacinaAlvet Escartí9993046Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Ago epicraneo 23GAlvet Escartí514056353Si possono usare anche aghi più piccoli.
Catetere epiduraleVygon corporate187.10
Ago epiduraleVygon corporate187.10
Glicole etilenicoSigma Aldrich102466-M
Unguento per gli occhiAlvet Escartí5273
Ketamina cloridratoAlvet Escartí184Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Apparecchiature per laparoscopiaKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.26003 AAHopkins® Laparoscopio, laparoscopio a visione diritta da 0 mm, lunghezza 30 cm, canale di lavoro da 5 mm.
Sorgente luminosaOptomic Spain S.AFibrolux 250
Azoto liquidoAria LiquideP1505XXX
Insufflatore meccanico di CO2Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.Endoflatore®
MeloxicamAlvet Escartí9993501Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Piastre di Petri, 35 mmSigma AldrichCLS430165-500EA
Medicazione in plastica (Nobecutan)IBOR medica7140028
Cannuccia di plastica 0,25 mLIMV - tecnologie6431
Soluzione di ioduro di povidoneAlvet Escartí02656DPYS500S
ForbiciROBOZRS-5880Funzionerà qualsiasi normale forbice dritta piccola in acciaio di grado chirurgico.
Tubo in silicone per insufflatoreKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.
StereomicroscopioLeicaMZ16FCi sono opzioni più economiche come Leica MZ8 o Nikon SMZ-10 o SMZ-2B, solo per citarne alcune.
Guanti SteriliAlvet Escartí087GL010075
Camice sterileAlvet Escartí
Mascherina sterileAlvet Escartí058B15924B
Tappo a cannucciaIMV - tecnologie6431
Siringa SaccarosioSigma AldrichS7903
scientific117504251 ml
Fisher scientific117733135 mL
IMV - tecnologie17722
BagnomariaRAYPABAE-4
XilazinaAlvet Escartí525225Da ordinare da un veterinario autorizzato.
ConigliUniversitat Politó cnica de Val' nciaLinea A Possonoessere utilizzate altre linee materne, come la Linea V o la Linea HP.
2040004012261501, Siringa Fisher , Catetere urinario

Riferimenti

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214(2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13(2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587(2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27(2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661(2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).

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