Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell'embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l'uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.
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Articolo metodologico
Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs), come la coltura embrionale in vitro o la crioconservazione degli embrioni, influenzano i modelli di sviluppo naturale con conseguenze perinatale e postnatale. Per garantire l'innocuità delle applicazioni ART, sono necessari studi su modelli animali. Inoltre, come ultimo passo, gli studi sullo sviluppo degli embrioni richiedono una valutazione della loro capacità di sviluppare una progenie sana a lungo termine. Qui, il trasferimento dell'embrione nell'utero è indispensabile per eseguire qualsiasi esperimento correlato alle arti.
Il coniglio è stato usato come organismo modello per studiare la riproduzione dei mammiferi per oltre un secolo. Oltre alla sua vicinanza filogenetica alla specie umana e alle sue piccole dimensioni e ai bassi costi di manutenzione, ha importanti caratteristiche riproduttive come l'ovulazione indotta, una cronologia dello sviluppo embrionale precoce simile all'uomo e una breve gestazione che ci permettono di studiare facilmente le conseguenze dell'applicazione ART. Inoltre, le arti (come l'iniezione intracitoplasmatica dello sperma, la coltura embrionale o la crioconservazione) vengono applicate con un'adeguata efficienza in questa specie.
Utilizzando la tecnica di trasferimento dell'embrione laparoscopica e il protocollo di crioconservazione presentato in questo articolo, descriviamo 1) come trasferire gli embrioni attraverso una tecnica facile, minimamente invasiva e 2) un protocollo efficace per lo stoccaggio a lungo termine di coniglio per fornire capacità logistiche flessibili nel tempo e la capacità di trasportare il campione. I risultati ottenuti dopo il trasferimento di embrioni di coniglio in diverse fasi evolutive indicano che la morula è la fase ideale per il recupero e il trasferimento degli embrioni di coniglio. Pertanto, è necessario un trasferimento di embrioni oviductal, giustificando la procedura chirurgica. Inoltre, le morule di coniglio sono con successo vetrificata e laparoscopicamente trasferite, dimostrando l'efficacia delle tecniche descritte.
Introduzione
Con l'obiettivo di bypassare l'infertilità umana o migliorare la diffusione del bestiame di alto valore genetico e preservare le risorse genetiche animali, una serie di tecniche denominate collettivamente tecnologie di riproduzione assistita, come la superovulazione, in fecondazione in vitro, coltura embrionale, o crioconservazione, sono stati sviluppati1,2. Attualmente, vengono somministrati trattamenti ormonali per stimolare le ovaie e produrre un gran numero di follicoli ovarici antrici1. Gli ovociti raccolti da questi follicoli possono essere maturati, fertilizzati e svilup....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali utilizzate in questo studio sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE CEE per gli esperimenti sugli animali e riviste e approvate dal comitato etico per la sperimentazione con gli animali dell'Universitat Politècnica de València, Spagna (codice di ricerca: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detiene un certificato di autorizzazione emesso dall'amministrazione governativa Valenciana per sperimentare sugli animali. XGD è autorizzata a sorvegliare in situ il benessere e la cura degli animali durante l'esperimento.
1. trasferimento degli embrioni
- Preparazione delle femmin....
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Risultati
Il trasferimento laparoscopico minimamente invasivo di embrioni freschi o vetrificati pone il coniglio tra i migliori modelli di animali per gli studi riproduttivi. La tabella 1 Mostra i risultati dell'et fresco in diverse fasi evolutive (Figura 4) degli embrioni trasferiti. Il tasso di sopravvivenza alla nascita (percentuale di embrioni risultanti in un cucciolo) ha dimostrato l'efficacia della tecnica laparoscopica descritta in questo docum.......
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Discussione
Dal primo caso documentato di nascita dal vivo degli embrioni trasferiti9, questa tecnica e le specie di coniglio sono diventate cruciali negli studi sulla riproduzione. Inoltre, gli studi di ricerca sull'embrione che coinvolgono manipolazione, produzione, crioconservazione, ecc. richiedono come ultimo passo la valutazione della capacità embrionale per generare una progenie sana a pieno termine. Pertanto, la tecnica di trasferimento degli embrioni è indispensabile13
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Ministero dell'economia e della competitività della Spagna (AGL2017-85162-C2-1-R) e del programma di ricerca Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versione testuale inglese riveduta da N. MacOwan English Language Service
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorfina cloridrato | Alvet Escartí | 626 | Da ordinare da un veterinario autorizzato. |
| Buserelin Acetato | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorexidina digluconato sapone | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Soluzione di clorexidina digluconato | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| Incubatore a CO2 | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimetil Solfossido | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Senza cloruro di calcio. |
| Rasoio elettrico | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Telecamera per endoscopio | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Trocar per endoscopio con valvola a foglietto in silicone | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | 30114GK | Modello di trocar leggero. |
| Enrofloxacina | Alvet Escartí | 9993046 | Da ordinare da un veterinario autorizzato. |
| Ago epicraneo 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Si possono usare anche aghi più piccoli. |
| Catetere epidurale | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ago epidurale | Vygon corporate | 187.10 | |
| Glicole etilenico | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Unguento per gli occhi | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamina cloridrato | Alvet Escartí | 184 | Da ordinare da un veterinario autorizzato. |
| Apparecchiature per laparoscopia | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscopio, laparoscopio a visione diritta da 0 mm, lunghezza 30 cm, canale di lavoro da 5 mm. |
| Sorgente luminosa | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Azoto liquido | Aria Liquide | P1505XXX | |
| Insufflatore meccanico di CO2 | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | Endoflatore® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | Da ordinare da un veterinario autorizzato. |
| Piastre di Petri, 35 mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Medicazione in plastica (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Cannuccia di plastica 0,25 mL | IMV - tecnologie | 6431 | |
| Soluzione di ioduro di povidone | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Forbici | ROBOZ | RS-5880 | Funzionerà qualsiasi normale forbice dritta piccola in acciaio di grado chirurgico. |
| Tubo in silicone per insufflatore | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | ||
| Stereomicroscopio | Leica | MZ16F | Ci sono opzioni più economiche come Leica MZ8 o Nikon SMZ-10 o SMZ-2B, solo per citarne alcune. |
| Guanti Sterili | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Camice sterile | Alvet Escartí | ||
| Mascherina sterile | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Tappo a cannuccia | IMV - tecnologie | 6431 | |
| Siringa Saccarosio | Sigma Aldrich | S7903 | |
| scientific | 11750425 | 1 ml | |
| Fisher scientific | 11773313 | 5 mL | |
| IMV - tecnologie | 17722 | ||
| Bagnomaria | RAYPA | BAE-4 | |
| Xilazina | Alvet Escartí | 525225 | Da ordinare da un veterinario autorizzato. |
| Conigli | Universitat Politó cnica de Val' ncia | Linea A Possono | essere utilizzate altre linee materne, come la Linea V o la Linea HP. |
Riferimenti
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S.
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Ristampe e permessi
