Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Con l'obiettivo di bypassare l'infertilità umana o migliorare la diffusione del bestiame di alto valore genetico e preservare le risorse genetiche animali, una serie di tecniche denominate collettivamente tecnologie di riproduzione assistita, come la superovulazione, in fecondazione in vitro, coltura embrionale, o crioconservazione, sono stati sviluppati^1,2. Attualmente, vengono somministrati trattamenti ormonali per stimolare le ovaie e produrre un gran numero di follicoli ovarici antrici¹. Gli ovociti raccolti da questi follicoli possono essere maturati, fertilizzati e sviluppati in vitro fino a quando non sono criopriservati o trasferiti alle madri surrogato³. Tuttavia, durante questi trattamenti, gameti e zigoti sono esposti a una serie di processi non fisiologici che potrebbero richiedere l'adattamento dell'embrione per sopravvivere in queste condizioni^4,5. Questo adattamento è possibile a causa della plasticità embrionale precoce, che consente cambiamenti embrionali nell'espressione genica e nella programmazione dello sviluppo⁶. Tuttavia, queste modifiche possono influenzare le fasi successive dello sviluppo embrionale fino all'età adulta, ed è ora ampiamente accettata che metodi, tempi, procedure di crioconservazione o condizioni di coltura mostrano risultati diversi sul destino dell'embrione^{7 , 8}. Pertanto, per chiarire gli effetti specifici indotti delle arti, l'uso di modelli animali ben caratterizzati è inevitabile.

La prima nascita documentata dal vivo risultante dal trasferimento di embrioni di mammiferi ha avuto luogo nel 1890⁹. Oggi, il trasferimento di embrioni (ET) a una femmina surrogata è un passo cruciale nello studio degli effetti indotti dall'arte durante il preimpianto nelle successive fasi di sviluppo dell'embrione¹⁰. Le tecniche ET dipendono dalle dimensioni e dalla struttura anatomica di ogni animale. Nel caso di modelli animali di grandi dimensioni, è stato possibile eseguire ET con tecniche di ET non chirurgiche transcervicali, ma in specie di dimensioni più ridotte la cateterizzazione della cervice è più complessa e le tecniche chirurgiche sono frequentemente utilizzate¹¹. Tuttavia, l'ET chirurgico può causare emorragie che potrebbero compromettere lo sviluppo dell'impianto e dell'embrione, poiché il sangue può invadere il lume uterino, causando la morte embrionale¹⁰. Le tecniche di et non chirurgiche transcervicali sono ancora applicate in esseri umani, babooni, bovini, suini e topi^{12,13,14,15,16,17}, ma chirurgico Gli ETS sono ancora utilizzati in specie come capre, ovini o altri animali che presentano ulteriori difficoltà^{10,18,19,20,21}, come i conigli (due indipendenti) o topi (di piccole dimensioni). Tuttavia, i metodi di trasferimento chirurgico tendono ad essere gradualmente sostituiti da metodi meno invasivi. L'endoscopia è stata utilizzata per trasferire embrioni, ad esempio, in conigli, suini e piccoli ruminanti^18,19,20. Questi metodi endoscopici minimamente invasivi possono essere utilizzati per trasferire embrioni nell'Anulla attraverso l'infundibulum, che è essenziale nei conigli e ha dimostrato effetti benefici in alcune specie²⁰. Ciò si basa sull'importanza del corretto dialogo tra embrione e madre durante i primi stadi embrionali nell'ovidotto. Come accennato in precedenza, il rimodellamento embrionale che si svolge nei conigli durante la migrazione embrionale attraverso l'ovidotto è essenziale per ottenere embrioni in grado di impiantare^22,23.

Modelli animali di dimensioni maggiori, come i bovini, sono interessanti perché le caratteristiche biochimiche e preimpiantanti sono simili a quelle della specie umana²⁴. Tuttavia, gli animali di grandi dimensioni sono troppo costosi da usare nelle prove preliminari, e i roditori sono considerati un modello ideale (76 gli organismi modello% sono roditori) per la ricerca di laboratorio²⁵. Tuttavia, il modello di coniglio fornisce alcuni vantaggi rispetto ai roditori negli studi sulla riproduzione, poiché alcuni processi biologici riproduttivi esposti dagli esseri umani sono più simili nei conigli rispetto a quelli nei topi. L'uomo e i conigli presentano un'attivazione del genoma embrionale cronologico simile, la gastrulazione e la struttura della placenta hemochorial. Inoltre, utilizzando conigli è possibile conoscere l'esatta tempistica di fecondazione e fasi di gravidanza a causa della loro ovulazione indotta²⁵. I cicli di vita dei conigli sono brevi, completando la gestazione in 31 giorni e raggiungendo la pubertà a circa 4-5 mesi; l'animale è facile da maneggiare grazie al suo comportamento docile e non aggressivo, e il suo mantenimento è molto economico rispetto alle spese degli animali più grandi. Inoltre, è fondamentale ricordare che i conigli hanno un utero duplex con due cervidi indipendenti^11,25. Questo colloca il coniglio in una posizione preferenziale, poiché gli embrioni provenienti dai diversi gruppi sperimentali possono essere trasferiti nello stesso animale, ma in un altro corno uterino. Questo ci permette di confrontare entrambi gli effetti sperimentali, riducendo il fattore materno dai risultati.

Oggi, i metodi ET non chirurgici non sono in uso nel coniglio. Alcuni studi condotti alla fine degli anni '90 utilizzando una tecnica transcervicale hanno portato a bassi tassi di consegna che vanno da 5,5% a 20,0%^11,26 contro 50-65% con metodi chirurgici, tra cui la procedura di laparoscopia descritta da Besenfelder e Brem¹⁸. I bassi tassi di successo di questi metodi ET non chirurgici nei conigli coincidono con la mancanza del necessario rimodellamento dell'embrione nell'ovidotto, che viene evitato nell'ET transcervicale. Qui, descriviamo un'efficace procedura laparoscopica ET minimamente invasiva utilizzando conigli come organismo modello. Questa tecnica fornisce un modello per ulteriori ricerche sulla riproduzione in animali di grandi dimensioni e umani.

Poiché i conigli hanno una finestra temporale particolarmente ristretta per l'impianto embrionale, l'ET in questa specie richiede un alto grado di sincronia tra la fase evolutiva dell'embrione all'ET e lo stato fisiologico del ricevente²⁷. In alcuni casi, dopo un trattamento riproduttivo che rallenta lo sviluppo dell'embrione (come la coltura in vitro ) o altera la ricettività endometriale (come i trattamenti di superovulazione), non vi è alcuna sincronia tra l'embrione e l'utero materno. Queste situazioni possono influire negativamente sui risultati. Per rispondere in questi contesti, descriviamo un efficace protocollo di vitrificazione del coniglio morula che ci permette di mettere in pausa, organizzare e riprendere gli esperimenti. Questo processo è logisticamente auspicabile per gli studi sulla riproduzione e ci dà la capacità di stoccaggio a lungo termine di embrioni, permettendo il loro trasporto. La procedura laparoscopica e le strategie di criopriservazione consentono una migliore pianificazione degli studi con meno animali. Così, la nostra metodologia offre vantaggi igienici ed economici ed è conforme al concetto di 3Rs (sostituzione, riduzione e perfezionamento) della ricerca animale con l'obiettivo dichiarato di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento. Così, con questi metodi, i conigli costituiscono un organismo modello ideale per saggi riproduttivi in vivo .

Tutte le procedure sperimentali utilizzate in questo studio sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE CEE per gli esperimenti sugli animali e riviste e approvate dal comitato etico per la sperimentazione con gli animali dell'Universitat Politècnica de València, Spagna (codice di ricerca: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detiene un certificato di autorizzazione emesso dall'amministrazione governativa Valenciana per sperimentare sugli animali. XGD è autorizzata a sorvegliare in situ il benessere e la cura degli animali durante l'esperimento.

1. trasferimento degli embrioni

1. Preparazione delle femmine riceventi
   1. Utilizzare solo femmine sessualmente mature (> 4,5 mesi di età).
   2. Una settimana prima di ET, adattare le femmine a un regime di 16 ore di luce/8 h scuro per avviare la crescita follicolare e una maggiore ricettività femminile.
   3. Selezionare le femmine destinatarie, osservando la turgidità e il colore della vulva. Se la vulva è turgida e rossastra, la femmina è ricettiva.
   4. Indurre pseudogravidanza (ovulazione) da una singola iniezione intramuscolare di 1 μg di buserelin acetato (analogo sintetico dell'ormone di rilascio di gonadotropina) indipendentemente dal peso corporeo.
      Nota: normalmente, 0,8 μg è una dose adatta per l'induzione dell'ovulazione in conigli di medie dimensioni (4-5 kg), quindi 1 μg generalmente garantisce l'ovulazione.
   5. Indurre l'ovulazione come molti giorni prima dell'età degli embrioni da trasferire (ad esempio, 70-72 h dopo la morula fresca ET).
2. Anestesia e analgesia
   1. Pesare il coniglio e caricare i seguenti anestetici e analgesici.
      1. In una siringa da 1 ml con un ago 30g: carico xilazina (5mg/kg) e buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg). In un'altra siringa da 1 mL con un ago pericranico 23G, il carico di chetamina cloridrato (35 mg/kg).
   2. Tenga il coniglio e inietti la miscela di Xylazine-buprenorfina per via intramuscolare.
   3. Inserire l'ago pericranico con ketamina nella vena marginale dell'orecchio, introducendo lentamente tutti i contenuti della siringa per via endovenosa.
   4. Fissare l'ago e lasciarlo inserito in tutti i passaggi rimanenti per somministrare più anestesia, se necessario.
   5. Lasciare il coniglio nella gabbia (pulito e senza altri animali) su un palco caldo.
   6. Una volta incosciente, applicare l'unguento oculare per evitare la secchezza dell'occhio e controllare l'assenza del freflex palpebrale.
      Nota: questo protocollo fornisce un piano di anestesia chirurgico per un minimo di 30 min. Se è necessario un tempo più lungo, iniettare ulteriori dosaggi con la metà della quantità di chetamina cloridrato descritta in 1.2.1 dopo 30 min.
   7. Monitorare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del pedale e il movimento respiratorio. Cambiamenti nel modello di respirazione ad un tasso irregolare e più veloce indicano la perdita del piano corretto di anestesia.
   8. Monitorare il colore delle membrane mucose (occhi, labbra, ecc.), la frequenza respiratoria (30-60 respiratori al minuto), la frequenza cardiaca (120-325 battute al minuto) e la temperatura rettale (38-39,6 ° c).
   9. Otto ore prima del trasferimento, trattenere il cibo dagli animali per evitare la maggiore dimensione dell'intestino e l'attività fino a quando il processo ET è finito. Lasciare libero l'accesso all'acqua.
3. Preparazione embrionale
   1. Riscaldare il supporto di manipolazione dell'embrione a 25 ° c: base medium (BM), costituito da soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina.
   2. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, risciacquare gli embrioni freschi o scongelati (fase 2) con BM.
   3. Utilizzando guanti sterili, collegare un catetere epidurale 17G opportunamente configurato a una siringa da 1 mL.
   4. Aspirate 1 cm di BM nel catetere, seguita da una piccola bolla d'aria.
   5. Aspirare 5-7embrioni in un volume di 10 μL di BM, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
   6. Terminare il caricamento del catetere aspirando 1 cm di BM.
4. Trasferimento embrionale
   1. Si consideri l'uso di guanti sterili, abito e maschera per garantire un ambiente asettico.
   2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia, e pulirli con 70% etanolo.
   3. Eseguire l'anestesia come precedentemente dettagliato (passo 1,2), controllando la perdita di riflessi.
   4. Radersi la pelliccia dall'addome ventrale con un rasoio elettrico.
   5. Preparare l'addome ventrale in modo asettico.
      1. Pulire l'area chirurgica e rimuovere i peli residui. Lavare l'area chirurgica con un sapone gluconato di clorexidina. Disinfettare l'area con la soluzione di clorexidina ed etanolo 96 º (3 volte).
   6. Posizionare l'animale su un tavolo chirurgico caldo, nella posizione di Trendelenburg (testa in giù a 45 °) per garantire che lo stomaco e l'intestino si trovano cranialmente. Considerare l'evacuazione della vescica se è turgida. Se qualche visceri sono danneggiati nel processo, l'animale può morire. È quindi importante averli posizionati correttamente (Figura 1).
   7. Coprire l'area utilizzando un asciugamano sterile, con un foro (Fenestration) esponendo la zona rasata, per separare il sito chirurgico da eventuali aree contaminanti potenziali.
   8. Inserire un trocar endoscopico di 5 cm nella cavità addominale, 2 cm di caudale al processo xifoideo, e Insuflaggio attraverso di essa la cavità peritoneale con un insufflatore meccanico di regolazione della pressione.
      Nota: la pressione intra-addominale deve essere 8-12 mmHg con CO₂ (Figura 1a).
   9. Inserire la fotocamera dell'endoscopio attraverso il trocar endoscopico (Figura 1B).
      Nota: identificare il tratto riproduttivo, determinando lo stato e la posizione dell'infundibulum e dell'ampolla prima di et per facilitare i passi successivi.
   10. Inserire l'ago epidurale da 17 G nella regione inguinali tra 2-3 cm di profondità (Figura 1B).
   11. Identificare l'ingresso dell'infundibulum (Figura 2a, 2B).
   12. Inserire il catetere caricato (passo 1,3) attraverso l'ago epidurale nell'addome (Figura 1C).
   13. Individuare l'ovidotto e inserire 1-2 cm di catetere epidurale attraverso l'infundibulum nell'ampolla (Figura 2a-2C). Non progredire molto lontano nell'ovidotto per prevenire danni ed emorragie.
   14. Rilasciare gli embrioni nell'ovidotto premendo delicatamente lo stantuffo della siringa accoppiato al catetere (Figura 2D-2F). Entrambe le bolle d'aria devono uscire dal catetere.
   15. Rimuovere il catetere subito dopo che gli embrioni sono stati rilasciati.
   16. Sciacquare il catetere, aspirando e rilasciando il mezzo di manipolazione per verificare l'assenza degli embrioni e confermare il trasferimento di successo.
   17. Ripetere i passaggi 1.4.11 a 1.4.16 nell'altro lato dell'utero, se lo si desidera.
   18. Rimuovere l'ago epidurale e la fotocamera endoscopio.
   19. Rilasciare CO₂ attraverso il trocar endoscopico. Se il gas in eccesso rimane nell'addome dell'animale, avrà dolore e disagio.
   20. Rimuovere il trocar endoscopico dalla cavità addominale. Rimuovere l'asciugamano chirurgico.
   21. Interrompere l'anestesia.
   22. Pulire l'incisione fatta dal trocar con la soluzione di clorexidina. Chiudere l'incisione fatta dal trocar con un alluminio micronizzato e una medicazione in plastica.
5. Assistenza postoperatoria
   1. Trattare gli animali con antibiotici: 10 mg/kg di enrofloxacina, per via sottocutanea, ogni 24 ore per 5 giorni.
   2. Somministrare analgesici: buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg), intramuscolarmente, ogni 12 ore per 3 giorni; Meloxicam (0,2 mg/kg), per via sottocutanea, ogni 24 ore per 3 giorni.
   3. Monitorare gli animali per almeno 30 minuti dopo l'intervento chirurgico (a seconda dell'animale e la dose di anestesia utilizzata) assicurandosi che recuperano le loro condizioni fisiologiche.
   4. Identificare il destinatario (ad esempio, il tatuaggio dell'orecchio) e gli animali domestici singolarmente in una gabbia pulita con le condizioni ambientali appropriate.

Figura 1: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (Vista esterna). A) inserimento del trocar endoscopico (una porta). B) inserimento della telecamera endoscopica e dell'ago epidurale (freccia nera). C) inserimento del catetere di trasferimento embrionale (freccia bianca) attraverso l'ago epidurale. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (vista interna). A: Inserimento del catetere attraverso l'ago epidurale nella zona addominale. Asterisco indica l'infundibulum. B, C, D: Il catetere caricato con gli embrioni viene inserito nella regione dell'Anulla attraverso l'infundibulum. e, F: Rilascio degli embrioni, confermata dalla visualizzazione di un ovidotto gonfio. Questa cifra è stata adattata da Marco-Jiménez et al. ³⁸. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

2. vetrificazione e riscaldamento dell'embrione

1. Eseguire tutte le manipolazioni a temperatura ambiente (circa 22 ° c) per ridurre la tossicità della soluzione di vetrificazione a temperature più calde.
   Nota: gli embrioni possono essere spostati utilizzando la pipetta automatica 0.1-2 μL in questo protocollo, ma altri dispositivi simili per muovere gli embrioni trascinando il volume minimo possono essere adatti.
2. Vitrify gli embrioni in una procedura di addizione in due fasi:
   1. Collocare gli embrioni per 2 minuti in una soluzione equilibrando costituita da glicole etilenico al 10% (v/v) e 10% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
   2. Spostare gli embrioni (dal punto 2.2.1) per 1 minuto in soluzione di vetrificazione costituita da glicole etilenico al 20% (v/v) e 20% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
3. Caricare gli embrioni in un 125 μL di plastica ministraw (che contiene un terminale chiuso con un tappo di cotone e uno aperto estremo). Il processo viene schematizzato in Figura 3.
   1. Accoppiare l'estremità chiusa di 0,125 μL con il microdispenser appropriato (ad esempio Captroll III®).
   2. Aspirate BM fino a 1/3 della lunghezza della paglia, seguendo una piccola bolla d'aria.
   3. Aspirare gli embrioni in un volume di 40 μL di soluzione di vetrificazione, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
   4. Aspirate BM fino a quando la prima frazione liquida (Step 2.3.2) raggiunge il cotone.
   5. Chiudere l'estremità aperta con una spina di paglia.
4. Eseguire il passaggio 2.2.2 mentre si sta facendo il passo 2,3 per garantire che non siano trascorsi più di un minuto, il che sarebbe tossico per gli embrioni.
5. Immergere il ministraw direttamente in azoto liquido per ottenere la vetrificazione.
6. Conservare il ministero in un Dewar per l'azoto per il tempo desiderato.
7. Scongelare gli embrioni in un unico passaggio.
   1. Posizionare il ministraw orizzontalmente di 10 cm dal vapore di azoto liquido per 20-30 s.
   2. Quando il processo di cristallizzazione inizia all'interno del ministraw, immergere il ministero in un bagno d'acqua a 25 ° c per 10-15 s.
   3. Togliere la spina del ministero e tagliare il tappo di cotone.
   4. Con un microdispenser accoppiato, espellere tutto il contenuto di ministrazione in una piastra contenente 0,33 M di saccarosio in soluzione a 25 ° c in BM per 5 minuti.
      Nota: questo passaggio deve essere fatto rapidamente per ridurre l'esposizione embrionale alla soluzione di vetrificazione.
   5. Spostare gli embrioni in una nuova lastra contenente la soluzione BM per altri 5 min.
   6. Si consideri solo embrioni non danneggiati (con pelo di mucina intatto e zona pellucida) per continuare con l'ET.
      Nota: prendere in considerazione che negli embrioni scongelati, i trasferimenti asincroni (ad esempio, 60-62 h nei trasferimenti di morula) possono migliorare i risultati consentendo una risincronizzazione tra l'embrione e l'endometrio materno.

Figura 3: schematizzazione della paglia caricata correttamente. A) BM si riferisce al mezzo di manipolazione dell'embrione impiegato durante la vetrificazione. Gli embrioni devono essere caricati in soluzione di vetrificazione. B) aspetto macroscopico della paglia caricata con un dettaglio ingrandito della posizione embrionale. Questo dispositivo di grande volume ci permette di vitrifichiamo grande numero di embrioni, a differenza dei dispositivi di volume minimo. Inoltre, la manipolazione di questo dispositivo è più facile rispetto ai dispositivi di volume minimo, mentre i risultati sono simili nei conigli⁴¹. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Il trasferimento laparoscopico minimamente invasivo di embrioni freschi o vetrificati pone il coniglio tra i migliori modelli di animali per gli studi riproduttivi. La tabella 1 Mostra i risultati dell'et fresco in diverse fasi evolutive (Figura 4) degli embrioni trasferiti. Il tasso di sopravvivenza alla nascita (percentuale di embrioni risultanti in un cucciolo) ha dimostrato l'efficacia della tecnica laparoscopica descritta in questo documento. I valori più alti sono stati raggiunti quando l'ET è stato eseguito con embrioni nello stadio della morula, o morulae precoce o compatta. Sulla base di questi risultati, abbiamo eseguito un secondo esperimento per dimostrare il tasso di sopravvivenza dopo la vetrificazione di questi embrioni. Così, nella tabella 2 , mostriamo i risultati ottenuti dopo il trasferimento di morulae di coniglio vetrificato recuperate allo stesso tempo, differenziando tra quegli embrioni che avevano raggiunto un buon grado di compattazione o meno. Il tasso di sopravvivenza alla nascita era differente tra le diverse fasi embrionali, essendo più alto nelle morule compattate. Pertanto, il trasferimento di embrioni laparoscopici è una tecnica affidabile per trasferire embrioni freschi e vetrificati nei conigli

Figura 4: embrioni di coniglio. A) pronuclear. B) otto celle. C) morula precoce. D) Morula compatta. E) blastocisti. Asterisco indica i due pronuclei. Le frecce nere indicano la zona pellucida. Frecce bianche indicano il cappotto di mucina, che normalmente varia tra gli embrioni. ICM: massa cellulare interna. TE: Trophectoderm. Barra di scala: 50 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Efficienza del trasferimento di embrioni di coniglio fresco (in vivo derivato) da laparoscopia. 1embrioni diversi sono stati recuperati a 18-20h (pronuclear), 36-38H (8 cellule), 60-62 h (precoce morula), 70-72 h (Morula compatta) e 80-82 h (blastocisti) dopo l'accoppiamento. Le cellule compatte (> 32) e le morule non compatte (≈ 32) possono essere fondate a 70-72 h, ma solo le morule compatte sono state trasferite. 2 il Tasso di sopravvivenza alla nascita da ricevente incinta fa. a, b I valori con diversi superscript sono statisticamente diversi (P < 0,001).

Tabella 2. Vitalità di morula vetrificata non compattata vs compatta. i valori a, bcon diversi superscript sono statisticamente diversi (P < 0,001). 1 il Tasso di sopravvivenza alla nascita da ricevente incinta fa. Gli embrioni sono stati recuperati contemporaneamente (70-72 h) e sono stati distinti in cellule compatte (> 32) e morulae non compatte (≈ 32 celle).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.