Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Sommario

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Abstract

Mieloma multiplo (MM) tumori attecchire nel midollo osseo (BM) e la loro sopravvivenza e la progressione dipendono da complesse interazioni molecolari e cellulari che esistono all'interno di questo microambiente. Ancora il microambiente BM non può essere facilmente replicato in vitro, che potenzialmente limita la rilevanza fisiologica di molti modelli sperimentali in vitro ed ex vivo . Questi problemi possono essere superati utilizzando un modello di xenotrapianto in cui luciferasi (LUC)-cellule trasfettate 8226 MM saranno specificamente interdigitate nello scheletro del mouse. Quando questi topi sono dato il substrato appropriato, D-luciferina, gli effetti della terapia sulla crescita del tumore e la sopravvivenza può essere analizzata misurando i cambiamenti nelle immagini bioluminescenti (BLI) prodotto dai tumori in vivo. Questi dati BLI combinato con analisi di tomografia (PET/CT) emissione positronica tomografia/calcolo utilizzando l'indicatore metabolico 2-deoxy - 2-(¹⁸F) fluoro-D-glucosio (¹⁸F-FDG) è utilizzato per monitorare i cambiamenti nel metabolismo del tumore nel tempo. Queste piattaforme imaging consentono misurazioni non invasive più all'interno del microambiente del tumore/BM.

Introduzione

MM è una malattia incurabile costituita da plasma maligno B-cellule che infiltrano il BM e causare la distruzione dell'osso, l'anemia, insufficienza renale e infezione. MM rende fino al 10% - 15% di tutte le neoplasie ematologiche¹ ed è il cancro più frequente di coinvolgere lo scheletro². Lo sviluppo del MM deriva dalla trasformazione oncogena longeve delle cellule di plasma che vengono stabilite in centri germinali dei tessuti linfoidi prima alla fine homing al BM³. Il BM è caratterizzata da nicchie altamente eterogenei; tra cui componenti cellulari diversi e critici, regioni di basso pO₂ (ipossia), ricca vascolarizzazione, complesse matrici extracellulari e reti di citochine e fattori di crescita, che contribuiscono a MM dimostato⁴. Così, lo sviluppo di un modello di xenotrapianto MM diffuso caratterizzato da tumori che sono rigorosamente innestati in BM sarebbe uno strumento molto potente e clinicamente rilevante per lo studio MM patologia in vivo^5,6. Tuttavia, numerosi ostacoli tecnici possono limitare l'efficacia della maggior parte dei modelli dello xenotrapianto, che li rende costosi e difficili da applicare. Questo include problemi connessi con il engraftment coerenti e riproducibili del tumore all'interno della nicchia di BM, un tempo prolungato per lo sviluppo del tumore e le limitazioni nella capacità di direttamente osservare e misurare le variazioni della crescita del tumore/sopravvivenza senza dover sacrificio di topi nel corso dell'esperimento^7,8.

Questo protocollo utilizza un modello di xenotrapianto modificate che inizialmente è stato sviluppato da Miyakawa et al. ⁹, in cui una sfida per via endovenosa (IV) con cellule di mieloma si traduce in "diffusi" tumori che costantemente e riproducibile attecchire nei topi BM di NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG)¹⁰. La visualizzazione in situ di questi tumori è raggiunto mediante la trasfezione stabile della 8226 umano linea cellulare MM con un allele LUC e in serie misurano l'evoluzione della BLI prodotta da queste cellule di tumore engrafted⁶. D'importanza, questo modello può essere ampliato per utilizzare vari altri che esprimono LUC MM linee cellulari umane (ad es., U266 e OPM2) con una tendenza simile a specificamente interdigitate nello scheletro dei topi NOG. L'identificazione dei tumori da bioluminescenti imaging dei topi è seguita misurando la captazione del radiofarmaci sonde (ad esempio ¹⁸F-FDG) di PET/CT. insieme, in questo modo ulteriore caratterizzazione dei critici biochimico vie (cioè, le alterazioni nel metabolismo, cambiamenti in ipossia e l'induzione di apoptosi) all'interno del microambiente del tumore/BM. I principali punti di forza di questo modello può essere evidenziate dalla disponibilità di una vasta gamma di sonde radioattive, bioluminescenti e fluorescente e marcatori che possono essere usati per studiare la progressione MM e patologia in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure degli animali descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del sistema Greater Los Angeles VA sanitario e sono state eseguite in condizioni sterili ed esenti da patogeni.

1. preparazione di cellule che esprimono Luciferase 8226 (8226-LUC)

1. Mantenere la linea cellulare umana MM, 8226, in RPMI-1640 supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% di anidride carbonica (CO₂).
2. Generare cellule reporter 8226 LUC-esprimendo stabili di transfezione 1 x 10⁶ 8226 cellule con un vettore reporter luciferasi seguita da una selezione con igromicina (100-350 mg/mL) come precedentemente descritto⁶.
3. Mantenere le cellule in condizioni coltura sterile standard per 2-3 settimane, cambiando il mezzo ogni altro giorno, fino a quando l'istituzione di una linea cellulare 8226 stabilmente trasfettate è stato generato.
4. Confermare l'attività in vitro luciferasi in 1 x 10⁶ transfettate cellule/100 µ l di tampone fosfato salino (PBS) aggiungendo il substrato di luciferasi, D-luciferina (150 µ g/mL soluzione di lavoro nel terreno di coltura preriscaldato) e misurando la bioluminescenza delle cellule in una provetta o in piastra a 96 pozzetti utilizzando un luminometro⁶.

2. modello dello xenotrapianto Orthotopic

1. Mantenere i topi NOG (4-6 settimane vecchie, maschile o femminile) in condizioni sterili/patogeno-gratuito in una struttura appropriata cura degli animali.
2. Preparare i 8226 LUC-transfettati per iniezione IV in topi NOG (~ 5 x 10⁶ cellule/mouse) il giorno dell'esperimento. Lavare le cellule 3 x in PBS ghiacciata, contarli e li risospendere in PBS ghiacciata (meno antibiotici e FBS) ad una concentrazione finale di 5 x 10⁶ cellule/200 µ l di PBS) in una provetta sterile. Mantenere le cellule sul ghiaccio e sfidare i topi più presto (entro 30-120 min).
3. Anestetizzare il mouse (con isoflurano, 1% - 3% in aria a 0,5 - 1 L/min) e posizionare l'animale in posizione supina su una piastra elettrica con la testa rivolta verso via. Controllare il livello di amputate pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico agli occhi.
4. Iniettare le cellule 8226-LUC in topi tramite la vena di coda (200 µ l/iniezione) utilizzando una siringa da insulina 1 mL e un ago 26-G.
   Nota: Una lampada di calore può essere utilizzata per riscaldare la coda, quindi dilatare la vena e aumentando l'efficacia delle iniezioni.
5. Restituire l'animale alla loro gabbia e monitorare gli animali fino a quando non hanno pienamente recuperato.
6. Confermare il engraftment delle cellule 8226-LUC nello scheletro del mouse misurando la BLI in topi anestetizzati (descritto di seguito e illustrato nella Figura 1A).
   Nota: Gli essudati BM possono essere macchiati anche per espressione di CD45 umano mediante citometria a flusso (Figura 1B) o mediante immunoistochimica di osseo prelevato (Figura 1).

3. misurazione di BLI In Vivo

Nota: In genere, BLI misurabili da engrafted tumori in topi possono essere osservati prima tra postchallenge di 10-20 giorni, ma questo potrebbe essere necessario essere determinati sperimentalmente.

1. Anestetizzare il mouse (con isoflurano, 1% - 3% in aria a 0,5 - 1 L/min) e controllare il livello di amputate pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico ai suoi occhi.
2. Dare l'animale un'iniezione di IP (200 µ l/iniezione) di "in vivo-grade" substrato D-luciferina (30 mg/mL diluito in soluzione salina sterile).
3. Misurare la BLI entro 5-10 min, dopo l'iniezione del substrato luciferina (anche se l'attività BLI può essere osservabile nei topi per fino a 45-60 min), mettendo l'animale anestetizzato in posizione supina in un sistema di imaging di piccoli animali (Figura 2 ). Selezionare luminescenti e analisi dei raggi x e acquisire immagini (Figura 3).
   1. Misurare la radianza media (/steradian di fotoni/s/cm²) in determinate regioni di interesse (ROI) utilizzando software di imaging (Figura 4).
   2. Restituire l'animale alla sua gabbia e monitorarlo finché non ha recuperato completamente (circa 15-20 min).

4. trattamento dei topi con terapia mirata

1. Misurare la previsione BLI e randomize gli animali in gruppi di trattamento (4-8 topi/gruppo).
2. Trattare i topi con un'iniezione di IP (200 µ l/iniezione) di temsirolimus (0,2 - 40 mg/kg topo) usando un regime di cinque iniezioni giornaliere di IP seguita da 2 giorni di riposo e un ulteriori cinque iniezioni quotidiane¹¹.
3. Misurare l'attività luciferasica (/steradian di fotoni/s/cm²) 2 volte a settimana come descritto nella sezione 3 e trama la variazione del BLI nel tempo. Cambiamenti nel tumore BLI può essere presentato come immagini di serie dei topi (figura 5B).
   Nota: È consigliabile che il monitoraggio quotidiano degli animali essere eseguita fino a quando essi presentano i seguenti sintomi (in genere entro 45-60 giorni la sfida iniziale): peso perdita (perdita di oltre il 10% rispetto al peso prima dell'impianto) e/o posteriori paralisi degli arti, momento in cui essi dovrebbero essere euthanized utilizzando una camera di CO₂ seguita da dislocazione cervicale.

5. PET/CT analisi utilizzando ¹⁸F-FDG su misura cambia nel metabolismo del tumore

1. Veloce gli animali nella loro gabbia a casa togliendo loro cibo per 24 h prima dell'esperimento per evitare l'assorbimento di ¹⁸F-FDG in eccesso-non specifico.
2. Preparare ¹⁸sonde radiomarcate F FDG PET (50-100 µ ci/iniezione in soluzione fisiologica sterile) il giorno dell'esperimento. Registrare il tempo e l'attività della sonda ¹⁸F-FDG con un calibratore di dose.
   Nota: Perché ¹⁸F ha un'emivita relativamente breve (~ 2 h), è necessario stabilire una preparazione accurata e la pianificazione per l'utilizzo di queste sonde.
3. Anestetizzare l'animale (con isoflurano, 1% - 3% in aria a 0,5 - 1 L/min) e posizionarlo in posizione supina su una piastra elettrica con la testa rivolta verso via. Controllare il livello di amputate pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico ai suoi occhi.
4. Iniettare la sonda tramite vena caudale (100 µ l/iniezione) utilizzando una siringa da insulina schermato 1 mL e un ago 26-G.
   Nota: Una lampada di calore può essere utilizzata per riscaldare la coda, quindi dilatare la vena e aumentando l'efficacia delle iniezioni.
5. Misurare la radioattività residua in ago/siringa in un calibratore di dose e annotare l'attività e il tempo.
   Nota: La standardizzazione di incubazione del mouse, dosaggio e tempi è essenziale per assicurare la comparabilità e la riproducibilità dei dati.
6. Mantenere i topi sotto anestesia e a 37 ° C, con un rilievo di riscaldamento durante l'intero periodo dell'assorbimento della sonda (~ 45-90 minuti).
   Nota: È importante che i topi rimangono quiescenti e a 37 ° C per evitare l'assorbimento non specifico della sonda.
7. Scaglionare le iniezioni della sonda ¹⁸F-FDG si verificano a intervalli di circa 20 - 30 min per garantire tempi di etichettatura simili nei topi.
   Nota: Il corretto flusso di lavoro e la tempistica delle iniezioni sonda si tradurrà in condizioni ottimale e riproducibile imaging.
8. Misurare l'attività di ¹⁸F-FDG in un sistema imaging piccoli animali di PET/CT in determinate regioni di interesse che corrispondono ai tumori engrafted (Figura 6).
   Nota: Inizialmente, si consiglia un'esposizione di PET statica di 10 min e un'esposizione di CT 2 min, ma i tempi di esposizione esatta potrebbero essere necessario essere determinati sperimentalmente.
9. Restituire gli animali ai loro gabbie casa e monitorarli fino a completamente recuperato. Casa i topi in una sala dedicata di ritorno per 24 h, mentre i decadimenti di sonda ai livelli di fondo.
   Nota: A causa della breve emivita di ¹⁸F, misurazioni multiple usando una sonda fresca possono essere fatta con una frequenza 2 volte a settimana.

Risultati

Negli studi pilota iniziali, iniezioni IV delle cellule 8226-LUC in topi NOD/SCID non hanno sviluppato i tumori BM-engrafted MM, anche se squamose MM tumori erano facilmente formati (100% tasso di successo). Al contrario, sfide IV con 8226 cellule nei topi NOG generato (nel raggio di 15-25 giorni) tumori nello scheletro (e soli raramente formati tumori nei tessuti muscolo-scheletrici, come il fegato o la milza). Poiché i tumori nello scheletro visivamente non potrebbero essere confermati ...

Discussione

Nonostante una varietà di modelli preclinici dello xenotrapianto di MM^6,9,11,12,13, la capacità di studiare le interazioni tumore/BM all'interno del microambiente BM rimane difficile ¹⁴. le tecniche qui descritte consentono il rapido e riproducibile engraftment delle cellule di tumori 8226-LUC nello scheletro dei topi NOG.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
8226 linea cellulare di mieloma umano	ATCC	CCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Topi (NOG)	Jackson Labs	5557
VivoGlo Luciferin substrato	Promega	P1041
Hypoxyprobe-1Kit	HPL	HP1-100
PE-CD45 (clone H130)	BD Biosciences	555483	Utilizzato per la citometria a flusso per identificare le cellule tumorali CD45+ umane nell'essudato BM
coniglio anti-umano CD45 (clone D3F8Q)	Segnalazione cellulare Tecnologia	70527	Anticorpo primario utilizzato per l'immunoistochimica dell'osso asportato
IgG di capra anti-coniglio (HRP coniugato)	ABCAM	ab205718	Anticorpo Seconday utilizzato per l'immunoistochimica dell'osso asportato
Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi	Promega	E1910
pGL4.5 Luciferasi Reporter vettore	Promega	E1310
IVIS Lumina XRMS In Sistema di imaging Vivo	Perkin Elmer
Sofie G8 Sistema di imaging PET/CT	Perkin Elmer

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