Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Summary

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Abstract

Il numero di nuovi farmaci identificati da tradizionale, schermi in vitro è scemato, riducendo il successo di questo approccio nella ricerca di nuove armi combattere la Resistenza multifarmaco. Questo ha portato alla conclusione che i ricercatori non solo la necessità di trovare nuovi farmaci, ma anche bisogno di sviluppare nuovi modi di trovare loro. Tra i candidati più promettenti metodi sono intero-organismo, in vivo dosaggi che uso alto-rendimento, fenotipica letture e ospita che vanno da Caenorhabditis elegans di Danio rerio. Questi host presentano parecchi vantaggi potenti, tra cui le riduzioni drammatiche in falsi positivi colpisce, come composti che sono tossici per l'ospite e/o biounavailable vengono in genere eliminati nella schermata iniziale, prima di seguire costosi fino.

Qui vi mostriamo come nostra analisi sono stato utilizzato per interrogare variazione host la ben documentata di c. elegans— patosistema come contributo liquido uccisione diPseudomonas aeruginosa . Inoltre dimostriamo diverse estensioni di questa tecnica ben lavorata fuori. Per esempio, siamo in grado di svolgere high throughput genetiche schermate mediante RNAi in 24 o 96 pozzetti formati piastra di fattori dell'ospite query in questa interazione ospite-patogeno. Usando questa analisi, schermi intero genoma possono essere completati in pochi mesi, che possono di semplificare notevolmente il compito di individuare bersagli farmacologici, potenzialmente senza la necessità di approcci biochimici laboriosa purificazione.

Inoltre segnaliamo qui una variazione del nostro metodo che sostituisce il batterio gram-positivo Enterococcus faecalis per l'agente patogeno gram-negativo p. aeruginosa. Molto come è il caso per p. aeruginosa, uccisione di E. faecalis è dipendente dal tempo. A differenza del precedente c. elegans— saggi diE. faecalis , nostra analisi per E. faecalis non richiede preinfection, migliorando il suo profilo di sicurezza e riducendo le possibilità di contaminazione liquido-per la movimentazione. Il dosaggio è estremamente robusto, mostrando ~ 95% tassi di mortalità 96h post infezione.

Introduction

L'identificazione e lo sviluppo di efficaci antibiotici ad ampio spettro, ora quasi un secolo fa, ha portato a un momento di svolta nella sanità pubblica dove c'era una credenza diffusa che infettiva malattia sarebbe un flagello del passato. Entro pochi decenni, questo ottimismo iniziò a scemare, come agente patogeno dopo agente patogeno ha sviluppato meccanismi di resistenza che limitato questi trattamenti una volta miracolosi. Per qualche tempo, la corsa agli armamenti tra azioni di individuazione di droga e gli agenti patogeni sembrava equilibrata. Tuttavia, l'uso improprio degli antimicrobici è recentemente culminato nell'emergere di ceppi di Klebsiella pneumo....

Protocol

Attenzione: P. aeruginosa ed E. faecalis sono patogeni di livello 2 di biosicurezza, e precauzioni appropriate devono essere prese per prevenire l'infezione accidentale e per minimizzare la contaminazione delle superfici. Tutti i supporti e i materiali che vengono a contatto con agenti patogeni devono essere sterilizzati e/o scartati. Ulteriori linee guida sono disponibili dalla pubblicazione CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5a edizione.

1. preparazione e manutenzione di p. aeruginosa

1. Striscia p. aeruginosa da azione congelate su una piastra di agar LB (brodo ....

Results

Parametri importanti per le prestazioni

Una corretta comprensione della biologia alla base di questa analisi è necessaria per risolvere i problemi e ottimizzare il dosaggio. A tal fine, ci riferiamo in primo luogo a parecchie carte chiave delucidamento dei meccanismi di patogenesi di p. aeruginosa-mediata uccidendo in liquido^7,20. Condizione che i passa.......

Discussion

Questo saggio (o simili saggi dove altri agenti patogeni vengono sostituiti con p. aeruginosa o E. faecalis) sono utile per una varietà di scopi, tra cui la scoperta di nuovi farmaci. È anche utile per affrontare questioni biologiche fondamentali, come identificare i fattori di virulenza, la delucidazione dei meccanismi di difesa ospite e determinare il regolamentazione macchinari coinvolti nell'interazione ospite-patogeno.

Anche se il dosaggio di uccisione liquido p. aer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica Citometro		flusso per oggetti di grandi dimensioni/selezionatore di vermi
Cytation 5	BioTek
EL406 Dispenser di rondelle	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Blocco RB a pozzetti profondi	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Piastra a 384 pozzetti	Greiner Bio-One	MPG-781091
Terreno di coltura per nematodi (NGM)			Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 2,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 mL di tampone fosfato e 973 mL di
piastre			Slow Killing (SK) d'acqua milli-QQuantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 ml di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di terreno
coltura			Quantità per litro: 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di
acqua Brodo di lisogenesi (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
			di candeggina per vermiQuantità per 100 ml: 10 ml di soluzione di NaOH 5 M, 20 ml di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e 70 ml di acqua sterile
S Quantità basale			per litro: 5,85 grammi di NaCl, 6 grammi di KH2PO4, 1 grammo di K2HPO4, e 1 litro di acqua milli-Q
Agar	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
Quantità di tampone			per litro: 132 mL di K2HPO4 (1M) e 868 mL di KH2PO4 (1M)
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
Soluzione di ipoclorito di sodio al 5%	BICCA	7495.5-32
Soluzione NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Macchia di acido nucleico arancione	Fisher Scientific	S11368
Ceppi batterici
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi esprime batteri (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)