Articolo metodologico

Espressione di proteine di fusione fluorescenti in macrofagi e cellule dendritiche derivate da midollo osseo Murine

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 ottobre 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo articolo, forniamo che un protocollo dettagliato per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti nel midollo osseo murino derivate macrofagi e cellule dendritiche. Il metodo si basa sulla trasduzione del midollo osseo progenitrici con retrovirali seguite da differenziazione in macrofagi e dendritiche cellule in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I macrofagi e le cellule dendritiche sono cellule cruciali che formano la prima linea di difesa contro agenti patogeni. Inoltre svolgono i ruoli importanti nell'inizio della risposta immunitaria adattativa. Lavoro sperimentale con queste cellule è piuttosto impegnativo. Loro abbondanza in organi e tessuti è relativamente basso. Di conseguenza, essi non possono essere isolati in gran numero. Essi sono anche difficili a transfect con costrutti di cDNA. Nel modello murino, questi problemi possono essere superati parzialmente da differenziazione in vitro da progenitori di midollo osseo in presenza di M-CSF per i macrofagi o GM-CSF per le cellule dendritiche. In questo modo, è possibile ottenere grandi quantità di queste cellule da pochissimi animali. Inoltre, progenitors del midollo osseo può essere trasdotte con i vettori retrovirali che trasportano cDNA costrutti durante le prime fasi di coltivazione prima della loro differenziazione in macrofagi e cellule dendritiche di derivazione midollare. Così, trasduzione retrovirale seguita da differenziazione in vitro può essere utilizzato per esprimere vari costrutti di cDNA in queste cellule. La capacità di esprimere proteine ectopici sostanzialmente amplia la gamma di esperimenti che possono essere eseguite su queste cellule, compreso formazione immagine di cellule vive di proteine fluorescenti, purificazioni di tandem per Interactoma analisi, analisi struttura-funzione, monitoraggio delle funzioni cellulari con biosensori e molti altri. In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato per la trasduzione retrovirale di macrofagi e cellule dendritiche del midollo osseo murino derivato con vettori codificanti per proteine fluorescente-etichettate. L'esempio di due proteine adattatrici, OPAL1 e PSTPIP2, dimostriamo la sua applicazione pratica in microscopia e citometria a flusso. Abbiamo anche discutere i vantaggi e le limitazioni di questo approccio.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule mieloidi rappresentano una parte indispensabile dei nostri meccanismi di difesa contro gli agenti patogeni. Essi sono in grado di eliminare rapidamente i microbi, come pure le cellule morte. Inoltre, sono anche coinvolti nella regolazione della riparazione e sviluppo del tessuto e nel mantenimento della omeostasi1,2,3. Tutte le cellule mieloidi differenziano dal comune dei progenitori mieloidi nel midollo osseo. Loro differenziazione in molti funzionalmente e morfologicamente distinti sottoinsiemi è in larga misura controllata da citochine e loro varie combinazioni4. I sottoinsiemi delle cellule mieloidi più intensamente studiati comprendono granulociti neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche. Difetti in una qualsiasi di queste popolazioni portare a conseguenze potenzialmente life-threatening e causa gravi disfunzioni del sistema immunitario negli esseri umani e topi1,2,3,5, 6.

A differenza dei granulociti neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche sono cellule residenti del tessuto e loro abbondanza negli organi immuni è relativamente basso. Di conseguenza, l'isolamento e la purificazione delle cellule dendritiche primarie e macrofagi per esperimenti che richiedono un gran numero di queste cellule è costoso e spesso impossibile. Per risolvere questo problema, sono stati sviluppati protocolli per ottenere grandi quantità di omogenei macrofagi o cellule dendritiche in vitro. Questi approcci sono basati sulla differenziazione delle cellule del midollo osseo murino in presenza di citochine: fattore distimolazione del macrofago (M-CSF) per i macrofagi e fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (GM-CSF) o Flt3 ligand per cellule dendritiche7,8,9,10,11,12. Le cellule generate da questo metodo sono comunemente descritti nella letteratura come derivato del midollo osseo macrofagi (BMDMs) e del midollo osseo derivato le cellule dendritiche (BMDCs). Essi hanno proprietà fisiologiche più in comune con primari macrofagi o cellule dendritiche rispetto con le corrispondenti linee cellulari. Un altro grande vantaggio è la possibilità di ottenere questi formano le cellule geneticamente modificate topi13. Studi di comparativo tra cellule wild-type e cellule derivate da topi geneticamente modificati sono spesso fondamentali per scoprire nuove funzioni dei geni o proteine di interesse.

Analisi della localizzazione subcellulare delle proteine in cellule viventi richiedono l'accoppiamento di un'etichetta fluorescente per la proteina di interesse in vivo. Questo è più comunemente ottenuto esprimendo il costrutto codificato geneticamente fusione composto da una proteina analizzata accoppiata (spesso tramite un linker breve) ad una proteina fluorescente (ad es., verde proteina fluorescente (GFP))14,15 , 16. l'espressione di proteine in cellule dendritiche o i macrofagi fluorescente è impegnativo. Queste cellule sono generalmente difficili a transfect dalle procedure standard di transfezione e le efficienze tendono ad essere molto bassa. Inoltre, la transfezione è transitoria, che genera stress cellulare e raggiunto intensità di fluorescenza potrebbe non essere sufficiente per microscopia17. Al fine di ottenere una frazione ragionevole di queste cellule con un sufficiente livello di espressione del transgene, l'infezione delle cellule progenitrici del midollo osseo con retrovirali vettori e loro successiva differenziazione in BMDMs o BMDCs è diventato un molto efficiente approccio. Ha permesso per l'analisi delle proteine di origine mieloide in ambiente nativo di cellulari, sia in uno stato stabile o durante i processi che sono critici per la risposta immunitaria quali la fagocitosi, la formazione della sinapsi immunologica o la migrazione. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'espressione stabile di fluorescente proteine di interesse nel midollo osseo murino derivato macrofagi e cellule dendritiche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di esperti sul benessere degli animali sperimentali dell'Istituto di genetica molecolare e dall'Accademia delle scienze della Repubblica Ceca.

1. preparazione dei reagenti

  1. Preparare il tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK). Aggiungere 4,145 g di NH4Cl e 0,5 g di KHCO3 a 500 mL di ddH2O, poi aggiungere 100 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e filtro-sterilizzare.
  2. Preparare la soluzione di polyethylenimine (PEI). Aggiungere 0,1 g di PEI a 90 mL di ddH2O. Continuando a mescolare, aggiungere 1 M HCl goccia a goccia fino a quando il pH è inferiore a 2.0. Mescolare per fino a 3 h fino a PEI è dissolto e poi regolare il pH a 7,2 con NaOH M 1. Regolare il volume a 100 mL con ddH2O e filtro-sterilizzare. Rendere le aliquote di 1 – 2 mL e conservare a-20 ° C.
    Nota: Dopo lo scongelamento, PEI può essere conservato a 4 ° C fino a 2 settimane ma non devono essere ricongelati.
  3. Preparare i surnatanti delle cellule contenenti M-CSF o GM-CSF. Questi surnatanti possono essere fatta in anticipo e conservati a-80 ° C. Per rendere questi surnatanti, crescere le cellule producenti citochina (J558 celle per GM-CSF 18 ) o CMG 14-12 per M-CSF 19in un 10cm di Petri in mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) alla confluenza. Quindi trasferire tutte le celle a 200 mL di media nel matraccio di cultura del tessuto di T150 e cultura per ulteriori 4 giorni su 5% CO237 ° C. Raccogliere il surnatante e il filtro nel filtro di sterilizzazione 0,2 µm. Rendere le aliquote e memorizzare questi a-80 ° C.
  4. Preparare 100 mL di terreno di coltura delle cellule: DMEM supplementato con 10% FBS inattivato di calore e cella surnatanti dalle cellule che secernono GM-CSF (per differenziazione BMDC) o M-CSF (per differenziazione BMDM).
    Nota: La quantità di citochine in questi surnatanti può variare e la concentrazione di lavoro deve essere determinata empiricamente. In genere, viene utilizzato 2 – 3% surnatante da linee cellulari produzione di GM-CSF (la concentrazione iniziale consigliata è 2%) o 5 – 10% surnatante da CMG 14 – 12 cellule producendo M-CSF (la concentrazione iniziale consigliata è del 10%). In alternativa, purificato commercialmente disponibile M-CSF a 10 ng/mL e GM-CSF a 20 ng/mL può essere utilizzato con risultati praticamente identiche alla citochina-contenente surnatanti, vale a dire., senza alcun effetto sul tasso di differenziazione, l'efficienza di infezione e localizzazione subcellulare di costrutti con tag EGFP. Antibiotici, compresa la penicillina G (100 UI/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), può essere utilizzati per la coltura cellulare in qualsiasi fase del protocollo, salvo indicazione contraria.

2. produzione di Retrovirus

Attenzione: Anche se i vettori retrovirali sono relativamente sicuri rispetto ad altri tipi di vettori virali, pongono ancora un potenziale rischio di sicurezza. Pertanto, è fondamentale per lavorare con la massima cura e adeguati dispositivi di protezione e a rispettare tutte le norme di sicurezza e requisiti legali per l'utilizzo di particelle virali.

  1. Piastra di una sospensione unicellulare di platino-Eco (Plat-E) cellule di imballaggio in un 10cm di Petri e coltivare in 15 mL di DMEM contenente 10% FBS fino a 50-60% confluenti (24 h). Le cellule devono crescere in un monostrato e non dovrebbero formare grumi nella cultura.
  2. Pipettare 20 µ g di costrutto retrovirale (ad es., il costrutto che esprimono la proteina fluorescente contrassegnata di interesse nel vettore pMSCV) e 10 µ g di pCL-Eco imballaggi vector20 in 1 mL di DMEM (senza siero e antibiotici) e mescolare delicatamente.
  3. Un secondo tubo, aggiungere 75 µ l di PEI in 1 mL di DMEM (senza siero e antibiotici). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (TA) e poi mescolare il contenuto di entrambi i tubi e incubare per altri 10 min a TA.
    Nota: Aggiunta di pCL-Eco è facoltativa. Si è la codifica per il recettore virale ecotropic e può aumentare il titolo del virus.
  4. Sostituire con attenzione il mezzo sulle cellule di Plat-E con 8 mL di DMEMsupplemented fresco con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso. Non usare antibiotici durante la transfezione, dato che gli antibiotici possono ridurre l'efficienza di trasfezione.
  5. Con attenzione aggiungere (in gocce) la miscela preparata in Step 2.3 sulle cellule Plat-E e incubare per 4 h a 37 ° C.
  6. Dopo l'incubazione, scambiare il mezzo sulle cellule di Plat-E per 10 mL di pre-riscaldato DMEM contenente 10% FBS e coltivare le cellule per 24 h a 37 ° C. Durante questa incubazione, Plat-E celle produrrà virus nei mezzi.
  7. Dopo 24 h, raccogliere il supporto contenente particelle retrovirali da cellule di platino Eco utilizzando una pipetta 5ml e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 mL (= "surnatante 1" contenente particelle retrovirali ecotropic).
  8. Per evitare la contaminazione da cellule di Plat-E nel sovranatante virale, girare il virus raccolto a 1250 × g per 5 min a 4 ° C. Per ottenere risultati ottimali, il virus deve essere utilizzato immediatamente per l'infezione.
    Nota: Le aliquote di virus possono anche essere conservate a-80 ° C per un uso successivo. Tuttavia, risulta in certa riduzione nell'efficienza di trasduzione. Evitare congelamento/scongelamento ripetitivo del virus, poiché conduce alla degradazione di virus.
  9. Aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM con 10% FBS a Plat-E cellule e coltivare per altre 24 ore a 37 ° C.
  10. Ripetere i passaggi da 2,7. e 2,8. ottenere "surnatante 2".

3. isolamento delle cellule del midollo osseo murino

  1. Sacrificare il mouse tramite dislocazione cervicale o altro metodo approvato. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%.
  2. Utilizzando forbici e pinzette, rimuovere la pelle così come parte dei muscoli da zampe posteriori. Sloggiare attentamente l'acetabolo dall'anca senza rompere il femore. Tagliare la zampa nell'articolazione della caviglia. Spruzzare le ossa (femore collegato alla tibia) con etanolo al 70% e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta.
  3. Mettere le ossa in una capsula Petri 5cm contenente soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) 2% FBS (PBS-FBS).  Se preparando più ossa, tenere la capsula di Petri su ghiaccio fino all'elaborazione.
  4. Per garantire la sterilità di coltivazione, è necessario eseguire tutti i passaggi seguenti in una cappa di coltura del tessuto.
  5. Separare il femore dalla tibia senza rompere l'estremità dell'osso (curvatura del ginocchio congiunta e accuratamente tagliati con le forbici).
  6. Elaborare le ossa uno per uno. Tagliare una piccola parte dei epiphyses (circa 1 – 2 mm) con le forbici mentre si tiene l'osso a pinzette.
  7. Utilizzare un ago 30 G e un 2 o 5 mL siringa riempita con PBS-FBS per svuotare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità dell'osso in una provetta da centrifuga da 15 mL. Spostare l'ago all'interno dell'osso durante il lavaggio per rimuovere tutte le cellule. Se si ostruisce l'ago, cambiarlo.
    Nota: Le ossa dovrebbero girare dal rosso al bianco durante il lavaggio. Questo indica che la maggior parte delle cellule sono stati rimossi dall'osso. Utilizzare circa 2 – 3 mL di PBS-FBS per osso.
  8. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  9. Scartare il surnatante e lisare cellule rosse del sangue di risospendere il pellet in 2,5 mL di tampone ACK per 2 – 3 min a temperatura ambiente. Durante la lisi, filtrare le cellule del midollo osseo attraverso un colino di cella di 100 μm in un tubo di centrifughe fresche 15 mL. Ripristinare la tonicità aggiungendo 12 mL di PBS-FBS.
    Nota: Non superare i 5 min di Lisi ipotonica con buffer ACK per evitare la morte cellulare.
  10. Centrifugare immediatamente a 500 x g per 5 min a 4 ° C.

4. differenziazione delle cellule del midollo osseo nel midollo osseo derivato macrofagi

  1. Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo in DMEM completati con 10% FBS e antibiotici (vedere la nota dopo passo 1.4. per la concentrazione di antibiotica) e contare le celle. Per differenziazione in BM derivate macrofagi, piastra 5 – 10 x 106 di cellule del midollo osseo in un 10cm non-coltura del tessuto trattato Petri (batterica) con 10 mL di pre-preparati media DMEM con siero e M-CSF da passo 1.4.
    Nota: La resa di cellule del midollo osseo è circa 4 x 107 per 6 – 8 settimana-vecchio mouse C57BL/6J.
  2. Incubare le cellule in incubatrice della coltura cellulare per 3 giorni su 5% CO2, 37 ° C.
    Nota: Durante i primi 2 giorni, le cellule non sembrano molto vitale, come un gran numero di cellule apoptotiche è presente (cellule in grado di differenziarsi in cellule mieloidi e cellule terminalmente differenziate).
  3. Dopo 3 giorni, la coltura delle cellule del midollo osseo comincia a guardare vitale e si formano grappoli di divisione delle cellule. Le cellule aderenti prime possono già essere osservate. A questo punto, integrare le cellule con citochina fresca media.
  4. Aggiungere 10 mL di pre-riscaldati media DMEM con siero e M-CSF (da passo 1.4) in ogni 10 cm di Petri e restituirlo nell'incubatrice di coltura cellulare. Non c'è nessuna necessità di rimuovere i vecchi media durante questo passaggio.
    Nota: i macrofagi del midollo osseo sono completamente differenziati dopo 5 – 7 giorni nella cultura. Il momento migliore per la raccolta è a giorno 6 – 8, dove la maggior parte delle cellule sono aderenti e la capsula di Petri è completamente coperto.
  5. Giorno 5, tener di Petri il cofano di cultura delle cellule e inclinare il piatto fino a quando il supporto è quasi raggiungere il bordo del piatto. Rimuovere con attenzione, 15 mL di media dalla superficie vicino al bordo, e le cellule tendono a rimanere al centro del piatto. Aggiungere lo stesso volume di supporti pre-riscaldati con M-CSF e inserire nuovamente il piatto dell'incubatrice.
    Nota: Se il supporto è aspirato lentamente e con attenzione, quasi nessuna cellula vengono persa. Tuttavia, è anche possibile Centrifugare i media aspirati e aggiungere le celle torna alla cultura, per non garantire che nessun non-aderenti (cioè. non completamente differenziate) cellule vengono perse.
  6. Per gli esperimenti, sono utilizzate solo cellule aderenti (macrofagi). Per raccogliere le cellule, il giorno 6 o 7, rimuovere tutti i supporti e cellule galleggiante. Lavare il piatto una volta con PBS preriscaldata senza siero.
  7. Aggiungere 5 mL di EDTA 0.02% in PBS e incubare per 3 – 5 min a 37 ° C nell'incubatore di coltura del tessuto.
  8. Utilizzando una pipetta 5ml, rimuovere le cellule dal piatto di un flusso di PBS-EDTA e metterli in una provetta da centrifuga 50 mL con 25 mL di PBS. Se necessario, mettere insieme più piatti.
  9. Centrifugare immediatamente a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  10. Risospendere il pellet di macrofago in media DMEM e contare le celle. Verificare l'espressione di marcatori di superficie differenziazione dei macrofagi (CD11b e F4/80) tramite flusso cytometry.
  11. Per gli esperimenti che richiedono le cellule in sospensione, ad es., flusso cytometry esperimenti, qPCR o analisi western blot, utilizzare direttamente i macrofagi. Per gli esperimenti con i macrofagi aderenti, piastra le cellule nella piastra di coltura del tessuto secondo la messa a punto sperimentale.
  12. Le cellule sono già completamente differenziate. Tenerli nei mezzi adatti per l'esperimento previsto o nel supporto di crescita e differenziazione originale con M-CSF.
    Nota: Per lavorare con i macrofagi aderenti, trasferirli in una nuova piastra di almeno 6 ore prima dell'uso (idealmente durante la notte) per consentire la piena adesione alla superficie di nuova. La piccola frazione di cellule di galleggiamento può essere rimosso prima di esperimento.

5. midollo osseo differenziazione delle cellule nel midollo osseo derivato le cellule dendritiche

  1. Seguire il protocollo per BMDMs con regolazioni specifiche per BMDCs descritto sotto ai punti 5.2-5.4.
  2. Risospendere il pellet ottenuto delle cellule del midollo osseo in DMEMsupplemented con 10% FBS e antibiotici e contare le celle (dal seguente passaggio 4.1 del protocollo dei macrofagi). Per la differenziazione in cellule dendritiche, piastra 1 – 1,5 x 107 cellule di midollo osseo in un 10cm non-coltura del tessuto trattato (batterica) di Petri in 10 mL di pre-preparati media DMEM con siero e GM-CSF (da passo 1.4.).
  3. La stessa procedura di coltivazione come protocollo BMDM (passi 4.3 – 4.5. del protocollo dei macrofagi). Utilizzare supporti di DMEM con siero e GM-CSF invece di M-CSF. Poiché per BMDCs il tempo di coltivazione è più lungo (in genere 10-12 giorni), aggiungere le alimentazioni supplementari di 1 – 2 a intervalli di 3 giorni (da rimuovere il supernatante e l'aggiunta di un nuovo media di coltivazione come descritto in passaggio 4.5.).
  4. Questa parte del protocollo è praticamente la stessa come la corrispondente parte del protocollo del macrofago (passi 4.6 – 4,12. del protocollo dei macrofagi). Per gli esperimenti di utilizzare solo le cellule aderenti. Il giorno 10-12, raccogliere le cellule con EDTA, contare e impiattatelo su una nuova superficie. Verificare l'espressione di marcatori di superficie differenziazione delle cellule dendritiche (CD11c +, CD11b +, F4/80-) mediante citometria a flusso.

6. produzione di BMDMs e BMDCs che esprimono la proteina EGFP-tag di interesse

  1. Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo ottenuto nel passo 3.10. in DMEM completati con 10% FBS e antibiotici e contare le celle. Per l'infezione, utilizzare 2 – 5 x 106 delle cellule BM per pozzetto di una cultura di tessuto 6 pozzetti trattati piastra.
  2. Piastra le cellule in 1 mL di preparato media DMEM al bene, completate con M-CSF per differenziazione in BMDMs o con GM-CSF per la differenziazione nel BMDCs. mantenere le cellule per 4 – 6 h in un'incubatrice di coltura del tessuto con 5% CO2 a 37 ° C.
  3. Aggiungere 2 mL di virus appena raccolti ("surnatante 1") completati con polybrene (12 µ g/mL, concentrazione finale 8 µ g/mL dopo aggiunta alle cellule).
    Nota: Aliquota congelata del surnatante contenenti virus può anche essere utilizzato, ma l'efficacia sarà inferiore.
  4. Centrifugare la piastra a 1.250 x g per 90 min a 30 ° C (con lenta accelerazione e decelerazione). Quindi, incubare per 4 h con 5% CO2 a 37 ° C.
  5. Opzionale: Sostituire 2 mL di terreno di coltura fresco contenente media rispettiva citochina (M-CSF o GM-CSF) e la cultura con 5% CO2 a 37 ° C. Il secondo giorno, rimuovere 2 mL di terreno di coltura e ripetere la procedura intera infezione (passo 6.3-6.4) con 2 mL di virus appena raccolti ("surnatante 2").
    Nota: Questo passaggio potrebbe aumentare l'efficacia di infezione. Miglioramento dopo la seconda infezione dipende la proteina di destinazione e del tipo di cellula e nella nostra esperienza può variare da aumento del 30% in termini di efficienza a nessun miglioramento a tutti.
  6. Raccogliere le cellule non-aderenti, trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL e girare a 500 x g per 5 min (4 ° C). Scartare il surnatante.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura con M-CSF o GM-CSF, posizionare le cellule in un non-tessuto cultura trattata Petri 10cm e coltura a 37 ° C, 5% CO2. Numero ottimale di cellule per un piatto di 10 cm è di 5 – 10 x 106 per macrofagi derivati da BM e 10 – 15 x 106 per BM-derivato delle cellule dendritiche.
    Nota: Più piccoli piatti o piastre possono essere utilizzati, ma i numeri delle cellule devono essere regolati di conseguenza.
  8. Segui il macrofago e protocollo di coltivazione e la differenziazione delle cellule dendritiche descritto nel passaggio 4 e 5.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteine adattatrici segnalazione sono solitamente piccole proteine senza alcuna attività enzimatica. Essi possiedono vari domini di interazione o motivi, che mediano il grippaggio ad altre proteine coinvolte nella trasduzione del segnale, tra cui tirosin chinasi, fosfatasi, ubiquitin-ligasi e altri21. Per la dimostrazione delle funzionalità del presente protocollo sono stati selezionati adattatori delle cellule mieloidi, PSTPIP2 e OPAL1. PSTPIP2 è una proteina ben...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'espressione della proteina di interesse in cellule bersaglio è un passo fondamentale in molti tipi di studi biologici. Differenziate di macrofagi e cellule dendritiche sono difficili a transfect mediante transfezione standard e tecniche di trasduzione retrovirale. Bypassando la transfezione di queste cellule differenziate con retrovirali trasduzione di cellule progenitrici del midollo osseo, seguito da differenziazione quando portano già il costrutto desiderato, è un passo fondamentale che permette l'espressione dei cD...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da Ceca Science Foundation (GACR) (progetto numero 16-07425S), di Charles University Grant Agency (GAUK) (progetto numero 923116) e di finanziamento istituzionale da Istituto di genetica molecolare, Accademia delle scienze della Repubblica Ceca Repubblica (RVO 68378050).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Per la suplementazione dei fluidi
KHCO3Lachema, Brno, Repubblica CecaN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)A9434
PenicillinaBB Pharma AS, Praga, Repubblica CecaN/APENICILINA G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
StreptomicinaSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Streptomicina solfato sale in polvere
GentamicinaDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, Repubblica CecaN/A
Polietilenimmina, lineare, MW 25.000Polyscience, Warrington, PA, USA23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
PBSPreparato internamente dalla struttura multimediale di IMG ASCR, Praga, RepubblicaCecaN/A
APC anti-topo/umano CD11b Anticorpo, clone M1/70BioLegend (San Diego, CA, USA)101212analisi di citometria a flusso
PE anti-topo F4/80 Anticorpo, clone BM8BioLegend (San Diego, CA, USA)123110analisi di citometria a flusso
APC anti-topo CD11c Anticorpo, clone N418BioLegend (San Diego, CA, USA)117310analisi di citometria a flusso
M-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-02
GM-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAH1398utilizzo dell'analisi della citometria a flusso a 1-2 e micro; g/mL

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Macrofagi derivati dal midollo osseoProtocollo di trasduzione retroviraleAnalisi tramite citometria a flussoImaging microscopicoCellule di impacchettamento Platinum Eco packagingIsolamento del midollo osseoDifferenziamento con M CSFDifferenziamento con GM CSF

Articoli correlati