Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

Sommario

Un protocollo per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova di Ifnar1^{- / -} modello murino per l'infezione del virus (ZIKV) di Zika è descritto. Questo metodo è fondamentale per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi di vaccini ZIKV ed è inoltre utile per la loro valutazione di efficacia.

Abstract

Il virus di Zika (ZIKV) può indurre l'infiammazione in nuova organi (ad es., il cervello ed il testicolo), che conduce alla sindrome di Guillain-Barré e danneggiare i testicoli. Durante l'infezione con il ZIKV, le cellule immuni sono state indicate per infiltrarsi nei tessuti. Tuttavia, i meccanismi cellulari che definiscono la protezione e/o immunopatogenesi di queste cellule immunitarie durante un'infezione di ZIKV sono ancora in gran parte sconosciuti. Qui, descriviamo i metodi per valutare la funzionalità di T-cellule virus-specifici in questi organi di nuova dei topi infettati da ZIKV. Questi metodi includono un) un ZIKV infezione e l'inoculazione del vaccino nei topi di Ifnar1^{- / -} ; b) l'istopatologia, l'immunofluorescenza e le analisi immunohistochemistry per rilevare l'infezione del virus e l'infiammazione nel cervello, testicoli e milza; c) la preparazione di un tetramero di epitopi a cellula T ZIKV-derivati; d) la rilevazione delle cellule di T ZIKV-specifici in monociti isolati dal cervello, testicoli e milza. Utilizzando questi approcci, è possibile rilevare le cellule T antigene-specifiche che si sono infiltrati in organi nuova e per valutare le funzioni di queste cellule di T durante l'infezione: potenziale protezione immunitaria tramite virus liquidazione e immunopatogenesi/o esacerbare l'infiammazione. Questi risultati possono anche contribuire a chiarire il contributo delle cellule di T indotta tramite l'immunizzazione contro ZIKV.

Introduzione

Il ZIKV è un flavivirus trasmesse dalle zanzare che in primo luogo è stato isolato nel 1947 in Uganda da un macaco rhesus febbrile. Recentemente, il ZIKV è diventato un'emergenza di sanità pubblica, a causa della sua rapida diffusione nelle Americhe e il suo legame inaspettato con microcefalia e sindrome di Guillain-Barré^1,2,3. Da dati epidemiologici, la ZIKV è stata sospettata di essere la causa della sindrome di Guillain-Barré in circa 1 caso ogni 4.000 infetti adulti⁴. Inoltre, è stata dimostrata una correlazione tra la ZIKV e testicoli infezione/danni nel modello del topo, suggerendo che l'infezione di ZIKV, in determinate circostanze, può bypassare la barriera ematotesticolare e portare alla sterilità maschile⁵ . Questi risultati evidenziano l'importanza di comprendere completamente l'induzione delle risposte immunitarie protettive o patologiche durante un'infezione ZIKV.

Molto resta ancora essere imparato a conoscere le risposte immunitarie cellulari per il ZIKV. CD4⁺ e CD8⁺ T-cell responses to il capside, busta e non strutturali della proteina 1 (NS1) sono stati osservati in ZIKV-infettati scimmie e gli esseri umani^6,7,8. Nei topi, parecchi studi hanno indicato che CD8⁺ T cellule svolgono un ruolo protettivo nel controllare il ZIKV replica^9,10,11. D'importanza, Jurado et al hanno dimostrato che un'infezione di ZIKV provoca la ripartizione della barriera sangue - cervello e infiltrazione perivascolare di CD8⁺ T effettrici all'interno dei testicoli di Ifnar1 topi^{- / -} . Inoltre, hanno mostrato che CD8⁺ T cellule istigare la paralisi ZIKV-collegato e sembrano svolgere un ruolo in immunopathology cervello neonatale. In uno studio precedente, abbiamo preparato il tetramero di_294-302 ZIKV-E e ha mostrato che CD8 specifici ZIKV⁺ T cellule esistono nei cervelli e midolli spinali dei topi^{- / -} ZIKV-infettati Ifnar1, che possono avere implicazioni importanti per la progettazione e lo sviluppo di vaccini ZIKV¹⁰.

In risposta all'urgente necessità per la vaccinazione prevenire l'infezione ZIKV, diversi vaccini sono nelle fasi precliniche di sviluppo, tra cui RNA vaccini, vaccini basati su vettori ricombinanti e vaccini a subunità della proteina purificata. Il vaccino di DNA del plasmide è in fase di test clinici 1¹². La valutazione della sicurezza ed efficacia dei vaccini ZIKV è, quindi, importante. Uno dei vantaggi dei vaccini è la loro capacità di suscitare risposte a cellula T specifiche, che possono essere importanti per la protezione contro il ZIKV. Utilizzando tetrameri correlate a epitopo T-cellulare ZIKV-derivata, il immunoreactivity di cellula T indotto da un vaccino contro l'adenovirus-vector-based ZIKV potrebbe essere individuato in topi immunizzati e glicoproteine sia M che E sono stati indicati per indurre robusto antigene-specifiche CD8⁺ T-cellula immunoreactivity¹³.

Durante un'infezione del virus, il riconoscimento degli antigeni del peptide presentato da molecole (MHC) complesse di istocompatibilità per T-cell receptor (TCR) è un importante meccanismo di T-cellula-mediata per proteggere l' host¹⁴. Basato su questa teoria, tecnologia tetramero è uno strumento unico per delucidare i ruoli che cellule T antigene-specifiche giocano nel regolare le risposte immunitarie¹⁵. Questo protocollo descrive l'istituzione del modello Ifnar1^{- / -} mouse per le infezioni ZIKV e la rilevazione delle cellule T reattive in milza, cervello e testicoli dei topi utilizzando tecnologia tetramero. Inoltre, abbiamo utilizzato il tetramero di_294-302 ZIKV-E per rilevare e valutare il immunoreactivity cellula T indotto da un vaccino ZIKV (AdC7-M/E) in topi immunizzati. Questo studio fornisce una guida per lo studio di risposte a cellula T in organi di nuova e fornisce un riferimento per le potenziali applicazioni nella placenta o cervello fetale.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e Comitato dell'Istituto nazionale di uso per Viral Disease Control and Prevention, CDC di Cina. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istituzionali Animal Care e approvato dal comitato di uso animale protocolli.

1. virus infezione

1. Tenere adulto (6-8 settimana-vecchio) Ifnar1^{- / -} (50% uomini e 50% donne) topi/in speciali esenti da patogeni (SPF) condizioni standard e consentire loro di regolare accesso a cibo e acqua.
2. Infettare i topi di Ifnar1^{- / -} con il ZIKV tramite un'inoculazione di retro-orbitale di 100 µ l di ZIKV in un tampone fosfato salino (PBS) tampone 1 x 10⁴ fuoco-unità formanti (FF) del virus. Analogamente, è possibile fornire i topi di controllo con un volume uguale di PBS.
   Attenzione: Infettare i topi in condizioni ABSL2 ed eseguire queste procedure con topi infettati da virus nella cappa di biosicurezza.
3. Monitorare il peso e segni clinici (tremori, marzo sfalsato, bilaterali dell'arto flaccido) dei topi al giorno per 15 giorni.

2. immunizzazione con il vaccino ZIKV

1. Utilizzare Ifnar1^{- / -} (50% uomini e 50% donne) topi/tra 6 e 8 settimane di età. Tenere i topi in condizioni standard di SPF di 18 – 29 ° C e un ciclo luce/buio di 12 h con accesso a cibo e acqua.
2. Immunizzare i topi di Ifnar1^{- / -} con il vaccino ZIKV: iniettare 100 µ l di AdC7-M/E [4 x 10¹⁰ (particelle di virus)] in PBS buffer tramite un'iniezione intramuscolare (i.m. percorso) utilizzando una siringa da 1 mL con ago 23-G.
3. Allo stesso modo, è possibile iniettare topi di controllo con un volume uguale di PBS.

3. isolamento dei monociti dalla milza

Nota: L'isolamento dei monociti dalla milza è descritto come accennato in precedenza¹⁶.

1. Anestetizzare post-l'inoculazione 7D topi immunizzati e affetti da ZIKV, utilizzando un 5% isoflurane concentrazione 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%.
   Attenzione: da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in modo asettico in una cappa di biosicurezza.
2. Usando gli aghi, bloccare gli arti dei topi (eutanasizzati, precedentemente infettati/immunizzati) sulla piastra schiuma con l'addome rivolto verso l'alto.
3. Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace con un bisturi sterile, tagliare i muscoli addominali con le forbici, esporre la cavità addominale e rimuovere delicatamente il fegato.
   Nota: L'organo lungo, rosso scuro a sinistra dello stomaco è la milza.
4. Rimuovere la milza, risciacquarla 3x in PBS per rimuovere qualsiasi sangue e posizionarlo in 1,5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute ghiacciata (RPMI). Mantenere la milza sul ghiaccio.
5. Per generare una sospensione unicellulare dalla milza, mettere il organ(s) su un colino di cella sterile 40 µm-mesh sulla cima di un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di gelida RPMI medium contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 mL, meccanicamente poltiglia il organ(s) e aggiungere il terreno fino a quando l'organo è stato completamente terreno attraverso la maglia.
6. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
7. Risospendere le cellule con 5 mL di un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) (NH₄Cl, Na₂EDTA e KHCO₃; cfr. la Tabella materiali) e incubare la reazione di Lisi a temperatura ambiente per 5 – 6 min.
8. Interrompere la lisi di RBC con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e centrifugare la provetta a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
9. Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo (RPMI con 10% vol/vol FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina). Trasferire 10 µ l di sospensione cellulare per un piccolo tubo, mescolare con 10 µ l di 0,4% wt/vol trypan blu e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro.

4. isolamento dei monociti dal cervello e testicoli

1. Anestetizzare post-l'inoculazione 7D topi maschi affetti da ZIKV, utilizzando 5% isofluranein 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%.
   Attenzione: Da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite asetticamente in una cappa di biosicurezza. L'isolamento dei monociti dal cervello e testicoli è descritto come accennato in precedenza¹⁷.
2. Immobilizzare un topo maschio (eutanasizzato, precedentemente infetto) in posizione prona su un tagliere.
3. Proteggere il cuoio capelluto con un forcipe 1x2 denti dritti e usare le forbici Iris per fare un'incisione del midline sul cuoio capelluto per esporre il cranio.
4. Fissare i due lati delle orbite con pinzette taglienti e difficoltà del cervello. Inserire una punta delle forbici taglienti di Iris il magnum di orifizio e tagliare lateralmente nel cranio. Ripetere questo passaggio per l'altro lato.
5. Uso forte Iris forbici per tagliare accuratamente dalla cavità stessa, fino alla linea mediana, verso il naso. Cercare di mantenere la fine delle forbici come superficiale possibile evitare di ferire il cervello.
6. Sollevare il cervello con il forcipe e utilizzare forbici affilate Iris per sezionare con cura le fibre del nervo cranico. Rimuovere il cervello con il forcipe e metterlo in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di medium RPMI/10% FBS ghiacciata.
7. Afferrare la pelle dell'addome con una pinza e utilizzare forbici affilate Iris per praticare un'incisione longitudinale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre la parte più bassa dell'addome. Spingere i testicoli fino all'incisione. Delicatamente tirare lo strato di grasso con le pinzette ed esporre un testicolo globulare su entrambi i lati.
8. Uso forte Iris forbici per sezionare con cura lo strato di grasso e l'epididimo. Posizionare i testicoli in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata con il forcipe.
9. Per generare una sospensione unicellulare dal cervello o testicoli, mettere l'organo su un filtro sterile cella con una mesh di 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata. Utilizzando lo stantuffo della siringa 5ml, schiacciate l'organo e aggiungere il terreno fino a quando l'organo è stato completamente terreno attraverso la maglia.
10. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
11. Risospendere le cellule con 5 mL di 30% densità gradiente medio e, quindi, aggiungerli molto lentamente a 2 mL di 70% medio gradiente di densità in una provetta da 15 mL.
12. Spegnere il freno e centrifugare le provette a 4 ° C a 800 x g per 30 min. Ottieni i linfociti dallo strato intermedio.
13. L'interfase di trasferimento in una nuova provetta 15 mL, aggiungere 10 mL di fluido freddo RPMI/10% FBS e centrifugare la provetta a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
14. Risospendere le cellule con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e li Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
15. Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo e contare il numero di cellule come descritto al punto 3.9.

5. tetramero preparazione

1. Plasmidi che esprimono domini extracellulari di H-2D^b con un tag di sito biotinilati il C-terminale del dominio α3 e il β₂m utilizzando il vettore di pET28a con un NdeI e XohI sito di restrizione¹⁸.
2. Express e preparare i corpi di inclusione di H-2D^b e β₂m come descritto in precedenza²⁰.
3. Rinaturazione e purificare il peptide/MHC complesso H-2D^b-E_294-302.
   1. Preparare 200 mL di una soluzione di refolding [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-Na, 5 GSG e 0,5 mM GSSG]. Aggiungere gli inibitori della proteasi: 2 mL di fenilmetilsufonilfluoruro (PMSF, magazzino 100 mM), 100 µ l di pepstatina (stock 2 mg/mL) e 100 µ l di leupeptina (stock 2 mg/mL). Raffreddare il buffer a 4 ° C per 30 min.
   2. Aggiungere alla soluzione refolding^bH-2D, β₂m e il peptide.
      1. Iniettare 500 µ l di β₂m disciolti in una soluzione di guanidina (30 mg/mL di brodo) utilizzando una siringa. Per questo, è necessario utilizzare un ago di 23 G con una siringa da 5 mL e iniettare il β₂m nella soluzione refolding goccia a goccia. Mantenere la soluzione costantemente e lentamente mescolando a 150 giri/min a 4 ° C.
      2. Dopo β₂m è stato dissolto nella soluzione di refolding, risolvere 2 mg di peptide di_294-302 E in 200 µ l di DMSO e iniettare velocemente nella soluzione di refolding utilizzando una pipetta. Mescolare lentamente la soluzione a 150 giri/min a 4 ° C per 15 min.
      3. Iniettare 1,5 mL di H-2D^b disciolti in una soluzione di guanidina. Mantenere la stir bar rotante a 150 giri/min per il ripiegamento del H-2D^b a 4 ° C per 8-10 h.
         Nota: La soluzione è stato disposto in una scatola chiusa in una stanza fredda.
   3. Concentrare la proteina ripiegata in una camera pressurizzata con una membrana di kDa 10. Scambiare il buffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] alla camera e concentrarlo in un volume finale di 30 – 50 mL.
   4. Trasferire la soluzione di refolding in una provetta da centrifuga e girarla a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C.
   5. Trasferire con cautela il supernatante a un filtro centrifugo di kDa 10 e concentrarlo ulteriormente ad un volume finale di 500 µ l a 2.500 x g per 30 min.
   6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e girarla a 12.000 x g per 15 min. purificare la proteina con S200 10/300 GL filtrazione cromatografia del gel.
   7. Raccogliere il picco di complessi MHC e concentrarlo in un volume finale di 350 µ l.
4. Per generare un volume di reazione di 500-µ l per biotinylation, aggiungere i reggenti nel seguente ordine: 100 µ l di soluzione A [0.5 m bicina (pH 8.3)], 100 µ l di soluzione B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 biotina µΜ), 100 µ l di supplementare d-biotina (biotina 500 µΜ) , 20 µ l di enzima BirA (60 µ g), 0,5 µ l di pepstatin (2 mg/mL) e 0,5 µ l di leupeptin (2 mg/mL). Incubare la provetta di reazione durante la notte a 4 ° C.
   Attenzione: Non aggiungere qualsiasi EDTA per la reazione di alchilanti.
5. Purificare il MHC utilizzando un S200 colonna di 10/300 GL gel filtrazione per rimuovere qualsiasi biotina supplementare.
6. Determinare l'efficienza di alchilanti con un dosaggio di streptavidina-shift¹⁸.
   1. Preparare tre campioni, A, B e C, il ghiaccio per 30 min. Quindi, analizzare i risultati di un 10% SDS-PAGE. Campione A è costituito da 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di buffer di scambio, campione B di 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e C di esempio di 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e 8 µ l di tampone di scambio.
      Attenzione: Non bollire il campione.
7. Formare dei multimeri delle molecole MHC biotinilato.
   1. Produrre tetramero mescolando il biotinilati E_294-302 peptide-H₂D^b complesso con streptavidina ficoeritrina-etichettati con un rapporto di mole di 1:5 per assicurare un legame completo di tutte le molecole di MHC biotinilato.
   2. Calcolare la quantità di coniugato streptavidina-necessario per tetramerization.
      1. Determinare le talpe dei complessi peptide/MHC contabilità per la concentrazione nella proteina e il peso molare (esempio: 1,8 mg di proteine totali = 40 nmol).
      2. Calcolare le talpe del streptavidina-coniugato necessario dividendo le talpe del MHC/peptide per 5 (esempio: 40/5 = 8 nmol di streptavidina-coniugato).
      3. Calcolare la quantità di streptavidina necessario (in µ g) a seconda lo streptavidina-coniugato (esempio: streptavidina-PE [300.000 g/M] → 8 nmol necessari = 2.400 g).
   3. Dividere streptavidina-ficoeritrina in 10 campioni. Aggiungere ciascun campione in una provetta contenente il biotinilati E_294-302 peptide-H₂D^b complesso, ad intervalli di 20 min. Dopo il caricamento dell'ultimo campione, incubare la provetta di reazione a 4 ° C durante la notte nel buio.
8. Applicare i reagenti multimerized in una provetta da centrifuga 100 kDa e concentrarlo mediante centrifugazione a 2.000 x g a 4 ° C per un volume di < 100 µ l.
9. Diluire il campione nel tubo spin da 4 mL con PBS (pH 8.0) e concentrarlo nuovamente a < 100 µ l.
10. Ripetere lo scambio di buffer passo in PBS (pH 8.0) 4x.
11. Riempire il volume totale nuovamente a 500 µ l utilizzo di PBS (pH 8.0). Concentrare il campione ad una concentrazione stimata di 2 – 2,5 mg/mL a 2.000 x g a 4 ° C. Conservare il campione al buio a 4 ° C.

6. flusso Cytometry

1. Incubare le sospensioni delle cellule (da passo 3.9 e/o passo 4,15) a 4 ° C con 0.1 µ l di Reagente Bloccante di CD16/CD32 Fc-recettore anti-murino a 20 µ l (fattore di diluizione 1: 200) per 10 min, per impedire qualsiasi legame aspecifici.
2. Centrifugare la provetta tetramero a 20.000 x g per almeno 15 min a 4 ° C.
3. Aggiungere 20 µ l di sospensione cellulare a un platecontaining 96 pozzetti 1 x 10⁶ cellule ciascun pozzetto.
4. Preparare un volume sufficiente del mix di tetramero E_294-302 a macchiare tutti i tubi sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questo mix al conto per errori di pipettaggio. Diluire i tetrameri di_294-302 E (2 mg/mL, 1 µ l/test) nel buffer di FACS (PBS, 0,5% FBS) affinché 20 µ l della miscela E_294-302 tetramero è aggiunto a ogni test.
5. Aggiungere 20 µ l della miscela tetramero E_294-302 per la piastra a 96 pozzetti. Entro la fine di questo passaggio, è opportuno che il volume finale in ciascun pozzetto 40 µL.Incubate la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 min.
6. Aggiungere gli anticorpi primari (coniugato FITC o APC-coniugato anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-coniugato anti-CD8 (0,2 mg/mL)) a 1 µ l/test alla sospensione di cellule e, quindi, viene quindi incubato a 4 ° C per 30 min al buio.
7. Lavare le cellule 2 x con 2 mL di tampone di FACS e centrifuga con attenzione li a 600 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 200 µ l di tampone di FACS.
8. Conservare i campioni temporaneamente a 4 ° C al buio fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
9. Utilizzare la seguente strategia di gating per l'analisi cytometric di flusso.
   1. Creare un cancello su camiciole diagonalmente cluster tracciando una zona di dispersione (SSC) forward scatter (FSC) contro laterale.
   2. Quindi, cancello il CD3 cellule di⁺ da side scatter (SSC) contro CD3; Successivamente, cancello il CD3⁺ CD8⁺ celle; Infine, contorni CD8^{+ +} tetramero cellule¹⁹.

7. istopatologia, immunofluorescenza e test immunoistochimico

1. Dosaggio di istopatologia
   1. Raccogliere i tessuti cerebrali e testicolo del ZIKV-infettati Ifnar1^{- / -} topi 7D post-inoculazione e fissarli in 4% neutra tamponata formaldeide.
      Attenzione: paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale.
   2. Incorporare il tessuto in paraffina.
   3. Sezione del tessuto a 5 mm utilizzando un vibratomo.
   4. Macchiare il tessuto con ematossilina ed eosina (H & E).
2. Test immunoistochimico
   1. Deparaffinizzare, reidratare e antigene-recuperare il tessuto sezioni, sulla base di procedure descritte precedentemente²¹.
   2. Trattare le sezioni di tessuto con 3% H₂O₂ in PBS (pH 7,6) per 10 min e bloccarli con 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 10 min.
   3. Incubare le sezioni di tessuto con anticorpo di topo anti-topo CD3 (diluizione: 1/1.000) per 8 h a temperatura ambiente e, quindi, li Incubare a 4 ° C durante la notte.
   4. Sciacquare i tessuti con PBS e, quindi, incubare li con 3 gocce di anticorpo secondario biotinilato (diluizione: 1/1.000) per 2 h a temperatura ambiente, seguita da 3 gocce di avidina-biotina-perossidasi (diluizione: 1/200) a temperatura ambiente per 30 min.
   5. Associare, con 3 gocce di 30, 30-diaminobenzidina tetrahydrochloride (diluizione: 1/1.000), come descritto in precedenza²².
   6. Colorante di contrasto le sezioni di tessuto con ematossilina di Mayer.
3. Analisi di immunofluorescenza
   1. Asciugare le sezioni congelate testicolo (6 mm) per 10 min a temperatura ambiente.
   2. Fissarle con acetone ghiacciata per 10 min.
   3. Lavare le sezioni con PBS per 3x e bloccarli con un tampone di bloccaggio (BSA 1%, 0,3% Triton, 1x PBS) a 37 ° C per 30 min.
   4. Incubare le sezioni di tessuto con l'anticorpo primario (Z6) (20 µ g/mL) a 4 ° C durante la notte.
   5. Sciacquare i tessuti con PBS e applicare l'anticorpo secondario (fattore di diluizione: 1/200) per 1 h a 37 ° C.
   6. Lavare le sezioni di tessuto con PBS e li colorante di contrasto per nuclei con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (fattore di diluizione: 1/1.000), seguendo le istruzioni del produttore.

Risultati

A seguito di questi metodi, abbiamo sviluppato un modello murino per le infezioni ZIKV. Ifnar1^{- / -} topi a 6 – 8 settimane di età sono stati infettati con unità di formazione di messa a fuoco di 1 x 10⁴ (FFU) della ZIKV di retroorbital iniezione. Sintomi patologici e segni (Figura 1A), nonché variazioni di peso (Figura 1B), sono state osservate nei topi Ifnar1^{- / -} dopo un'infezione con il ZIKV. Il cervello murino ha mostrato edema evidente e iperemia (Figura 1C). Nel frattempo, i testicoli si è ridotto gradualmente (Figura 1D). Inoltre, mutazioni patologiche e la distruzione del tessuto sono stati trovati nel cervello e testicoli (Figura 2A). Abbiamo effettuato un'analisi di immunofluorescenza per rilevare la ZIKV nel cervello e testicoli (Figura 2B). Alta carica virale sono stati rilevati nel cervello e nel testicolo immunostaining (Figura 2B). Immunohistochemistry ha mostrato un'infiltrazione robusta di CD3⁺ T cellule nel cervello di topi dopo l'infezione con il ZIKV (Figura 2C).

Per rilevare e valutare le risposte specifiche ZIKV T-cell, abbiamo preparato un mouse MHC-I tetramero di H-2D^b-E_294-302 . Il peptide E_294-302 può aiutare la rinaturazione di^b H-2D correttamente e produrre una quantità elevata di solubili MHC-I (Figura 3A). In analisi di spostamento, un'alta efficienza in biotinylation potrebbe essere osservata (Figura 3B). Successivamente, tre streptavidina fluorescenza (APC, PE e BV421) - etichetta pMHC - I tetrameri sono state prodotte per rilevare le cellule T ZIKV-specifici (Figura 3C). Il tetramero PE-labeled aveva una più alta efficacia per rilevare il CD8 specifici⁺ delle cellule di T rispetto al tetrameri APC - e BV421-labeled, se la differenza non era statisticamente significativa.

Usando il tetramero di_294-302 E, abbiamo rilevato i linfociti T ZIKV-specifici nella milza dei topi infetti da citometria a flusso alle post-inoculazione 7D di ZIKV (3,49 ± 0,45%). Inoltre, simile al metodo descritto nella sezione 3 del presente protocollo, con post-immunizzazione 4 settimane di vaccino AdC7-M/E, i linfociti T ZIKV-specifici sono stati rilevati nella milza (6,89 ± 1,36%) (Figura 4).

Inoltre, abbiamo rilevato i linfociti infiltrati nel nuova organi, come il cervello e testicoli, dopo l'infezione di ZIKV. I cancelli sono stati fissati per selezionare per CD3⁺CD8⁺ T cellule in linfociti totali del cervello e testicoli. Un alto rapporto delle cellule di T E_294-302 tetramero specifico potrebbe essere rilevato nel cervello (42,2% nel CD3⁺CD8⁺ T cellule) e la testicolare (26,4% in CD3⁺CD8⁺ T cellule) linfociti (Figura 5).

Figura 1 : Caratterizzazione dell'infezione ZIKV nei topi di Ifnar1^{- / -} . Ifnar1^{- / -} topi a 6 – 8 settimane di età sono stati infettati con 10 unità di formazione di messa a fuoco⁴ (FFU) della ZIKV di iniezione retroorbital e topi iniettati con PBS sono stati usati come comandi non infetti. La morfologia (A) e (B) variazioni di peso di Ifnar1^{- / -} topi infettati sono stati controllati. Le frecce rosse indicano Ifnar1 topi^{- / -} ha presentati con myeloparalysis e motore paraparesis dopo l'infezione. (C) cervelli al post-inoculazione 7D e testicoli (D) a 0, 7, 14 e post-inoculazione 30 giorni sono state raccolte. Immagini rappresentative del cervello e testicoli dai topi sono visualizzati con un righello per indicare le dimensioni. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM. n = 10 topi per gruppo per esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Rilevazione di linfociti nel cervello e nel testicolo di topi^{- / -} ZIKV-infettati Ifnar1 e ZIKV. (A), questo pannello mostra i cambiamenti istopatologici nel cervello e testicoli da topi infettati ZIKV rispetto ai controlli negativi alle post-inoculazione 7D. Barra della scala = 25 µm (pannello di sinistra) e 50 µm (pannello di destra). (B) un'immunofluorescenza analisi è stata eseguita con l'anticorpo di anti-ZIKV Z6 (verde). Tutti i campioni di tessuto sono stati raccolti da topi infettati ZIKV al post-inoculazione 7D. I nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). Barra della scala = 50 µm. (C) esame immuno-istochimico indica un'infiltrazione robusta di CD3⁺ T cellule nel cervello e nel testicolo. Barra della scala = 25 µm (pannello di sinistra) e 50 µm (pannello di destra). Il viola indica ematossilina, marrone rappresenta l'anticorpo CD3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Preparazione di specifiche ZIKV pMHC-I tetrameri. (A), l'associazione di E_294-302 a H-2D^b è chiarito da un in vitro di ripiegamento. Il blu indica la proteina di_294-302 H-2D - E^b. Orange rappresenta il controllo negativo senza peptide. (B), questo pannello mostra l'analisi dello spostamento del H-2D^b-E_294-302 . (C), la simulazione rappresenta un controllo di PBS. Tre streptavidina fluorescenza (APC, PE e BV421) - etichetta pMHC - I tetrameri sono stati utilizzati per rilevare le cellule T ZIKV-specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Analisi citofluorimetrica di virus-specifici CD8 ⁺ Cellule di T nella milza dei topi affetti da ZIKV e vaccino-immunizzato. Ifnar1 topi^{- / -} 6-8 settimane di età o sono stati infettati con 10 unità di formazione di messa a fuoco⁴ (FFU) di ZIKV o ricevevano una dose singola di 4 x 10¹⁰ particelle virali di AdC7-M/E o PBS come controllo negativo. Dopo 7 giorni post-infezione o 4 settimane post-vaccinazione, splenocytes del topo sono state raccolte e analizzate tramite flusso cytometry. I dati sono mostrati come media ± SD. Statistical analysis è stata effettuata usando il One-way ANOVA (non significativo: P > 0.05; *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P < 0,001; * * *P < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 5 : Gating risultati strategia e rappresentante del virus-specifici CD8⁺ T cellule nel cervello e testicoli dei topi infettati da ZIKV. Rappresentante trame sono indicati per i linfociti infiltrati in (A) il cervello e (B) il testicolo. Una successione di gates è impostata su selezione linfoide-scatter⁺ e CD3⁺ eventi. Di questi, CD8⁺ eventi sono gated per l'analisi delle cellule di T di epitopo specifico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Discussione

Immunogeno epitopo a cellula T svolge un ruolo significativo nell'immunità cellulare contro gli agenti patogeni²³. Così, la rilevazione delle cellule di T ZIKV-specifici in organi di nuova è una metodologia critica per capire le risposte delle cellule T contro l'infezione naturale di ZIKV. Nel frattempo, rilevamento di risposta delle cellule T è un ottimo strumento per studiare l'efficacia del vaccino virale. Qui, indichiamo un protocollo completo di visualizzare gli esperimenti, che includono l'isolamento dei linfociti da milza, cervello e testicoli dei topi infettati ZIKV, la preparazione del tetramero immunodominanti epitopo E_294-302 e la riconoscimento di CD8 specifici ZIKV⁺ T cellule negli organi di nuova dei topi infettati da ZIKV.

Uno studio precedente ha mostrato che un ZIKV dal vivo o il RNA può essere rilevata nel liquido seminale dei pazienti di sesso maschile, che indica che il ZIKV può bypassare la barriera ematotesticolare e replicarsi nel sistema riproduttivo²⁴. In precedenza, abbiamo anche dimostrato che la ZIKV può causare danni di testicoli e condurre alla sterilità maschile in topi²⁵. ZIKV infezione può portare a viremia nelle scimmie rhesus, e il RNA virale può essere rilevato nel sistema nervoso centrale (SNC), come pure negli organi viscerali. Immunohistochemistry ha rivelato che gli antigeni ZIKV-specific sono stati presentati nel SNC e gli organi periferici più²⁶. Inoltre, in modelli murini, ZIKV infezione può indurre un robusto CD8 antivirale⁺ risposta a cellula T nella milza e nel CNS²⁶.

Rispetto ai lavori precedenti, questo studio stabilisce metodi sistematici per rilevare CD8 specifici ZIKV⁺ cellula T risposte nel cervello e testicoli, che sono siti di nuova. È importante valutare la funzionalità delle cellule T virus-specifiche negli organi dei topi affetti da ZIKV nuova. L'utilizzo di tetrameri di rilevare ZIKV specifici CD8⁺ T-cell responses in organi di nuova sarebbe di migliorare notevolmente la nostra comprensione delle infezioni ZIKV e loro risposta immune dell'ospite. Utilizzando tetramero_294-302 E, cellule T virus-specifiche nel cervello e nel testicolo possono essere isolate da citometria a flusso, per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi durante un'infezione ZIKV. Nel frattempo, è utile per i ricercatori a studiare ulteriormente le funzioni del CD8⁺ T cellule per controllare il ZIKV, o per migliorare l'immunopatogenesi in questi organi durante l'infezione ZIKV.

Per analizzare il CD8 murino di antigene-specifiche⁺ cellula T risposte negli organi nuova, abbiamo preparato tetramero di_294-302 - E H-2D^be rilevato il CD8⁺ T cellule tramite flusso cytometry. Tetrameri sono un potente strumento per rilevare cellule T antigene-specifiche. Qui, tre tipi di streptavidina fluorocromo-coniugate (APC, PE e BV421) sono stati generati. Anche se non ci sono differenze statisticamente significative in APC, BV421 e tetrameri PE-etichettati per la rilevazione di cellule T antigene-specifiche, pMHC PE-labeled-I tetrameri ha prodotto i risultati migliori. Quindi, il tetramero PE-identificato è stato utilizzato nel corso di questo studio. È interessante notare che, in base il tetramero di_294-302 PE-labeled H-2D - E^b, abbiamo rilevato alti rapporti di cellule T antigene-specifiche nel cervello e testicoli, che indicano la capacità di migrazione delle cellule di T virus-specifici dal sangue per organi di nuova.

Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo. Il tetramero di_294-302 H-2D - E^bnon è utile per il rilevamento della T-cellula umana, perché tetramero rilevamento dipende dalla restrizione MHC. Lo screening dei peptidi HLA-restricted immunodominanti è ancora necessaria. Inoltre, l'infezione retro-orbitale è efficace per un'infezione ZIKV ma potrebbe non essere un'operazione conveniente per alcuni ricercatori. Così, altre vie di infezione, tra cui peritoneale, sottocutanea o endovenosa, sono anche raccomandati.

Nel protocollo descritto qui, un passo fondamentale è l'isolamento dei monociti dal cervello e testicolo. È importante acquisire qualità linfociti; Pertanto, è importante prestare attenzione, ad esempio, la velocità di centrifuga, la forza del tessuto rettifica e la dissezione del tessuto del cervello e del testicolo. Inoltre, per la preparazione di tetramero, inibitori della proteasi (PMSF, pepstatina, leupeptina) sono utili quando si protegge una proteina da essere degradate. Pertanto, ha senso aggiungere un inibitore della proteasi per il buffer di refolding e scambiare il buffer durante il processo della preparazione tetramero.

In conclusione, vi presentiamo i metodi di rilevazione risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova del modello del topo di Ifnar1^{- / -} per un'infezione ZIKV. Questa piattaforma può essere ampiamente applicata per studiare i meccanismi immuni di emergenti e riemergenti virus che può ignorare le barriere tra il sangue e gli organi di nuova. Inoltre, questo studio potrebbe spianare la strada per il futuro sviluppo di vaccini e immunoterapie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Z6	il nostro laboratorio		Ma W, Li S, Ma S, et al. Il virus Zika provoca danni ai testicoli e porta all'infertilità maschile nei topi. Cellula, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Capra Affinipura Affinipura IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
IgG anti-capra di coniglio, FITC coniugato	CWBIO	CW0115
FITC anti-topo CD3	Biolegend	17A2
APC anti-topo CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-topo CD8a		Biolegend 100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Reagente tossico e corrosivo. Maneggiare con cura
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Fornisce una soluzione limpida a 10 mg/ml in PBS e  conservato a -20 ° C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2,5 mL DMSO, aliquote conservate a -20 º C
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2,5 mL dH2O, aliquote conservate a - 20 º C
Peptidi	Scilight-peptide		Deve essere risospeso in DMSO e conservato a -20 gradi C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Deve essere conservato a 4 gradi C
DMSO	MP		Conservare a temperatura ambiente.
APC-Streptadivin	BD	554067	Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Non congelare.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Non congelare.
PE-Streptadivin	BD	554061	Deve essere conservato e mantenuto a 4°C. Non congelare.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Non congelare.
PageRuler Scala Proteica Non Colorata	Thermo Fisher Scientific	26614	Deve essere conservato a 4 gradi; C
Filtri per celle	BF	BF10-5040	Conservare a temperatura ambiente.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	Conservare a temperatura ambiente.
Ultracentrifuga	Thermo Fisher Scientific
a flusso FACS Cantol			deve contenere laser e filtri compatibili con il pannello di colorazione utilizzato.
Aumento Superdex 200 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
tampone per lisi dei globuli rossi	Solarbio	R1010	Conservare a 4 °C.