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Articolo metodologico

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

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DOI:

10.3791/58118

⸱

22 agosto 2018

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.

Abstract

Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, la proliferazione e la differenziazione di T helper 1 (Th1) cellule è un modo utile per valutare il ruolo svolto dalle cellule di T in una risposta immunitaria. Questo protocollo descrive la differenziazione in vitro di progenitori del midollo osseo (BM) per ottenere granulocita macrofago distimolazione factor (GM-CSF) derivato-cellule dendritiche (DCs). Il protocollo descrive anche il trasferimento adottivo del peptide di ovoalbumina (OVAp)-caricato di GM-CSF-derivati DCs e cellule T CD4 Naive da topi transgenici Paolo al fine di analizzare l'attivazione in vivo , la proliferazione e la differenziazione Th1 della trasferite le cellule T CD4. Questo protocollo elude la limitazione di puramente in vivo metodi imposti dalla incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate. Inoltre, questo protocollo permette studi in un ambiente in vivo , evitando così alterazioni di fattori funzionali che possono verificarsi in vitro e compreso l'influenza di tipi cellulari e di altri fattori trovati solo negli organi intatti. Il protocollo è uno strumento utile per la generazione di cambiamenti nel sistema DCs e cellule di T che modificare le risposte immunitarie, potenzialmente fornire risultati importanti per capire l'origine o lo sviluppo di numerose patologie immuni.

Introduzione

Le cellule T CD4 + e cellule (APCs) come DCs presentanti l'antigene sono necessari mediatori di immunità agli agenti patogeni microbici1,2. Negli organi linfoidi periferici, le cellule T CD4 sono attivate al momento della rilevazione di antigeni specifici presentati da APC3,4,5. Linfociti T CD4 attivati proliferano e si differenziano in cellule effettrici specifiche distinte del Th che sono necessari per lo sviluppo di una corretta risposta immunitaria adattativa6,7. Controllo di questi processi è fondamentale per la produzione di un'adeguata difesa adattiva che uccide l'agente patogeno senza produrre tessuto nocivo danni8. Cellule del Th sono definite secondo l'espressione o la produzione di molecole di superficie, fattori di trascrizione e le citochine effettrici e svolgono funzioni essenziali e precisione in risposta ad agenti patogeni1. Cellule del sottoinsieme delle cellule Th1 esprimono il fattore di trascrizione T-scommessa e la citochina interferone γ (IFNγ) e partecipano nella difesa ospite contro patogeni intracellulari1. Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, proliferazione e differenziazione Th1 è un strumento utile per valutare il ruolo T cellule nella risposta immunitaria.

Questa protocollo consente in vivo analisi della capacità di in vitro -generato DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione Th1 delle cellule T CD4 Naive. Il protocollo serve anche a valutare la capacità delle cellule T CD4 Naive per essere attivato, indotti a proliferare e Th1 differenziato (Figura 1). Questo protocollo versatile elude l'incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate in puramente in vivo protocolli. Gli effetti di diverse molecole e trattamenti su controller di dominio possono essere studiati utilizzando BM da topi geneticamente modificati5 o trattamento o manipolare geneticamente isolata BM cellule9. Allo stesso modo, le risposte delle cellule T possono essere esplorate di ottenimento delle cellule di T per trasferimento adottivo da fonti diverse o dopo diverse manipolazioni3,8,10.

I principali vantaggi di questo protocollo sono duplici. L'attivazione delle cellule t, la proliferazione e la differenziazione Th1 sono analizzati con un approccio di citometria a flusso; e questo è combinato con studi in vivo , così evitare le alterazioni che possono verificarsi in vitro e compresi tipi cellulari e altri fattori solo trovati in organi intatti11.

L'uso di coloranti vitali è una tecnica ampiamente utilizzata per tenere traccia di proliferazione delle cellule, evitando l'uso di radioattività. La misurazione di proliferazione con questi reagenti si basa sulla diluizione della tintura dopo la divisione cellulare. Inoltre, questi coloranti possono essere rilevati a più lunghezze d'onda e facilmente sono analizzati tramite flusso cytometry in combinazione con più anticorpi fluorescenti o marcatori. Evidenziamo l'utilità del presente protocollo, mostrando come l'attivazione delle cellule T, la proliferazione e la differenziazione Th1 possono essere analizzati tramite flusso cytometry.

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Protocollo

Procedure sperimentali sono state approvate dalla Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e la Comunidad Autónoma de Madrid conformemente agli orientamenti spagnoli ed europei. I topi sono stati allevati in condizioni di agente patogeno specifico libera (SPF) e sono stati eutanasizzati per inalazione di anidride carbonica (CO2).

1. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo da tibie e femori

Nota: Il ceppo di topo C57BL/6 Congenici trasporta l'indicatore differenziale del leucocita Ptprcuna, generalmente riconosciuto come CD45.1 o Ly5.1, considerando che il selvaggio-tipo C57BL ceppi Ptprcb dell'allele, conosciuto come CD45.2 o Ly5.2. Varianti CD45.1 e CD45.2 possono essere distinti da citometria a flusso facendo uso degli anticorpi. Topi CD45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 possono essere utilizzati come fonti di cellule o come destinatari per trasferimento adottivo, permettendo l'analisi delle popolazioni distinte delle cellule tramite flusso cytometry. Utilizzare preferenzialmente età- e sesso-abbinato maschi o femminili topi sotto 12 settimane di età.

  1. Preparazione dei femori e tibie
    1. Eutanasia topi utilizzando il protocollo approvato dal Comitato istituzionale cura degli animali.
    2. Disinfettare le zampe spruzzando la superficie animale con etanolo al 70%.
    3. Utilizzare bisturi, pinze e forbici sterili. Con un bisturi, fare un taglio nella pelle e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compreso la pelle che copre l'estremità posteriore. Sbucciare la pelle intorno al muscolo del polpaccio inferiore e rimuovere la pelle dalle gambe completamente (Figura 2A, 2B).
    4. Separare il muscolo quadricipite dal femore usando un bisturi. Disarticulate l'articolazione dell'anca senza rompere la testa del femore. Rimuovere i muscoli dalla tibia usando un bisturi (Figura 2, 2D). Separare il femore dalla tibia senza rompere l'estremità dell'osso.
    5. Mantenere le ossa in una piastra Petri contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina nel mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x ghiacciata.
  2. Isolamento delle cellule
    Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti sotto una cappa di cultura e con materiale sterile per evitare la contaminazione.
    1. In una piastra Petri sterile, con cura di tagliare le estremità prossimale e distale di ogni osso con un bisturi.
    2. Lavare le ossa ripetutamente con un volume totale di 10 mL di caldo terreno RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% di penicillina/streptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 2 mM L-Glutammina). Lavare le ossa da entrambe le estremità con un ago 25 G collegato ad una siringa da 1 mL.
    3. Trasferire il effluate in una provetta conica 50 mL con 70 µm in nylon web filtro. Attentamente sloggiare conglomerati delle cellule e detriti di agitazione delicata e pipettaggio.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 10 min a temperatura ambiente (TA).
    5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi di globulo rosso freddo (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH regolato a 7,2 con 1 N HCl, 0,4 µm sterile filtrato e conservato a 4 ° C). Mantenere in ghiaccio per 5 minuti con il manuale di agitazione.
    6. Aggiungere 10 mL di tampone di freddo (1 x 2 mM EDTA, tamponato fosfato salino (PBS) + 2% albumina di siero bovino (BSA)) per inattivare e lavare il buffer di lisi di globuli rossi.
    7. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
    8. Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
    9. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo. Mix 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con trypan blu. Determinare il numero di cellule in una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12.
      Nota: Questo metodo rese 40 x 106 a 60 x 106 osseo cellule di midollo per 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12.
    10. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.

2. DC differenziazione, maturazione e caricamento di antigene

  1. Raccolta delle cellule di BM
    1. Seme della cultura completa sulle piastre di superficie 6 pozzetti ultra-low-allegato a 106 cellule per mL di terreno, in genere in 5 mL per pozzetto. Macrofagi differenziati attribuirà alle piastre di coltura. Dopo 12 h, trasferire il surnatante, contenente principalmente i monociti, per pulire le piastre da 6 pozzetti, scartando i vecchi 6 pozzetti con i macrofagi aderiti.
    2. Per promuovere la differenziazione cellulare, coltura le cellule non-aderenti a 5 x 105 cellule / mL in genere 5ml per pozzetto di terreno RPMI completo contenente 20 ng/mL ottenuto commercialmente ricombinante GM-CSF murino a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2) e osservare quotidianamente.
    3. Ogni 3 giorni, rotazione verso il basso le cellule sospese e raccogliere le celle aderenti con 5 mM EDTA in PBS e rotazione verso il basso. Combinare e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in mezzo fresco che contiene 20 ng/mL rm-GM-CSF.
    4. Il giorno 8, raccogliere le cellule aderenti e distaccate come sopra e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in media da 20 ng/mL GM-CSF e 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per 24 h in un non-coltura del tessuto-trattati sterile di Petri, per indurre alta MHC-II , Espressione di CD80 e CD86.
    5. Differenziazione di controllo DC mediante citometria a flusso come indicato al punto 2.2.
  2. Analisi di maturazione e differenziazione di citometria a flusso.
    1. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte.
    2. Recettori Fc blocco incubando il pellet cellulare sedimento nel stampo del ricevitore del mouse Fc (purificato anti anticorpo IgG CD16/CD322b ) per 15 min a 4 ° C secondo le istruzioni del produttore.
    3. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
    4. Per ogni sonda, risospendere le 250.000 cellule a 300 µ l di tampone di citometria a flusso (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.
    5. Trasferire 30 µ l di soluzione di cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
    6. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
    7. Scartare il surnatante e aggiungere 30 µ l di anticorpo-contenente buffer per ogni bene seguendo le indicazioni del produttore. Incubare le cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C.
      Nota: In genere impiegati marcatori per DCs, monociti e macrofagi sono CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3).
    8. Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere in 200 µ l di tampone di citometria a flusso freddo contenente un marcatore per escludere le cellule morte (ad es., ioduro di propidio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o un colorante ammina-reattivo ) del produttore concentrazione consigliata13.
    9. Monitorare la differenziazione delle cellule trasferire i campioni ai tubi di flusso cytometry ed effettuando l'analisi di citometria a flusso escluse le cellule morte nei giorni 0, 3, 6 e 9.
  3. Carico DC antigene.
    1. Il giorno 8, centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS senza antibiotici). Ripetere questo passaggio due volte.
    2. Incubare il DCs con 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) a 1 x 107 DCs in 1 mL di terreno (RMPI + 1% FBS) in un tubo di plastica per almeno 30 min a 37 ° C. Uso non caricati OVAp DCs come una condizione di controllo negativo.
    3. Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in terreno RPMI completo di 200 µ l. Ripetere questo passaggio due volte.
    4. Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS) a 2 x 106 cellule/mL.

3. isolamento di cellule T CD4 ingenuo da Paolo topi

Nota: Questo metodo produce circa 100 x 106 spleenocytes a 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12. Possono essere utilizzate sia maschi che femmine. Cellule T CD4 possono essere isolate dalla milza o linfonodi; Cellule T CD4 rappresentano circa il 25% e il 50% delle cellule in questi organi, rispettivamente. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di sterilità.

  1. Isolare i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesenterici e la milza da topi transgenici Paolo (Figura 4) e trasferirli in una capsula di Petri contenente 10 mL di terreno RPMI completo di plastica.
  2. Sciacquare il filtro cella con 2 mL di terreno RPMI completo e rimuoverlo dal tubo 50 mL. Trasferimento di linfonodi e milza per un colino di cella di 70 µm collocato in una provetta da 50 mL. Omogeneizzare mediante un pistone della siringa (Figura 5) e aggiungere il terreno fino a 15 mL.
  3. Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in 15 mL di terreno RPMI completo. Ripetere questo passaggio due volte.
  4. Per sospensione di cellule di milza, risospendere il pellet cellulare e lisare cellule rosse del sangue, come indicato nel passaggio 1.2.5.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
  6. Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a TA.
  7. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno. Mescolare 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con Trypan blue. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12.
  8. Ripetere il punto 2.2.2.
  9. Seguendo le istruzioni del produttore, incubare le cellule con diluizioni 1: 800 di anticorpi biotinilati CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 per 30 min in ghiaccio per poi selezione negativa delle cellule T CD4.
  10. Seguendo le istruzioni del produttore e sulla base del numero delle cellule e la capacità dei branelli, calcolare la quantità necessaria di microperle magnetiche rivestite con streptavidina e isolare le cellule T CD4 + utilizzando un separatore magnetico delle cellule e l'appropriato colonne di separazione.
  11. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo e tenerli sul ghiaccio mentre il conteggio di cellule vive, come descritto al punto 3.7.
  12. Estrarre 2 x 105 celle e verificare la purezza delle cellule raccolte utilizzando anti-CD4, CD3, B220 e CD8 anticorpi fluorescenti in un citometro a flusso con diluizioni di anticorpo produttore-consigliare.
  13. Per macchiare le cellule di T di CD4/Paolo isolato naif, risospendere le cellule in 500 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) 10-6 . Preparare 500 µ l tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) raddoppiare la concentrazione consigliata dal produttore finale di colorante tracciante vitale delle cellule. Mescolare entrambe le soluzioni aggiungendo lentamente la soluzione di tracciante cellulare alla sospensione di cellule. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C.
  14. Lavare le cellule con 5 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI completo a 1 x 107cellule/mL.

4. in Vivo l'attivazione, proliferazione e analisi di differenziazione Th1

Nota: L'estere di succinimidyl diacetato di cellula vitale tracciante colorante carboxyfluorescein (CFSE) e altri coloranti a base di estere succinimidyl, che sono eccitati ed emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda, sono ampiamente utilizzati per valutare la proliferazione dei linfociti di flusso citometria a causa della loro intensità alta fluorescenza, lunga durata, bassa variabilità e bassa tossicità14.

  1. Passivamente trasferimento per via endovenosa (i.v.) 1 x 106 dal vivo e vitale delle cellule tracciante colorante-macchiato ingenuo CD4/Paolo T cellule in 100 µ l di PBS per topo. Le cellule di T con etichettate possono essere trasferite passivamente dalla vena caudale o retro-orbitale iniezione15; in entrambi i casi, le cellule saranno sede di organi linfoidi (Figura 6A).
  2. Sfida i topi destinatari un giorno più tardi trasferendo passivamente 100.000 LPS-maturato caricato OVAp DCs per via sottocutanea (s.c.) in footpads (Figura 6B).
  3. Raccogliere poplitea linfonodi da topi destinatari ed elaborarli fino all'ottenimento delle sospensioni di cellule singole seguendo la stessa procedura come descritta in precedenza in 3.1 e 3.2. Fare questo post-immunizzazione giorno 2 per misurare l'attivazione delle cellule T CD4/Paolo ed il giorno 5 per misurare la proliferazione e la differenziazione Th1.
  4. Per analizzare l'attivazione delle cellule T il giorno 2, macchia le cellule con anticorpi fluorescenti di CD4, CD69 e CD25 (facoltativamente CD45.1 e CD45.2) e determinare la percentuale di C69+CD25+ T cellule nella popolazione CD4. Analizzare mediante citometria a flusso (Figura 7).
  5. Per controllare la proliferazione delle cellule T il giorno 5, macchia le celle utilizzando appropriati anticorpi fluorescenti CD4 e facoltativamente CD45.1 e CD45.2. Analizzare il decadimento del segnale vitale delle cellule tracciante colorante nella popolazione CD4 da citometria a flusso (Figura 8). Diversi parametri possono essere determinati in questi studi, come il numero di divisioni cellulari subito dalle cellule etichettate con il colorante tracciante vitali delle cellule, la percentuale di divisione delle cellule in ogni picco di fluorescenza e la percentuale di divisione delle cellule nella cella totale popolazione.
  6. Per determinare la differenziazione Th1 giorno 5, 400.000 cellule piastra per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 200 µ l di terreno RPMI completo contenente 1 µM ionomicina e 10 ng/mL phorbol 12 miristato 13 acetato (PMA) per 6 h a 37 ° C nell'incubatore. Per l'ultimo 4 h, aggiungere 3 – 10 µ g/mL brefeldina A per bloccare la secrezione di citochina al mezzo.
  7. Centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante di inversione rapida della piastra 96 pozzetti.
  8. Ripetere il punto 2.2.2.
  9. Macchia le membrane cellulari mediante incubazione per 15 min a 4 ° C in 30 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contenente al CD4 e, facoltativamente, a CD45.1 e CD45.2 alle diluizioni consigliate dal produttore. Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante.
  10. Fissare le cellule aggiungendo 100 µ l di paraformaldehyde/1% 2% saccarosio per 20 min a RT. centrifuga le piastre per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  11. Permeabilize le cellule aggiungendo 50 µ l di tampone di permeabilizzazione intracellulare (1x PBS + 0.1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponine) ed incubare per 30 min a 4 ° C.
  12. Aggiungere 150 µ l di PBS e centrifugare per 5 minuti a 1.000 x g a RT. scartare il surnatante.
  13. Macchia di citochine intracellulari aggiungendo 30 µ l di fluorophore-coniugato anti anticorpo IFNγ nel buffer (PBS + 0.1% saponine) e incubare per 30 minuti a TA.
  14. Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (PBS + 0.1% saponine). Centrifugare le piastre per 5 min a 1.000 x g a RT e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.
  15. Analizzare le popolazioni delle cellule mediante citometria a flusso (Figura 8).

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Risultati

La figura 1 illustra i passaggi descritti in questo protocollo. La figura 2 illustra l'isolamento e la coltura delle cellule BM del topo. L'aggiunta di GM-CSF e LPS a queste culture permette la generazione in vitro e maturazione della DCs. Figura 3 illustra l'analisi di citometria a flusso della differenziazione e maturazione della DCs. OVAp-caricato GM-CSF BM-derivato DCs ottenuti e isolato...

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Discussione

Questo protocollo consente la caratterizzazione della capacità del DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T CD4 Naive. Inoltre, può anche essere utilizzato per valutare la suscettibilità delle cellule T CD4 + a modulazione da DCs BM-derivato. Con questo protocollo, le modifiche a questi eventi possono essere misurato in vivo.

Secondo l'ipotesi in esame, diverse combinazioni di cellule T e DC possono essere usati. Ad esempio, si posso...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Simon Bartlett per l'editing di inglese. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), il programma di Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; con il co-finanziamento del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Il CNIC è supportato dal Ministero dell'economia, industria e competitività (MEIC) e la Fondazione Pro CNIC, è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF è fondata da Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG da ISCIII, BHF di Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G dal ISCIII Miguel Servet programma e imas12.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
EtanoloVWR Chemicals20,824,365L
ForbiciStrumenti per la scienza fine (FST)14001-12
PinzeStrumenti per la scienza fine (FST)11000-13
Pinze finiStrumenti per la scienza fine (FST)11253-20
BisturiStrumenti per le scienze fini (FST)10020-00Scatola da 100 lame
Siero fetale bovinoSIGMAF7524
Penicillina/streptomicinaLONZADE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)GIBCO21875-034
Piastre di Petri steriliFalcon353003
ago calibro 25BD Microlance 3300600
Siringa da 1 mlNovicoN15663
15 ml tubi coniciFalcon352096
50 ml tubi coniciFalcon352098
70 μ m filtro a nastro in nylonBD Falcon352350
Tampone per lisi del sangue rossoSIGMAR7757100 Ml
EDTASIGMAED2SS-250
Albumina sierica bovinaSIGMAA7906100 g
Blu di tripanoSIGMA302643-25G
Piastre di colturaFalcon353003
Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES)CambrexBE17-737E
Beta-mercaptoetanoloMerck8-05740-0250
Piruvato di sodioLONZABE13-115E
L-glutamminaLONZABE17-605E
Granulocita murino ricombinante Fattore stimolante le colonie di macrofagi (GM-CSF)Prepotech315-03
lipopolisaccaride (LPS)SIGMA-ALDRICHL2018
a 96 pozzettiCostar3799
v450 anti-topo Anticorpo CD11bBD Biosciences560455
PE anti-topo Anticorpo CD64BioLegend139303
PE anti-topo Anticorpo CD115BioLegend135505
FITC anti-topo Anticorpo CD11cBioLegend117305
FITC anti-topo Anticorpo MHCIIBioLegend125507
APC anti-topo Anticorpo CD86BioLegend105011
APC anti-topo Anticorpo CD80BioLegend104713
Provette per citometria a flussoZelian300800-1PS 12X75 5mL
OTII Peptidedi ovoalbuminaInvivoGen323-339
anticorpo CD8&alfa biotinilato di topoTonbo Biosciences30-0081-U500
anticorpo IgM biotinilato di topoBioLegend406503
anticorpo B220 biotinilato di topoTonbo Biosciences30-0452-U500
anticorpo CD19 biotinilato di topoTonbo Biosciences30-0193-U500
anticorpo MHCII (I-Ab) biotinilato di topoBioLegend115302
anti-topo biotinilato CD11banticorpo Tonbo Biosciences30-0112-U500
anti-topo biotinilato CD11c anticorpoBioLegend117303
anti-topo biotinilato CD44 anti-topoBioLegend103003
anti-topo biotinilato Anticorpo CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
anti-topo biotinilato DX5 anticorpoBioLegend108903
microsfere magnetiche rivestite di streptavidinaMACS Miltenyi Biotec130-048-101
Separatore di cellule magneticheMACS Miltenyi Biotec130-090-976QuadroMACS Separatore
Colonne di separazioneMACS Miltenyi Biotec130-042-401
PE anti-topo CD4 anticorpoBioLegend100408
APC anti-topo CD3 anticorpoBioLegend100235
FITC anti-topo CD8 anticorpoTonbo Biosciences35-0081-U025
Cell Violet TracerThermofisherC34557
APC anti-topo CD25 anticorpoTonbo Biosciences20-0251-U100
Alexa647 anti-topo CD69 anticorpoBioLegend104518
PerCPCY5.5 anti-topo CD45.1 anticorpoTonbo Biosciences65-0453
APC anti-topo CD45.1 anticorpoTonbo Biosciences20-0453
PECY7 anti-topo CD45.1 anticorpoTonbo Biosciences60-0453
FITC anti-topo CD45.2 anticorpoTonbo Biosciences35-0454
IonomicinaSIGMA-ALDRICHI0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetato (PMA)SIGMAP8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug)BD555029
ParaformaldeideMillipore8-18715-02100
Tampone di permeabilizzazione intracellulareeBioscience00-8333
APC anti-topo IFNg anticorpoTonbo Biosciences20-7311-U100
Fc-block (anti-topo CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161-U100
B6. Topi SJL CD45.1Illaboratorio Jackson 002014
BD LSRFortessa&commercio; Analizzatore cellulareBD Biosciences649225
Soluzione DAPIThermofisher62248
5 piastra

Riferimenti

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

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