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Articolo metodologico

Luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame dell'oro

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DOI:

10.3791/58141

⸱

31 agosto 2018

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

In questo articolo

Sommario

I protocolli per studiare l'associazione di oro cationi (Au(III)) a varie conformazioni di albumina di siero bovino (BSA) come pure per caratterizzare la fluorescenza di BSA-Au unica dipendente conformazionale sono presentati.

Abstract

Lo scopo dei protocolli presentati è quello di studiare il processo di associazione Au(III) a BSA, cedendo la fluorescenza rossa indotta da cambiamento di conformazione (λem = 640 nm) dei complessi BSA-Au(III). Il metodo consente di regolare il pH per mostrare che l'emersione della fluorescenza rossa è correlato con le transizioni di equilibrio pH-indotta delle conformazioni BSA. Rosso fluorescente BSA-Au(III) complessi possono essere formati solo con un adeguamento del pH pari o superiore a 9.7, che corrisponde alla conformazione "A-form" di BSA. Il protocollo per regolare la BSA al rapporto molare Au e per monitorare il corso di tempo del processo di associazione Au(III) è descritto. Il numero minimo di Au(III) a BSA, per produrre la fluorescenza rossa, è meno di sette. Descriviamo il protocollo nei passaggi per illustrare la presenza di più siti di legame di Au(III) in BSA. Prima, con l'aggiunta di rame (Cu(II)) o nichel (cationi Ni(II)) seguiti da Au(III), questo metodo si rivela un sito di legame per Au(III) che non è il fluoroforo rosso. In secondo luogo, modificando tiolo tappatura agenti BSA, viene rivelato un altro sito di legame di Au(III) nonfluorophore-formanti. In terzo luogo, i dominî di BSA di sfaldatura e tappatura dei legami disolfuro, sono illustrati i possibili siti di associazione Au(III). Il protocollo descritto, per controllare le conformazioni di BSA e l'associazione Au(III), può essere generalmente applicato per studiare le interazioni di altre proteine e cationi metallici.

Introduzione

Un composto di BSA-Au esibendo un ultravioletto (UV)-eccitabile fluorescenza rossa, con notevole spostamento di stokes, è stato originariamente sintetizzato da Xie et al. 1. la fluorescenza rossa univoco e stabile può trovare varie applicazioni in campi quali rilevamento2,3,4,5,6,7o imaging nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Questo composto è stato studiato estesamente da molti ricercatori nel campo delle nano-scienze in ultimi anni14,15,16. Il composto di BSA-Au è stato interpretato come Au25 nanocluster. L'obiettivo del metodo presentato è per esaminare questo composto in dettaglio e per capire l'origine della fluorescenza rossa. Seguendo l'approccio presentato, la presenza di più siti di legame di Au e l'origine della fluorescenza, alternativa per la nucleazione di singolo sito di nanocluster di Au25 , possono essere illustrate. Lo stesso approccio può essere impiegato per studiare come altre proteine17,18,19 complessato con Au(III) può cambiare le loro proprietà intrinseche, fluorescente.

La sintesi del composto rosso fluorescente BSA-Au richiede un controllo stretto dei rapporti molari di BSA per Au (BSA:Au) per massimizzare l'intensità della fluorescenza e la posizione dei picchi a eccitazione-emissione mappa (EEM)20. Si può dimostrare che più siti di legame esistano per Au(III) per l'associazione, tra cui il frammento di asparagina (o frammento di Asp, i primi quattro residui dell'amminoacido al N-terminale di BSA)21,22. Dell'aminoacidoth 34 di BSA (Cys-34) è inoltre indicato per coordinare Au(III) e di essere coinvolti nel meccanismo del rosso fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Su tutti i ponti disolfuro Cys Cys di sfaldatura e tappatura tutti fluorescenza di tioli, rosso non è prodotta ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Questo indica la necessità di legami disolfuro Cys Cys come il sito di legame di Au(III) per produrre la fluorescenza rossa.

Tecniche di chimica della proteina non sono stati ampiamente utilizzati per studiare i complessi di BSA-Au(III) della comunità di nano-scienza. Tuttavia, sarebbe prezioso per impiegare queste tecniche per capire alcuni aspetti di questi complessi, nonché di acquisire una comprensione dettagliata delle sedi del legame di Au(III) in BSA. Questo articolo è destinato a mostrare alcune di queste tecniche.

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Protocollo

1. sintesi del complesso BSA-Au(III)

  1. Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in un flaconcino di reazione da 5 mL.
    Nota: La soluzione dovrebbe apparire chiara.
  2. Sciogliere triidrato di oro (III) cloruro (acido cloroaurico) ad una concentrazione di 5 millimetri di acqua di grado HPLC.
    Nota: La soluzione appare gialla. Soluzione di acido cloroaurico preparata a questa concentrazione si tradurrà in una BSA al rapporto tra Au 01:13.
    1. In alternativa, preparare una soluzione di acido cloroaurico con una concentrazione di ovunque tra 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) fino a 20 mM (BSA:Au = 01:50) in HPLC del grado dell'acqua.
      Nota: Diversi rapporti di BSA all'oro si tradurrà in modelli drasticamente diversa fluorescenza rossa della mappa eccitazione-emissione.
  3. Collocare il flaconcino di reazione di BSA in bagnomaria a 37 ° C e mescolare vigorosamente a 750 giri/min con un agitatore magnetico.
  4. Subito dopo inizia l'agitazione, aggiungere 1 mL di acido cloroaurico alla soluzione. Il colore della soluzione dovrebbe trasformare da incolore a giallo.
  5. Mescolare il composto per 2 min a 37 ° C e a 750 giri/min con un agitatore magnetico.
  6. Nella fiala di reazione, aggiungere 100 μL di 1 M NaOH alla soluzione per portare il pH a 12.
    Nota: Immediatamente dopo l'aggiunta di NaOH, la soluzione dovrebbe scurire leggermente al giallo-marrone e poi tornare indietro al giallo.
  7. Continuare a mescolare a 750 giri/min per 2 h e a 37 ° C. La soluzione dovrebbe cambiare lentamente dal giallo ad un colore giallo/marrone scuro. Questo cambiamento di colore indica la formazione del rosso fluorescenti BSA-Au(III) complesso.
  8. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 2 giorni, il campione e la soluzione continuerà a scurire ad un marrone ambrato e aumenterà l'intensità di fluorescenza.
    1. In alternativa, lasciare il campione continuare a mescolare a 37 ° C per 12 h più come il colore della soluzione si evolve ad un'ambra marrone.

2. sintesi di BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado HPLC. La soluzione dovrebbe apparire chiara.
  2. Sciogliere il rame (II) cloruro diidrato in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM. La soluzione dovrebbe apparire la luce blu.
  3. Aggiungere 1 mL di soluzione acquosa di BSA per un flaconcino di reazione da 5 mL e posto in un bagno di acqua a 37 ° C. Mescolare il composto a 750 giri/min.
  4. Immediatamente aggiungere 0,5 mL della soluzione di rame (II) cloruro diidrato nel flaconcino di reazione e mescolare per 2 min. La soluzione rimarrà luce blu.
  5. Aggiungere 75 µ l di 1 M NaOH per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h. La soluzione diventerà viola.
  6. Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM.
  7. Aggiungere 0,5 mL di acido cloroaurico acquosa nel flaconcino di reazione e regolare il pH torna a 12 utilizzando 1 M NaOH.
  8. Mescolare la miscela di reazione per 2 h.
    Nota: La soluzione dovrebbe evolvere in un color marrone.

3. sintesi di BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado HPLC. La soluzione dovrebbe apparire chiara.
  2. Sciogliere il nichel (II) cloruro esaidrato in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM. La soluzione dovrebbe apparire la luce verde.
  3. Aggiungere 1 mL di soluzione acquosa di BSA per un flaconcino di reazione da 5 mL e porre in un bagno di acqua a 37 oC. mescolare la miscela a 750 giri/min.
  4. Immediatamente aggiungere 0,5 mL della soluzione di nichel (II) cloruro esaidrato flaconcino di reazione e mescolare per 2 min.
    Nota: La soluzione rimarrà luce verde.
  5. Aggiungere 75 µ l di 1 M NaOH per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h.
    Nota: La soluzione diventa giallo scuro.
  6. Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM.
  7. Aggiungere 0,5 mL di acido cloroaurico acquosa nel flaconcino di reazione e regolare il pH torna a 12.
  8. Mescolare la miscela di reazione per 2 h.
    Nota: La soluzione dovrebbe evolvere in un color marrone.

4. sintesi di [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. Sciogliere 2 mg di N-ethylmaleimide (NEM) in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).
  2. Sciogliere 2 mg di BSA in 1 mL di soluzione di PBS-NEM.
  3. Trasferire la soluzione in un flaconcino di reazione da 5 mL e mescolare a 20 ° C a 500 giri/min per 1 h.
  4. Dializzare la soluzione utilizzando 12 tubi di dialisi di kDa in 500 mL di PBS, agitazione a 50 giri/min con un agitatore magnetico durante la notte per rimuovere NEM non reagito.
  5. Sciogliere l'acido cloroaurico in PBS per una concentrazione di 0,4 mM.
    Nota: La soluzione sarà un giallo tenue.
  6. Trasferire il flaconcino di reazione a un bagno di acqua a 37 ° C. Mescolare a 750 giri/min.
  7. Immediatamente aggiungere 1 mL di soluzione di acido cloroaurico nel flaconcino di reazione e lasciar per mescolare per 2 min.
  8. Aggiungere 75 μL di 1 M NaOH al flaconcino di reazione per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h.

5. sintesi di [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. Preparare una soluzione 2 M urea e 50mm di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3, pH 8.0) in acqua di grado HPLC.
  2. Sciogliere 3,3 mg di BSA in 1 mL della soluzione precedente e trasferimento di un flaconcino di reazione da 5 mL.
  3. Fare una soluzione stock di 0,25 M tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) sciogliendo 62,5 mg di TCEP in 1 mL di acqua per HPLC.
  4. Aggiungere la soluzione madre di TCEP nel flaconcino di reazione fino a quando la concentrazione finale di TCEP è di 8 mM.
  5. Incubare la soluzione in un bagno di acqua per 1 h a 50 ° C. Mescolare a 500 giri/min con un agitatore magnetico.
  6. Lasciare la soluzione completamente raffreddare a temperatura ambiente.
  7. Preparare una soluzione stock di 100 mM NEM sciogliendo 12,5 mg di NEM in 1 mL di acqua di grado HPLC.
  8. Aggiungere la soluzione madre di NEM nel flaconcino di reazione fino a quando la concentrazione finale di NEM è di 16 mM.
  9. Lasciare agire la soluzione combinare per 2 h a 20 ° C. Mescolare a 500 giri/min.
  10. Dializzare la soluzione utilizzando un tubo di dialisi di 12 kDa, mescolando la soluzione a 50 giri/min con un agitatore magnetico pernottamento in 500 mL di 50mm NH4HCO3 per rimuovere l'eccesso TCEP, NEM e urea.
  11. Spostare il flaconcino di reazione in un bagno di acqua a 37 ° C e mescolare a 750 giri/min.
  12. Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 0,66 mM.
  13. Immediatamente aggiungere 1 mL di soluzione di acido cloroaurico nel flaconcino di reazione e lasciar per mescolare per 2 min.
  14. Aggiungere 1 M NaOH fino a quando il pH della soluzione è 12 e lasciare che la soluzione di continuare a mescolare per 2 h.

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Risultati

Dalla fluorescenza del complesso BSA-Au(III), è stato osservato che la conversione della fluorescenza intrinseca blu di BSA (λem = 400 nm) a fluorescenza rossa (λem = 640 nm) si verifica a circa pH 9.7 attraverso un equilibrio transizione (Figura 1). EEM di BSA-Au(III) alle diversa BSA a rapporti molari Au è illustrato nella Figura 2, e questi dati mostrano come alterare i rapporti molari p...

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Discussione

I composti di BSA-Au(III) preparati a pH 12 presentano fluorescenza rossa ad una lunghezza d'onda di emissione di λem= 640 nm quando eccitato con raggi ultravioletti (UV) luce λex= 365 nm (Figura 1A). L'emergere di fluorescenza rossa è un processo lento e avrà un paio di giorni a temperatura ambiente per aumentare a un'intensità massima. In esecuzione della reazione a 37 ° C produrrà i risultati ottimali, anche se alta temperatura può essere utilizzato per prod...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

S.E. riconosce il sostegno dal fondo di Duke dotazione speciale iniziativa, fondo di Wells Fargo, PhRMA Foundation, nonché avvio fondi presso la University of North Carolina, Charlotte.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovina (BSA), 96%Sigma-AldrichA5611
cloruro d'oro (III) triidrato, 99,9%Sigma-Aldrich520918
cloruro di rame (II) diidrato, 99,999%Sigma-Aldrich459097
cloruro di nichel (II) esaidrato, 99,9%Sigma-Aldrich654507
N-etilmaleimmide (NEM), >99,0%Sigma-Aldrich4259
Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP), >98,0%Sigma-AldrichC4706
Idrossido di sodio, >98,0%Sigma-AldrichS8045
Urea, 99,5%Chem-Implex Int'l30142
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)CorningMT21040CV
Bicarbonato di ammonio, 99.5%Sigma-Aldrich9830

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