Qui presentiamo un protocollo che descrive la tecnica di ossigenazione extracorporea veno-venoso della membrana (ECMO) in un non intubati, spontaneamente la respirazione mouse. Questo modello murino di ECMO può essere efficacemente attuato in studi sperimentali di acuto e malattie polmonare di stadio finale.
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Articolo metodologico
Ossigenazione extracorporea veno-venoso in un Mouse
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso dell'ossigenazione extracorporea della membrana (ECMO) è aumentato sostanzialmente negli ultimi anni. ECMO è diventata una terapia efficace ed affidabile per acuto così come malattie polmonare di stadio finale. Con l'aumento della domanda clinica e l'uso prolungato di ECMO, ottimizzazione procedurale e la prevenzione del danno multi-d'organo sono di importanza critica. L'obiettivo di questo protocollo è di presentare una tecnica dettagliata di ECMO veno-venoso in un non intubati, respirazione spontanea del mouse. Questo protocollo viene illustrato il progetto tecnico del ECMO e la procedura chirurgica. Questo modello murino di ECMO faciliterà lo studio della fisiopatologia legata alla ECMO (ad es., infiammazione, eventi tromboembolici e sanguinamenti). A causa dell'abbondanza di topi geneticamente modificati, i meccanismi molecolari coinvolti in complicanze correlate alla ECMO possono anche essere sezionati.
Introduzione
Ossigenazione extracorporea della membrana (ECMO) è un sistema di supporto di vita temporanea che assume le funzioni dei polmoni e del cuore per consentire di aspersione e lo scambio di gas adeguata. Collina et al.1 descritto il primo uso di ECMO in pazienti nel 1972; Tuttavia, esso solo è diventato ampiamente usato dopo la sua applicazione successo durante la pandemia di H1N1 nel 20092. Oggi, ECMO è usato ordinariamente come una procedura salvavita in stadio finale cuore e polmone malattie3. ECMO veno-venoso è sempre più impiegato come alternativa alla ventilazione meccanica invasiva nel sveglio, non intubati, pazienti con guasto respiratorio refrattario4che respirano spontaneamente.
Nonostante la sua adozione diffusa, varie complicazioni sono state segnalate per ECMO5,6,7. Le complicazioni che possono essere sperimentate dai pazienti su ECMO comprendono sanguinamento, trombosi, sepsi, trombocitopenia, mancato funzionamento della periferica e l'embolia gassosa. Inoltre, una sindrome di risposta infiammatoria sistemica (SIRS) con conseguente danneggiamento del multi-organo è ben descritta sia clinicamente che in studi sperimentali8,9. Le complicazioni neurologiche quali infarto del cervello sono segnalate anche frequentemente in pazienti sottoposti a terapia a lungo termine di ECMO. Per confondere le questioni, spesso è difficile distinguere se le complicazioni sono causate da ECMO sé o derivano dai disordini di fondo che accompagna acuta e le malattie di stadio finale.
In particolare studiare gli effetti di ECMO su un organismo sano, deve essere stabilito un affidabile modello sperimentale animale. Ci sono molto pochi rapporti sulle prestazioni di ECMO su piccoli animali e sono tutti limitati ai ratti. Fin qui, nessun modello del mouse di ECMO è stato descritto nella letteratura. A causa della disponibilità di un gran numero di ceppi di topi geneticamente modificati, istituzione di un modello di topo ECMO consentirebbe ulteriore indagine dei meccanismi molecolari coinvolti in complicanze correlate alla ECMO10,11.
Basato sul nostro modello murino precedentemente descritto di esclusione cardiopolmonare (CPB)12, abbiamo sviluppato un metodo stabile di ECMO veno-venoso in non intubati, topi che respirano spontaneamente. Il circuito ECMO (Figura 1), contenente il deflusso e afflusso cannule, una pompa peristaltica, ossigenatore e serbatoio aria-intrappolamento, è simile al nostro modello precedentemente descritto di murino CPB12 ad eccezione di avere un innesco più piccolo volume (0,5 mL). Questo protocollo viene illustrato le tecniche dettagliate, monitoraggio fisiologico e analisi di gas del sangue coinvolta in una procedura riuscita di ECMO.
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati effettuati su topi C57BL/6 maschi, 12 settimane di età. Questo studio è stato condotto nel rispetto delle linee guida della legge animale tedesca sotto protocollo TSA 16/2250.
1. i materiali preparazione
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni non sterili, pulite. Condizioni di sterilità sarebbe necessarie se l'animale è di essere sopravvissuto postoperatorio.
- Introdurre 3 fenestrazioni in un tubo in poliuretano 2-Fr utilizzando una lama chirurgica sotto un microscopio con ingrandimento X 16.
Nota: Tutte le fenestrazioni devono trovarsi nel terzo distale della cannula per assicurare il drenaggio del sangue ottimale. - Preparare la soluzione di adescamento (Tabella materiali). Sono 30 IU/mL eparina e 2,5% v/v di una soluzione di 8,4% di NaHCO3. Refrigerare, questa soluzione a 4 ° C fino a quando è pronto per l'uso. Caricare il circuito con 500 µ l di soluzione di adescamento.
- Inserire la cannula di deflusso della soluzione di adescamento e riempire la macchina ECMO accendendo la pompa peristaltica. Continuano a circolare la soluzione di adescamento attraverso la macchina per il prossimo 30 min ad una portata di 1 mL/min.
- Dare 0,5 L/min di ossigeno 100% per l'ossigenatore.
2. anestesia
- Posto l'animale in una camera di induzione riempito con una miscela di ossigeno/isoflurano 2,5% v/v. Forniscono 0,5 L/min di ossigeno 100% per il vaporizzatore. Prima dell'intervento, verifica che l'anestesia completa avviene mediante test pedali riflessi ritiro e dolore. Applicare il gel occhio per evitare danni di essiccazione.
- Utilizzare un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
- Eseguire anestesia maschera di inalazione utilizzando un vaporizzatore di isoflurano e iniettare il carprofen 5 mg/kg per via sottocutanea.
- Osservare il respiro spontaneo e regolare la concentrazione di isoflurano in modo che sia tra 1.3 e 2,5% regolarmente.
3. chirurgia
- Esporre la vena giugulare di sinistra tramite un'incisione cutanea laterale di 4 mm con l'aiuto di forbici bene sul lato sinistro del collo. Insieme a sharp e smussato preparazione utilizzando tamponi di cotone e micro-forcipe, utilizzare coagulazione bipolare dei piccoli vasi.
- Una volta che la vena giugulare di sinistra è esposto, legare la parte distale utilizzando una sutura seta 8-0 con l'aiuto di micro-forcipe.
- Posto un nodo scorsoio all'estremità prossimale della vena. Incidere la parete anteriore della vena utilizzando micro-forbici.
- Per raggiungere eparinizzazione completa, iniettare l'eparina 2,5 IU/g nella vena giugulare tramite un braunula 26 G.
- Sollevare il lato testa del pad animale di 30° per evitare l'eccessiva perdita di sangue dalla vena durante l'inserimento della cannula.
- Inserire una cannula di 2-Fr in poliuretano (PU) nella parte prossimale della vena giugulare, ruotandolo leggermente e contemporaneamente spingerlo ad una profondità di 4 cm; mentre così facendo, si otterrà la biforcazione iliaca della vena cava inferiore (IVC).
- Fissare la cannula con nodi di seta 8-0 utilizzando Micropinze.
- Esporre la vena giugulare di destra utilizzando la procedura descritta in 3.1, 3.2 e 3.3.
- Incannulare la vena giugulare di destra con una cannula di PU 1-Fr e spostarlo delicatamente 5 mm nella direzione dell'atrio di destra.
- Ripetere il punto 3.7.
- Cateterismo l'arteria femorale di sinistra con un'altra cannula di PU 1-Fr e utilizzarlo per pressione invasiva monitoraggio così come il prelievo di sangue per analisi di gas del sangue (BGA).
- Inserire aghi elettrocardiogramma (ECG) collegati ad un dispositivo di acquisizione dati per via sottocutanea in entrambi gli arti anteriori e nella parete toracica sinistra.
- Inserire un termometro rettale connesso a un dispositivo di acquisizione dati.
4. ossigenazione extracorporea a membrana Veno-venoso e l'emogasanalisi
Nota: Per un schema del circuito ECMO completo, vedere la Figura 1.
- Avviare ECMO sull'animale attivando la pompa con una portata di iniziale di 0,1 mL/min regolare la portata della pompa entro il prossimo 2 min a 3-5 mL/min.
- In caso di aspirazione di aria nella cannula deflusso tramite il sito di inserimento di una canula, ridurre il flusso e aggiungere 0,1 mL di soluzione di innesco al circuito tramite un serbatoio di intrappolamento dell'aria.
- Sotto flusso stabile, continuare a monitorare in tempo reale tutti i parametri vitali tramite il dispositivo di acquisizione dati.
- Costantemente osservare riflusso da drenaggio venoso e monitorare il livello del sangue nel serbatoio aria-trapper.
- Raccogliere qualsiasi fuoriuscita dalle ferite in una siringa da 1 cc con la punta di un 24 G branula andreturn esso al circuito ECMO tramite il serbatoio dell'aria-intrappolamento di sangue.
- Per BGA, utilizzare una cartuccia di campionamento di sangue per raccogliere circa 75 µ l di sangue arterioso presso i seguenti punti di tempo e dai seguenti percorsi:
- 10 min dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere i campioni da IVC tramite un tubo supplementare costruito prima l'ossigenatore, via simile tubo supplementare dopo ossigenatore (controllo) e direttamente dall'arteria femorale.
- 30 min dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere sangue dall'arteria femorale.
- Dare un extra 0,1 mL di soluzione di adescamento per compensare la perdita di liquido intravasal ogni 45 minuti via l'aria-trapper del catetere dell'arteria femorale o succhiare le bolle di aria attraverso la cannula di drenaggio del sangue.
- Per BGA, utilizzare una cartuccia di campionamento di sangue per raccogliere circa 75 µ l di sangue arterioso:
- 1 h dopo l'inizio dell'ECMO dall'arteria femorale.
- 2 h dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere i campioni da IVC tramite un tubo supplementare costruito prima l'ossigenatore, via simile tubo supplementare dopo ossigenatore (controllo) e direttamente dall'arteria femorale.
- Dopo 2 h, ridurre la portata della pompa gradualmente (nel corso di 5 min), quindi arresto ECMO.
- Continuare a registrare i parametri vitali per altri 10 min.
- Finire l'esperimento da exsanguinating l'animale e la raccolta del sangue e degli organi.
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Risultati
Questo protocollo descrive il metodo di ECMO veno-venoso in un mouse. Questo modello è affidabile e riproducibile e rispetto al nostro modello precedentemente descritto del CPB con arresto respiratorio e circolatorio12,13, è tecnicamente meno esigente stabilire.
Flusso ECMO nel sistema venoso è stata mantenuta tra 1,5 e 5 mL/min. La pressione arteriosa media è stata mant...
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Discussione
In precedenza, abbiamo descritto un modello di successo di CPB in un mouse12,13. Per implementare tale modello per acuto o disordini del polmone stadio finale abbiamo sviluppato un circuito ECMO veno-venoso easy-to-use per i topi. Diversi al modello CPB, veno-venoso ECMO non richiede complicate procedure chirurgiche quali sternotomy e la pressione dell'aorta, riducendo così il rischio di ferita sanguinante in un animale completamente eparinizzato. Per evitare il ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto da KFO 311 sovvenzione Deutsche Forschungsgemeinschaft.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 con Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 con Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 UI per ml di soluzione di primer |
| NaHCO3 8,4% | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in soluzione di primer |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| Catetere PU da 1 Fr | Instechlabs INC., USA | Arteria carotidica | C10PU-MCA1301 |
| Catetere PU da 2 Fr | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | vena giugulare |
| 8-0 Sutura di seta intrecciata | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | legatura |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosi |
| Forbici a molla - Lame da 6 mm | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | strumenti |
| Forbici a molla - Lame da 2 mm | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | strumenti |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | strumenti |
| Dumont #55 Pinze | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | strumenti |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | strumenti |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | strumenti |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | strumenti |
| Isoflurano Vaporizzatore Dräger 19.1 | Dott. gerwerk AG & Co. KGaA | anestesia 1,3 -2,5% | |
| Dispositivo multicanale per l'acquisizione dei dati con software ISOHEART | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germania | pressione invasiva, ECG, t ° Dispositivo | |
| portatile C i-STAT | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | analisi dei gas ematici | |
| cartucce i-STAT CG4+ e CG8+ | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | analisi dei gas ematici | |
| C57Bl/6 topi, maschio, 30 g, 14 settimane | di età Charles River Laboratories | alloggiato 1 settimana prima |
Riferimenti
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659(2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150(2016).
- Esper, S. A. Extracorporeal Membrane Oxygenation. Advances in Anesthesia. 35 (1), 119-143 (2017).
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387(2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316(2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51(2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
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