Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Sommario

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Abstract

Studiare il regolamento del fagosoma richiede metodi che sono in grado di quantificare con precisione l'assorbimento delle cellule apoptotiche e per sondare i processi di segnalazione e cellulari che controllano fagosoma. Questa quantificazione può essere difficile da eseguire, come le cellule apoptotiche sono spesso efferocytosed frammentario, così necessitando metodi che possono delineare con precisione fra la parte di efferocytosed di un target di apoptotic contro residuo unengulfed cellulare frammenti. L'approccio descritto nel presente documento utilizza approcci dual-etichettatura per quantificare con precisione la dinamica della capacità fagosoma ed efferocytic di efferocytes quali i macrofagi. Il citosol della cellula apoptotica è marcati con un colorante di cella-tracking per abilitare il monitoraggio di tutti i materiali di derivati da cellule apoptotiche, mentre superficie biotinilazione della cellula apoptotica consente una differenziazione tra interiorizzata e non interiorizzato frazioni di cellule apoptotiche. La capacità di efferocytic di efferocytes è determinata prendendo immagini fluorescenti delle cellule dal vivo o fisse e quantificare l'importo limite contro bersagli interiorizzati, come differenziato dalla macchiatura streptavidina. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto a metodi quali la citometria a flusso, vale a dire la precisa delineazione di non efferocytosed contro efferocytosed apoptotica frazioni cellulari, la capacità di misurare efferocytic dinamica da microscopia di cellule vive e la capacità di eseguire studi di segnalazione cellulare in cellule che esprimono transgeni fluorescente etichettati. I metodi descritti in questo protocollo combinato, servono come base per un approccio sperimentale flessibile che può essere utilizzato per quantificare con precisione efferocytic attività e interrogare le vie di segnalazione cellulare attive durante fagosoma.

Introduzione

L'apoptosi, o morte programmata delle cellule, è un processo fisiologico altamente regolamentato che si verifica nella maggior parte degli organismi multicellulare ed è cruciale per il loro sviluppo e omeostasi¹. Oltre a essere coinvolti nel turnover cellulare normale e lo sviluppo embrionale, apoptosi consente l'eliminazione delle cellule infette o danneggiate dai tessuti e possono essere attivato in risposta all'infezione, infiammazione, tumore e anche di interventi medici ad esempio, la radioterapia o steroidi¹. Le cellule apoptotiche espongono "mangiare-me" segnali sulla superficie cellulare che vengono riconosciuti ....

Protocollo

Raccolta di sangue dai volontari sani è stato approvato dal comitato di etica in salute scienza ricerca della University of Western Ontario. Il prelievo è stato effettuato conformemente agli orientamenti della Tri-Consiglio informativa sulla ricerca umana.

1. la cultura e la preparazione della linea cellulare di monociti THP-1

1. Monociti THP-1 di cultura come una coltura di sospensione in matracci T25 a 37 ° C + 5% CO₂. Le cellule devono essere coltivate in 5 mL di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% siero bovino fetale (FBS).
2. Le celle di sospensione ogni giorno in modo uniforme in tu....

Risultati

Una notte di cultura delle cellule Jurkat con risultati di staurosporine 1 µM in apoptosi di > 95% delle cellule, che possono essere confermate con Annessina V macchiatura (Figura 1). Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per questi esperimenti, anche se la concentrazione di staurosporine e la durata del trattamento staurosporine dovranno essere ottimizzati per ogni linea cellulare. Per un rilevamento affidabile e la quantificazione del fagosoma,.......

Discussione

I metodi descritti in questo protocollo permettono la formazione immagine e la quantificazione del processo dinamico efferocytic, utilizzando approcci sia fisso-cellula e cellule vive. Questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto ai metodi basati su citometria a flusso comunemente impiegate^23,24. L'uso di dentro-fuori la macchiatura con campioni fissati fornisce una più robusta e precisa quantificazione del tasso e l'entità del fagosoma — infatti, molti meto.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Siero fetale bovino (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
Vetrini coprioggetti circolari in vetro da 18 mm spessore #1.5 Microscopia	elettronica Sciences	72290-08	Le dimensioni e la forma del vetrino coprioggetti non sono critiche, ma 18 mm si inseriscono nei pozzetti di una piastra standard a 12 pozzetti che semplifica la coltura cellulare
Staurosporina	Cayman Chemical	81590	Dissolvere in DMSO a 1 mM (1.000x soluzione madre)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Conservare in un dessicator. Non preparare una soluzione stock.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Terreno di seprazione di cellule linfoliti-poli	Cedarlane Labs	CL5071
M-CSF umano ricombinante	Peprotech	200-04
IL-4 umano ricombinante	Peprotech	300-25
J774.2 Linea cellulare di macrofagi	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Linea cellulare di monociti umani	ATCC	TIB-202
Linea cellulare Jurkat T	ATCC	TIB-152