Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Il glomerulo è un ciuffo altamente specializzato di capillari responsabili per la filtrazione del plasma in circolazione. Esso costituisce l'inizio del nefrone, che è l'unità di base funzionale del rene. Funzione glomerulare è definita da un endotelio capillare fenestrato in modo univoco, il diaframma a fessura dei podociti e un'intervento della membrana dello scantinato. Questi strati formano una barriera semipermeabile per consentire l'escrezione selettiva delle sostanze nel filtrato. Acqua, ioni e altre piccole molecole in genere passano attraverso, mentre più grandi molecole vengono mantenute nel plasma. Podociti sono cellule epiteliali specializzate che si sviluppa su membrana dello scantinato, che circondano i vasi capillari con le proiezioni citoplasmiche note come processi di piede. Il piede elabora dei podociti adiacenti interdigitazione e è attraversato da fessura diaframmi composto da proteine quali Nefrina, podocina, P-caderina e ZO-1¹. In sezione trasversale, questi piedi processi sono organizzati uniformemente sopra la membrana dello scantinato. In glomeruli malati, i processi di piedi diventano grossolanamente anormale o "cancellate", conduce a perdita anormale di contenuto del plasma il filtrato. Come tale, il danno glomerulare è generalmente caratterizzata dalla presenza di anormalmente grandi quantità di proteine (ad es., proteinuria) e/o globuli rossi (ad es., ematuria) nelle urine. Inoltre, feriti podociti perdono espressione di Nefrina, nonché suo regolatore Wilms tumore 1 (WT1), una proteina chiave responsabile della manutenzione di differenziazione^2,3. I glomeruli sono un obiettivo primario di danno in nefropatia diabetica e altre glomerulonefriti come malattia minima del cambiamento, la nefropatia membranous e glomerulosclerosis segmentale focale. Queste malattie sono le principali cause di insufficienza renale progressiva e lo sviluppo della malattia renale di stadio finale, una condizione in cui la sopravvivenza si basa su dialisi o trapianto renale. Pertanto, è importante studiare glomeruli per comprendere meglio la patologia (CKD) la malattia renale cronica.

Un sistema di coltura cellulare è fondamentale per studiare biologia glomerulare. Dovuto il suo ruolo centrale nella generazione il diaframma a fessura, come pure l'esistenza di malattie specifiche proteinuric dovuto le mutazioni di proteine di membrana fessura, molta ricerca è comprensibilmente utilizzato Podocita in isolamento. Questo ha portato alla generazione di linee cellulari primarie Podocita a utilizzare in vitro. Queste cellule possono essere coltivate in una varietà di condizioni e possono essere coltivate anche su supporti permeabili per valutare la permeabilità⁴. Tuttavia, l'isolamento delle cellule di proliferazione spesso seleziona cellule dedifferentiated che hanno perso parte della loro indicatori del Podocita. Questo ha portato alla generazione di podociti condizionalmente immortalizzata derivata da un ceppo di topi transgenici che trasportano un mutante termosensibile SV40 grande T del gene di (ad es. immortomouse), che poteva essere sviluppato nella cultura, ma anche essere differenziato per esprimere una gamma completa di Podocita marcatori⁵. Questi metodi di coltura primaria sono stati fondamentali nella comprensione Podocita biologia^4,6,7.

Tuttavia, mancano di colture contenenti tipi di singola cellula le relazioni intercellulari che si verificano in vivo come pure la struttura di supporto e matrici e monostrati di queste cellule non necessariamente ricapitolare il tridimensionale architettura dei glomeruli. I podociti immortalata anche possono essere ingombrante e impegnativo di cultura⁸e richiedono il possesso di entrambi i immortomouse o stabilita un'aliquota iniziale delle cellule da investigatori per iniziare. Ulteriormente, il glomerulo è costituito non solo podociti, ma anche cellule endoteliali dei capillari e la membrana basale, nonché cellule mesangial che forniscono il supporto per la struttura. Pertanto è utile sviluppare un ex vivo approccio disponibile per tutti gli investigatori per lo studio dei glomeruli intatti che mantengono la loro architettura nativa, nonché a tutte le cellule che costituiscono il glomerulo normale.

Nel 1958, Cook e Pickering descritto il primo isolamento dei glomeruli dal rene coniglio. Dopo le osservazioni che gli emboli grassi è diventato presentati in glomeruli, hanno postulato che le particelle delle stesse dimensioni potrebbero essere utilizzate per isolare in modo specifico queste strutture. Infatti, l'infusione di particelle di ossido di ferro nel rene ha portato alla cattura di queste particelle in glomeruli. Dopo dissociazione meccanica e setacciatura del rene, i glomeruli potrebbero essere isolati intatti e con purezza attraverso l'uso di separazione magnetica⁹. Nel 1971, Misra ha dimostrato che l'ossido di ferro potrebbero essere omessa infusioni e glomerulare isolamento realizzato con setacciatura di umani macinati, cane, ratto o coniglio rene tessuto¹⁰. Questa tecnica è stata modificata dall'allora a seconda l'obiettivo degli investigatori ma essenzialmente ha provocato le preparazioni purificate che potrebbe essere ulteriormente studiato o da cui colture cellulari primarie potrebbero essere stabilito^{11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}.

Qui descriviamo un protocollo per l'isolamento dei glomeruli intatti praticabili dal rene del ratto. L'intero protocollo richiede solo poche ore. Anche se essi non proliferano, piani sperimentali di qualsiasi dimensione possono essere supportati semplicemente aumentando il numero dei reni come materiale di partenza. Mentre ci sono protocolli pubblicati per la separazione di biglie magnetiche dei glomeruli, richiedono un'iniezione endovenosa di perline, sono più costosi e possono alterare la biologia poiché le perle vengono mantenute sia dai glomeruli in coltura o richiedono glomerulare" Lisi"e la rimozione di centrifugazione¹⁹. Rispetto ai glomeruli del mouse, il più grande dei glomeruli di ratto (quasi 100 µm in due mesi ratti¹⁸) lo rende molto più facile di separarli dalle altre strutture del rene usando una semplice tecnica di setacciamento.

Come prova della loro utilità, abbiamo caratterizzato i glomeruli per illustrare i diversi tipi cellulari. Essi possono anche essere esposti ad agenti conosciuti per ferire glomeruli in vivo e dimostriamo gli effetti contrari di solfato di protamina (PS) su queste culture. PS è un polycation che neutralizza i siti anionici lungo la parete capillare glomerulare²⁰. Questa neutralizzazione ha un effetto drammatico sulla barriera di filtrazione glomerulare e quindi aumenta il effacement processo proteinuria e piede. Questi glomeruli possono essere valutati con immunoblots per proteine chiave quali Nefrina e WT1 per valutare la salute generale. Inoltre, la loro struttura può essere valutata con luce, immunofluorescenza e microscopia elettronica.

Nel complesso, questo protocollo è accessibile alla maggior parte dei ricercatori (uno ha bisogno solo di raggiungere gli animali e alcune attrezzature semplici). Con caratteristiche morfologiche lasciate intatte, il ricercatore è in grado di analizzare i glomeruli e vedere come gli altri tipi di cellula importante e conservazione di matrice nei glomeruli colpire la funzione e la malattia progressione, una lacuna del Podocita culture.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh.

1. isolamento dei Glomeruli di ratto

1. Per preparare un tampone sterile di isolamento 1%, aggiungere 5 g di albumina di siero bovino (BSA) in un becher da 600 mL.
   1. Aggiungere 500 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x Becher e mescolare con una bacchetta magnetica, fino a quando tutti i BSA è dissolto.
   2. Filtro sterile il buffer di PBS/BSA 1% in una cappa di cultura cellulare.
      Nota: Il sterile tampone PBS/BSA 1% può essere conservato a 4 ° C per fino ad una settimana.
2. Ottenere 2 a 4 ratti Sprague-Dawley pesa 150-200 g ciascuno.
   1. Eutanasia ratti via anidride carbonica inalazione tramite un alloggiamento in cui 100% anidride carbonica è stato introdotto ad un tasso del 10-30% il volume della camera al minuto. Osservare gli animali per la cessazione della respirazione e sbiadito colore degli occhi prima della rimozione dal biossido di carbonio.
   2. Preparare la pelle sopra l'addome anteriore con etanolo al 70% e utilizzare il tagliacapelli per rimuovere i capelli, se lo si desidera. Fare un'incisione del midline nella pelle utilizzando forbici o bisturi. Fare un'altra incisione mediana attraverso lo strato muscolare per esporre gli organi interni. Estendere l'incisione superiormente attraverso il diaframma e sterno o gabbia toracica come un metodo secondario dell'eutanasia.
   3. Isolare e rimuovere entrambi i reni e collocare in un tubo conico in plastica sterile 50ml con 30 mL di soluzione salina tamponata Hanks' (HBSS) sul ghiaccio.
      Nota: Alcuni ratti possono essere euthanized nella stessa camera e tutti i reni possono essere collocati nello stesso tubo conico.
3. Mantenere i reni su ghiaccio e trasporto per un cappuccio di cultura di cellule sterili. Trasferire i reni di una capsula di Petri sterile contenente 5 mL di HBSS, anche sul ghiaccio e rimuovere e scartare il grasso perirenale con forbici e taglienti forcipe. Se ancora presente, anche rimuovere e scartare la capsula che circonda il rene facendo una piccola incisione superficiale e quindi utilizzare pinze taglienti per tirarlo delicatamente lontano l'organo.
   Nota: Tenere sempre il rene isolati su ghiaccio e pratica tecnica sterile in tutto. Un pezzo di garza sterile può essere messo in di Petri come una superficie strutturata per tenere il rene in posizione durante la manipolazione.
   1. Tagliare i reni a metà nel senso della lunghezza (sezione sagittale) e rimuovere e gettare il midollo (che è di colore più scuro) con un bisturi in una seconda capsula Petri con 5 mL di HBSS.
   2. Trasferire i pezzi restanti, che sono prevalentemente corticale del rene, in un terzo di Petri con 5 mL di HBSS e tritateli con una lama di rasoio sterile fino a quando i pezzi sono di dimensione inferiore a 1 mm, o fino a formare una pasta.
4. Bagnare la parte superiore e inferiore di un setaccio 180 µm con 1% BSA/PBS sopra un becher rifiuti da 500 mL. Questo passaggio è fondamentale quanto cappotti il setaccio con proteine e riduce l'aderenza dei glomeruli, che migliorerà il rendimento.
5. Posizionare la corteccia macinata su un piccolo bordo del setaccio e utilizzare la flangia martellata stantuffo (lato opposto la guarnizione in gomma) di una siringa da 10 mL in poltiglia il tessuto attraverso il setaccio in una vaschetta di fondo che si siede sul ghiaccio. Lavare periodicamente con HBSS, ma utilizzare il meno possibile per evitare la diluizione del campione.
   Nota: Non superare 30 mL di totale di buffer, quindi solo 25 mL di più può essere usato qui. Il motivo per l'immissione il tessuto macinato in un solo bordo del setaccio è quello di ridurre l'aderenza dei glomeruli limitando l'esposizione di parte del setaccio, piuttosto che l'area della superficie intera setaccio.
   1. Per facilitare questo, riutilizzare il fluido raccogliere in padella per sciacquare il setaccio inferiore. Una volta completata la setacciatura, lavare accuratamente la parte inferiore del setaccio ancora una volta con buffer di PBS/BSA 1% dal fondo della padella per catturare qualsiasi glomeruli che possono essere liberamente aderiti.
   2. Raccogliere tutto il liquido nella vaschetta inferiore in parecchie siringhe da 10 mL con aghi di 20 G e farlo passare attraverso l'ago almeno 2 volte. L'ultima collezione, mantenere il liquido che contiene dei glomeruli nella siringa fino al momento di passare attraverso il setaccio 90 µm.
6. Mentre il liquido viene memorizzato nelle siringhe, lavare la vaschetta inferiore mediante flussaggio con 1% BSA/PBS in rifiuti Becher e bagnato la parte superiore e inferiore di un setaccio 90 µm con 1% BSA/PBS. Collocare il setaccio sopra la vaschetta inferiore sul ghiaccio.
   1. Applicare il campione nelle siringhe a un bordo del setaccio e poltiglia attraverso il setaccio con un'altra flangia siringa come descritto sopra. Lavare con soluzione dalla vaschetta inferiore di raccogliere tutto ciò su un bordo del setaccio.
   2. Una volta setacciatura è completa, lavare accuratamente la parte inferiore del setaccio come descritto al punto 1.5.1. Raccogliere tutto il liquido nella vaschetta inferiore in un tubo conico plastica da 50 mL.
7. Lavare la vaschetta inferiore con 1% BSA/PBS in un becher di rifiuti e bagnato la parte superiore e inferiore di un setaccio di 75 µm con 1% BSA/PBS. Collocare il setaccio sopra la vaschetta inferiore sul ghiaccio.
   1. Applicare il campione a un bordo del setaccio. Liquido deve fluire attraverso facilmente. Sciacquare attraverso la parte superiore con almeno 20 mL di 1% BSA/PBS in Becher dei rifiuti. Lavare accuratamente la parte inferiore del setaccio pure. Glomeruli rimarrà sulla cima di questo setaccio 75 µm.
   2. Utilizzare HBSS per raccogliere dei glomeruli in una capsula Petri di lavaggio attraverso il setaccio capovolto. Utilizzare qui tanto HBSS come necessario. Raccogliere in uno o più 50 mL provette coniche in plastica sul ghiaccio.
8. Centrifugare a 1800 x g per 5 min a 4 ° C, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in 10 mL di HBSS freddo. Combinare i campioni se più provette coniche sono stati raccolti in 1.7.2. Ripetere il passaggio di centrifugazione.
9. Risospendere i glomeruli in 5 mL di HBSS fino al momento di procedere al passaggio successivo.
10. Se lo si desidera, è possibile prendere un conteggio dei glomeruli totali. Per questo, prendere un 10 µ l di campione con una pipetta e la goccia su un vetrino. Mostra sotto un microscopio, contare i glomeruli nel campo e moltiplicare per 500 per ottenere la resa totale.
    Nota: Purezza può essere determinato dal conteggio del numero di tubuli visto nel campo e dividendo per il numero totale di glomeruli e tubuli strutture. Ci dovrebbe essere > 95% dei glomeruli nel campo visivo.
    1. Se non esiste una significativa contaminazione tubolare, ripetere i passaggi 1.6.1 in avanti e assicurarsi di lavare accuratamente quando completando passo 1.7.1. Questo è il passo in cui tubolare contaminazione è più probabile si verifichi.

2. lesioni dei Glomeruli

1. Raccogliere i glomeruli in una provetta conica da 15 mL in plastica e spin giù a 200 x g. Risospendere in una quantità appropriata di HBSS basato sul rendimento totale in modo che ci siano circa 9.000 glomeruli per pozzetto. Pipettare 450 µ l di campione in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, o qualsiasi formato del piatto che si adatta a valle dosaggi richiesti.
   Nota: Su e giù il pipettaggio per mescolare glomeruli nel buffer assicura una soluzione omogenea. Glomeruli sono molto appiccicoso e pesante e saranno bastone a vicenda così come depositano sul fondo di una soluzione rapidamente e sui lati del tubo.
2. Per rendere protamina 6 mg/mL di solfato soluzione (PS), prima di sciogliere 1 g di PS in 10 mL di dH2O riscaldata a 40 ° C in una provetta conica da 15 mL in plastica e vortexare completamente. Prendere 30 µ l della soluzione e aggiungere a 470 µ l di dH2O.
   Nota: Questo produrrà una soluzione di 6 mg/mL, e quando vengono aggiunti 50 µ l del pozzo come descritto di seguito, la concentrazione finale è di 0,6 mg/mL.
   1. In duplice copia, aggiungere 50 µ l di solfato di protamina (si tratta di un 01:10 diluizione) in ogni pozzetto di un gruppo, pur fornendo un altro gruppo 50 µ l di HBSS (controllo negativo).
3. Incubare la piastra per 4 h a 37 ° C.
4. Rotazione verso il basso contenuto di ogni pozzetto in un tubo del microcentrifuge (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e lavare due volte con 1 mL di PBS ciascuna.
5. Aspirate fuori il lavaggio finale e risospendere in 300 µ l di PBS. Dividere in tre aliquote di essere preparati per isolamento della proteina, visualizzazione di microscopio elettronico (TEM) di trasmissione e immunofluorescenza che macchia (se).

3. preparazione dei Glomeruli per analisi

1. Rotazione verso il basso il contenuto delle tre aliquote (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e aspirato rimanenti tampone e procedere all'analisi dei campioni di TEM, se, o l'isolamento di proteine.
2. Elaborazione per TEM
   1. Difficoltà pellet glomerulare in 150 µ l di freddo 2,5% glutaraldeide in PBS 0,01 M. Rimuovere con cautela il fissativo dal pellet utilizzando una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare il pellet, quindi sciacquato con PBS e post-fissare in tetrossido di osmio 1% con ferricianuro di potassio 1%.
   2. Disidratare il campione attraverso una serie graduata di etanolo (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) e ossido di propilene quindi incorporare in resina epossidica incorporamento materiale.
   3. Taglio semi-sottile (300 nm) sezioni su un ultramicrotomo. Con 0,5% si colorano di blu di toluidina in 1% sodio borato ed esaminarli al microscopio luce.
   4. Tagliare sezioni ultrasottili (65 nm), li macchia con acetato di uranile e citrato di piombo di Reynold ed esaminare un microscopio elettronico a trasmissione.
3. Elaborazione per se
   1. Aggiungere 150 µ l di un 12% di gelatina in soluzione PBS e collocare immediatamente il ghiaccio secco per formare una pallina. Immergere il pellet in 500 µ l di 2% paraformaldeide/1 x PBS in un tubo del microcentrifuge durante la notte a 4 ° C.
   2. Posizionare la pallina in uno stampo base e incorporare aggiungendo il mezzo di temperatura (OCT) di taglio ottimale su ghiaccio secco. Tagliare 5-10 µm sezioni su un cryotome e procedere con l'immunofluorescenza/immunohistochemistry o macchie istologiche standard.
4. Per l'isolamento di proteine
   1. Aggiungere 150 µ l di tampone RIPA a pellet centrifugato glomerulare con 1,5 µ l di inibitore della proteasi e lisata con omogeneizzatori tessuto.
   2. Procedere alla quantificazione della proteina e immunoblotting o altre analisi di proteine.

Il protocollo dal momento dell'eutanasia per isolamento dei glomeruli può essere completato in appena 2 ore e ha un alto rendimento ed efficienza. Utilizzazione adeguata della tecnica, la resa dei glomeruli al rene del ratto intervalli da 6.000-10.000 glomeruli quando si inizia con 8 reni. La sospensione finale è densamente imballata con glomeruli ed ha complessivamente purezza > 95%, mostrando la contaminazione minima da segmenti tubolari o altri tipi di cellule (Figura 1A, B). Inoltre, i glomeruli OCT-incorporato possono essere colorati con ematossilina ed eosina (H & E) macchie per vedere la morfologia (Figura 1C). Questi glomeruli mantengono la loro struttura durante l'intero protocollo, anche dopo l'elaborazione. Dimostriamo che isolati glomeruli possiedono intatte e vitali podociti (Figura 2A), le cellule mesangiali (Figura 2B) e cellule endoteliali (Figura 2C).

Una volta isolato, glomeruli possono essere esposti a lesioni ben note chimiche per simulare la patologia in vivo . In questo caso, solfato di protamina (PS) è stato scelto per la sua capacità di interferire con la carica della barriera di filtrazione glomerulare, che alla fine conduce al piede processo effacement. PS-trattati dei glomeruli hanno una riduzione notevole Nefrina (rosso) e un numero di nuclei positivi per WT1 (verde) tramite immunofluorescenza (Figura 3A, B). Glomeruli possono anche essere preparati per microscopia elettronica di trasmissione (Figura 3C). Campioni di controllo hanno morfologia normale Podocita e processi del piede mentre i glomeruli PS-trattati hanno piede il effacement processo (Figura 3D), che è un segno di disfunzione del Podocita ed è visto in modelli in vivo utilizzando PS21. Ciò ha corrisposto anche ad una diminuzione della Nefrina rilevato dall'immunoblotting (Figura 3E, F).

Per determinare la redditività, caspase-3 fenduto è stata valutata come un marker di apoptosi. Utilizzando l'immunofluorescenza, caspase-3 fenduto prima appare in alcune cellule a partire 2 h dopo l'isolamento (Figura 4). Il numero delle cellule che esprimono questa proteasi è diventato più abbondante nel corso del tempo, con i livelli elevati visti a 24 e 48 h. Ciò suggerisce che il apoptosis si presentano relativamente presto nella cultura e che applicazioni a valle devono essere eseguite subito dopo isolamento per ottenere i migliori risultati.

Figura 1 . Aspetto tipico delle culture glomerulare del ratto dopo isolamento. (A) immagine di campo chiaro della cultura glomerulare. Anche se abbiamo scelto un campo in cui c'è un singolo tubulo renale in questa microfotografia (punta di freccia), le colture ottenute sono generalmente > 95% puro. Barra della scala è uguale a 100 µm. (B) immagine allargata di un singolo glomerulo. (C) macchia dell'eosina e di un singolo glomerulo. Barre della scala in B e C uguale a 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Tipi di cellule costituenti vengono mantenuti in glomeruli isolati. Microscopia di immunofluorescenza confocale è stata effettuata per Nefrina (rosso, podociti) e marcatori di cellula-specifico per identificare podociti, cellule mesangiali e l'endotelio. (A) Costain per Nefrina e WT1 (verde, podociti). (B) Costain per Nefrina e PDGFR-β (verde, cellule mesangiali, freccia). (C) Costain per Nefrina e CD31 (cellule endoteliali, verde, vasi in sezione trasversale contrassegnato da frecce). Barra della scala = 25 µm su tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Podocita ferita può essere indotta in vitro utilizzando dei glomeruli isolati del ratto. (A) la microscopia di immunofluorescenza confocale per Nefrina e WT1 in una coltura glomerulare non trattata. Si noti la Nefrina lineare colorazione (rosso) e la presenza di nuclei di WT1-positivo (verde) che in genere si vedono quando ci sono sano podociti. (B) dopo protamina solfato trattamento, espressione di Nefrina è in diminuzione e non-lineare e WT1 è assente, che indica lesioni Podocita. (C) che Mostra immagine di trasmissione elettrone microscpy (TEM) piede processi, membrana basale e un endotelio fenestrato tipico della normale struttura glomerulare. Barra è uguale a 500 nm. (D) dopo solfato di protamina, processi pedicellari sono allungati o allungati (frecce), che indica lesioni Podocita. (E) Western blot per Nefrina risultati diminuiti Nefrina dopo trattamento di solfato di protamina. Viene visualizzata la finestra di actina (F) caricamento di controllo per la macchia occidentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 . Valutazione di attuabilità delle cellule in glomeruli isolati. Microscopia di immunofluorescenza confocale per caspase-3 fenduto (verde) è stata eseguita. Una co-macchia di Nefrina è stata effettuata per individuare facilmente i glomeruli. Mentre non c'era nessuna positività fendute caspase-3 a 0 e 1 h dopo l'isolamento dei glomeruli, la segnale di fluorescenza in alcune cellule è stato notato a 2 h. progressivamente che più celle torna positivo il più a lungo dopo l'isolamento che sono stati esaminati. Il maggior numero di cellule positive di caspase-3 sono stato notato a 24 e 48 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.