Method Article

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

DOI:

10.3791/58176

⸱

August 24th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

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Qui, presentiamo un protocollo per la cultura tridimensionale delle cellule di glioblastoma paziente-derivato all'interno di biomateriali ortogonalmente sintonizzabile progettate per imitare la matrice di cervello. Questo approccio fornisce un in vitro, una piattaforma sperimentale che mantiene molte caratteristiche in vivo delle cellule di glioblastoma in genere perdite nella cultura.

Abstract

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Glioblastoma (GBM) è il più comune, ancora più letale, il cancro del sistema nervoso centrale. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su come la matrice extracellulare (ECM) dell'ambiente unico cervello, come l'acido ialuronico (HA), facilita l'invasione e la progressione di GBM. Tuttavia, la maggior parte dei modelli in vitro cultura includono cellule di GBM all'esterno del contesto di un ECM. Murini xenotrapianti di cellule di GBM sono utilizzati comunemente come pure. Tuttavia, in vivo modelli rendono difficile isolare i contributi delle singole caratteristiche del microambiente tumorale complesso comportamento del tumore. Qui, descriviamo una piattaforma di base di idrogel, tridimensionale (3D) cultura HA che permette ai ricercatori di alterare in modo indipendente rigidità e concentrazione dell'HA. Ad alto peso molecolare HA e polietilenglicole (PEG) comprendono gli idrogel, che sono reticolate tramite aggiunta di Michael-tipo in presenza di cellule vive. Idrogel 3D culture della paziente-derivato GBM cellule Mostra vitalità e proliferazione prezzi buono come o meglio di, quando coltivate come standard gliomaspheres. Il sistema di idrogel permette inoltre di incorporazione di peptidi ECM-mimetici per isolare gli effetti delle interazioni cellula-ECM specifici. Idrogeli sono otticamente trasparenti in modo che le cellule vive possono essere imaged in 3D cultura. Infine, HA idrogel culture sono compatibili con le tecniche standard per analisi molecolari e cellulari, tra cui PCR, Western blotting e cryosectioning seguita da immunofluorescenza.

Introduction

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Sistemi tridimensionali (3D) cultura ricapitolano le interazioni tra cellule e loro circostante matrice extracellulare (ECM) nei tessuti nativi meglio di loro bidimensionale (2D) controparti1,2. Avanzamenti nell'ingegnerizzazione del tessuto hanno prodotto piattaforme di cultura sofisticata, 3D che consentono indagini controllate in fisiche e chimiche 1) come componenti di matrice microambiente effetto cella comportamenti e 2) l'efficacia di nuovo terapeutico strategie per un certo numero di malattie, compreso i cancri2. Mentre in vitro modelli non possono rappresentare fattori....

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Protocol

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Tutti i tessuti umani raccolta punti sono stati effettuati sotto protocolli istituzionalmente approvati.

1. Thiolation di acido ialuronico

Nota: Rapporti molari sono indicati rispetto al numero totale di gruppi carbossilato, se non diversamente specificato.

  1. Sciogliere 500 mg di ialuronato di sodio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg/mL in acqua distillata, demineralizzata (DiH2O) in autoclave sterilizzato, beuta da 250 mL. Agitare la soluzione (~ 200 giri/min) a temperatura ambiente per 2 ore a sciogliere completamente HA. Utilizzare un ancoretta e piastra magnetica per mantenere reazione mescolando du....

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Results

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Per ogni lotto di tiolate HA, il grado di thiolation dovrebbe essere verificato utilizzando1H -NMR o prova di un Ellman. HA modifica utilizzando la procedura descritta qui costantemente genera thiolation ~ 5% (definito come il rapporto molare dei tioli a HA disaccaridi) (Figura 1).

Configurazione di questa nuova piattaforma di cultura richiederà ogni laboratorio per esegu.......

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Discussion

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Generazione di dati riproducibili utilizzando questo sistema di coltura 3D richiede: 1) coerente-lotto thiolation di HA, 2) pratica per raggiungere efficiente miscelazione dei precursori di idrogel e manipolazione di idrogel culture per evitare danni e 3) ottimizzato semina densità per ogni linea cellulare utilizzato.

Quando una percentuale di peso particolare di HA desiderata nell'idrogel, il grado di thiolation di HA determina la densità di reticolazione. Si consiglia di utilizzare una quant.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato con finanziamenti dal NIH (R21NS093199) e premio della UCLA ARC 3R. I nostri più sentiti ringraziamenti al laboratorio del Dr. Harley Kornblum per fornitura delle linee cellulari HK301 e HK157. Ringraziamo anche UCLA tessuto patologia Core laboratorio (TPCL) per il criosezionamento, funzione di memoria avanzate luce microscopia/spettroscopia (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) presso la UCLA per l'uso del microscopio confocale, UCLA Crump Istituto per Imaging molecolare per l'utilizzo del sistema di imaging IVIS, UCLA molecolare strumentazione Center (MIC) per fornire la spettroscopia a risonanza magnetica e flusso Cytome....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Misuratore di pHThermo FisherN/AQualsiasi misuratore di pH con sensibilità al pH 2-10
Piastra di agitazioneThermo FisherN/A Attrezzaturagenerale di laboratorio
Pallone di Erlenmeyer (125 ml)ProvetteFB-501-125
Thermo Fisher21-152-14
Bicchiere in polipropilene da 2 litriThermo FisherS01916
acido ialuronico di sodioLifecoreHA700k-5500-750 kDa gamma
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-idrossisuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Acido cloridrico (HCl)Thermo FisherSA48-500
Idrossido di sodio (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cistamina dicloridratoThermo FisherAC111770250
Ditioltreitolo (DTT)Thermo FisherBP172-25
Reagente per test di Ellman (acido 5-(3-carbossi-4-nitrofenil)disolfanil-2-nitrobenzoicoSigma AldrichD218200-1G
Acqua deuterata (ossido di deuterio)Thermo FisherAC166301000
0,22µ m filtro a vuotoCellTreat229706
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-br-PEG-maleimmideJenKem TechnologyA7029-1peso molecolare circa 20kDa
4-br-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1peso molecolare intorno a 20kDa
L-Cisteina Sigma AldrichC7880-100G
RGD ECM peptide mimeticoGenscript BiotechN/APeptide personalizzato con sequenza "GCGYGRGDSPG", N-terminale deve essere
stampi in siliconeSigma AldrichGBL664201-25EAUtilizzare la lama di rasoio per tagliare in singoli pezzi
il terreno di coltura completoVariVariDMEM/F12 (Thermofisher) con integratore non sierico (G21 di GeminiBio), fattore di crescita epidermico 50ng/mL (Peprotech), fattore di crescita dei fibroblasti 20ng/mL (Pepro Tech) ed epraina 25µ g/mL (Sigma Aldrich), il terreno di coltura varia nei diversi laboratori cellule
GBM derivate dal pazienteN/AN/A Ago
da 20 G305175medico BD
siringa da 1 mlThermo Fisher14-823-434
Siringa da 10 ml302995
medico RIPA BufferThermo FisherPI-89901
proteasi/ mini compressa inibitore della fosfatasisigma aldrich5892970001
agitatore a vorticeThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µ Filtro cellulare mThermo Fisher22-363-548
ParaformaldeideThermo FisherAC416785000Sciogliere il 4% (p/v) in PBS, mantenere il pH 7,4
D-saccarosioThermo FisherBP220-1
Composto per temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) ThermoFisherNC9373881
Incubatore per colture cellulariThermo FisherN/AQualsiasi Generale con 5% di CO2 e 37C
frigorifero/congelatoreThermo FisherN/AQualsiasi attrezzatura di laboratorio generale con capacità di -20C e -80C
Stampi per inclusione monousoThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AQualsiasi liofilizzatore -105C
HEPESThermo FisherBP310-500
Fiala di ambraKimble Chase60912D-2
Punte per pipette con orifizio largoThermo Fisher9405120
2-metilbutanoThermo Fisher03551-4
Ghiaccio seccoN/AN/A
per dialisi Thermo Fisher acetilato

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103

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Hyaluronic Acid Hydrogels3D Cell CulturePatient Derived GlioblastomaHydrogel CrosslinkingCell EncapsulationFlow CytometryWestern BlottingCryosectioningECM Mimetic PeptidesGlioma Sphere Culture

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