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Articolo metodologico

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

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⸱

DOI:

10.3791/58176

⸱

24 agosto 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la cultura tridimensionale delle cellule di glioblastoma paziente-derivato all'interno di biomateriali ortogonalmente sintonizzabile progettate per imitare la matrice di cervello. Questo approccio fornisce un in vitro, una piattaforma sperimentale che mantiene molte caratteristiche in vivo delle cellule di glioblastoma in genere perdite nella cultura.

Abstract

Glioblastoma (GBM) è il più comune, ancora più letale, il cancro del sistema nervoso centrale. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su come la matrice extracellulare (ECM) dell'ambiente unico cervello, come l'acido ialuronico (HA), facilita l'invasione e la progressione di GBM. Tuttavia, la maggior parte dei modelli in vitro cultura includono cellule di GBM all'esterno del contesto di un ECM. Murini xenotrapianti di cellule di GBM sono utilizzati comunemente come pure. Tuttavia, in vivo modelli rendono difficile isolare i contributi delle singole caratteristiche del microambiente tumorale complesso comportamento del tumore. Qui, descriviamo una piattaforma di base di idrogel, tridimensionale (3D) cultura HA che permette ai ricercatori di alterare in modo indipendente rigidità e concentrazione dell'HA. Ad alto peso molecolare HA e polietilenglicole (PEG) comprendono gli idrogel, che sono reticolate tramite aggiunta di Michael-tipo in presenza di cellule vive. Idrogel 3D culture della paziente-derivato GBM cellule Mostra vitalità e proliferazione prezzi buono come o meglio di, quando coltivate come standard gliomaspheres. Il sistema di idrogel permette inoltre di incorporazione di peptidi ECM-mimetici per isolare gli effetti delle interazioni cellula-ECM specifici. Idrogeli sono otticamente trasparenti in modo che le cellule vive possono essere imaged in 3D cultura. Infine, HA idrogel culture sono compatibili con le tecniche standard per analisi molecolari e cellulari, tra cui PCR, Western blotting e cryosectioning seguita da immunofluorescenza.

Introduzione

Sistemi tridimensionali (3D) cultura ricapitolano le interazioni tra cellule e loro circostante matrice extracellulare (ECM) nei tessuti nativi meglio di loro bidimensionale (2D) controparti1,2. Avanzamenti nell'ingegnerizzazione del tessuto hanno prodotto piattaforme di cultura sofisticata, 3D che consentono indagini controllate in fisiche e chimiche 1) come componenti di matrice microambiente effetto cella comportamenti e 2) l'efficacia di nuovo terapeutico strategie per un certo numero di malattie, compreso i cancri2. Mentre in vitro modelli non possono rappresentare fattori sistemici, quali i segnali di sistema endocrini e sistema immunitario e non possono quindi sostituire completamente in vivo modelli, essi offrono numerosi vantaggi tra cui riproducibilità, controllo sperimentale, convenienza e velocità. Qui, descriviamo l'uso del cervello-mimetici idrogeli in quale 3D culture di cellule di tumore cerebrale derivata da paziente catturano molti aspetti della fisiologia del tumore, in particolare, la dinamica di acquisizione trattamento resistenza3. Rispetto ad altri metodi in vitro , queste culture meglio rappresentano modelli di tumore in vivo e osservazioni cliniche3.

Glioblastoma (GBM) è il tumore più frequente e letale originari del cervello, con una sopravvivenza mediana di soltanto 1-2 anni4,5. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati sull'influenza dell'ambiente di matrice tumorale in GBM6,7,8. L'unico cervello ECM è stata segnalata per influenzare la resistenza terapeutica6,7,8,9,10,11 , proliferazione e migrazione delle cellule GBM , 12. acido ialuronico (HA) è un abbondanti glicosaminoglicani (GAG) nel cervello, dove interagisce con altre GAGs e proteoglicani per formare un idrogel-come mesh13. Molti studi hanno riferito HA sovraespressione in tumori GBM e suoi effetti successivi il cancro progressione8,9,13,14,15,16 ,17. Altri componenti della MEC colpiscono anche GBM tumore crescita e l'invasione6,7,15,18. Ad esempio, fibronectina e vitronectina, che in genere sono iperespressi in GBM, indurre eterodimerizzazione di recettori di superficie delle integrine tramite l'associazione alla sequenza "RGD" e avviare complesse cascate di segnalazione che favoriscono la sopravvivenza del tumore19 ,20,21. Oltre alle influenze biochimiche, proprietà fisiche della matrice del tessuto anche influenzare GBM progressione22,23.

Continua acquisizione di resistenza alle terapie è uno dei principali driver di GBM letalità4. Farmaci promettenti risultati in modelli 2D o gliomasphere hanno fallito in successivi studi sugli animali e casi clinici3, che indica che gli effetti di fattori microambientali contribuito notevolmente al GBM tumore risposta1. Mentre modelli animali possono fornire un 3D, fisiologicamente appropriato microambiente per xenotrapiantati paziente cellule e generare risultati clinicamente rilevanti24,25, la complessità del cervello microambiente in vivo rende difficile per stabilire quali funzionalità, incluse le interazioni cellula-matrice, sono risultati biologici chiave specifica. Identificazione di nuovi bersagli terapeutici apprezzeranno l'uso di piattaforme di cultura semplificato in cui sono definite le proprietà biochimiche e biofisiche.

A differenza dei modelli precedentemente segnalati biomateriale del GBM microambiente tumorale26,27 , che non hanno raggiunto un vero controllo ortogonale su singole caratteristiche biochimiche e fisiche della ECM, la piattaforma di biomateriale qui segnalati consente il disaccoppiamento dei contributi delle diverse funzioni indipendenti per fenotipo delle cellule GBM. Qui, presentiamo un sistema basato su HA, ortogonalmente sintonizzabile, idrogel per 3D cultura di cellule GBM derivanti dal paziente. Idrogeli sono formati da due componenti del polimero: HA 1) biologicamente attivo e 2) biologicamente inerte polietilenglicole (PEG). PEG è un materiale biocompatibile e idrofilo ampiamente usato con adsorbimento di proteine basso e immunogenicità minimo28. Qui, circa il 5% di moiety acido glucuronico sulle catene di HA sono funzionalizzate con gruppi tiolici per abilitare reticolazione a un commercialmente disponibili 4-braccio-PEG è terminato con le maleimidi via l'aggiunta di Michael-tipo. Nella sua forma più comune nel corpo, HA esiste in catene ad alto peso molecolare (HMW). Qui, un basso grado di modificazione di HMW HA (500-750 kDa) aiuta a preservare interazioni natali di HA e suoi recettori cellulari, tra cui CD4429. Sostituendo il PEG-tiolo per HA-tiolo, mantenendo un costante rapporto molare dei tioli totali per le maleimidi, HA concentrazione può essere separato da proprietà meccaniche nel caso degli idrogeli risultante. Inoltre, stechiometrici controlli possono essere utilizzati per coniugato peptidi cisteina-terminato a un numero definito di medio di terminazione maleimide braccia su ogni 4-braccio-PEG. Incorporazione di peptidi ECM-derivato, adesivi consente interazioni con le integrine su cellule in coltura, attraverso il quale segnali biochimici e chimici sono trasdotte1. Aggiunta di maleimide-tiolo si verifica molto rapidamente in condizioni fisiologiche, riducendo al minimo il tempo necessario per incapsulamento cella e massimizzare sopravvivenza delle cellule derivate dal paziente. Inoltre, idrogel culture possono essere trattate come esemplare tipico del tessuto e sono compatibili con tecniche di caratterizzazione standard tra cui il Western blotting, citometria a flusso e immunofluorescenza. Il seguente protocollo descrive le procedure per la realizzazione di idrogeli, instaurazione 3D delle colture di cellule GBM derivate da paziente e tecniche per l'analisi biochimica.

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Protocollo

Tutti i tessuti umani raccolta punti sono stati effettuati sotto protocolli istituzionalmente approvati.

1. Thiolation di acido ialuronico

Nota: Rapporti molari sono indicati rispetto al numero totale di gruppi carbossilato, se non diversamente specificato.

  1. Sciogliere 500 mg di ialuronato di sodio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg/mL in acqua distillata, demineralizzata (DiH2O) in autoclave sterilizzato, beuta da 250 mL. Agitare la soluzione (~ 200 giri/min) a temperatura ambiente per 2 ore a sciogliere completamente HA. Utilizzare un ancoretta e piastra magnetica per mantenere reazione mescolando durante thiolation procedura.
  2. Utilizzando 0,1 M di acido cloridrico (HCl), regolare il pH della soluzione HA a 5.5. Pesare 69,6 mg (0.25 x rapporto molare) di 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
    Nota: Sebbene non disciolto EDC può essere aggiunto direttamente alla soluzione HA, è in genere più facile da sciogliere prima EDC in 1 mL di DiH2O e quindi aggiungere rapidamente la soluzione EDC per la soluzione HA. Pre-dissoluzione in 1 mL di DiH2O può essere fatto anche con N-Idrossisuccinimide (NHS) e cistamina dihydrocholoride prima di aggiungere la reazione ai punti 1.3 e 1.4.
  3. Aggiungere 17,9 mg (0.125 x rapporto molare) di NHS alla reazione. Regolare il pH della soluzione di reazione a 5.5 utilizzando 0.1 M HCl e incubare la reazione a temperatura ambiente per 45 minuti.
  4. Aggiungere 70,0 mg (0.25 x rapporto molare) di cystamine dihydrochloride nella soluzione di reazione. Utilizzare 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH) per aggiustare il pH a 6.25. Incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte mentre si mescolano.
  5. Il giorno seguente, è possibile utilizzare 1 M NaOH per regolare il pH della soluzione di reazione a circa 8. Aggiungere 192 mg (4 x rapporto molare) di ditiotreitolo (DTT) alla reazione. Regolare il pH torna a 8 dopo l'aggiunta del DTT e lasciare sotto agitazione per 1-2 ore a temperatura ambiente.
  6. Utilizzare 1 M HCl per aggiustare il pH a 4. Trasferire la miscela di reazione intera in membrana di dialisi pre-impregnati (cut-off di peso molecolare intorno 13 kDa) e Dializzare contro DiH2O pre-regolata a pH 4.
    Nota: Il volume di DiH2O per dialisi deve essere almeno 40 volte il volume della soluzione HA reagito (ad es., campione di 50 mL in 2 L di DiH2O, pH 4).
  7. Sostituire la soluzione di dialisi (DiH2O, pH 4) due volte al giorno per 3 giorni a temperatura ambiente.
  8. Filtrare la soluzione dializzata attraverso una membrana da 0,22 µm, filtro vuoto-driven. Flash freeze soluzione dei chitosani HA in azoto liquido. Utilizzare un liofilizzatori per congelare i campioni a secco oltre 2 giorni. Chitosani HA in forma secca possono essere memorizzato in un essiccatore sottovuoto a-20 ° C per almeno 6 mesi.
  9. Per determinare il grado di thiolation, utilizzare test di Ellman e/o proton NMR spettroscopia30,31.

2. preparazione dei materiali di reticolazione

  1. Sciogliere chitosani HA alla concentrazione desiderata (in questo esempio, 13,3 mg/mL) in soluzione salina tamponata HEPES (20 mM HEPES buffer di soluzione fisiologica salina equilibrata (HBSS) di Hank, regolata per cadere all'interno di un pH di 8-9) in un flaconcino ambrato per minimizzare l'esposizione alla luce ambientale. Mantenere la soluzione mescolando continuamente.
    Nota: La formazione di ponti disolfuro tra i tioli coniugati a HA può verificarsi se il pH è superiore a 8, concentrazione della soluzione è troppo alta o la soluzione è lasciata mescolando per troppo a lungo prima di gelificazione. Per evitare questo problema, utilizzare inferiore a 15 mg/mL di tiolate HA e sciogliere chitosani HA entro 2 ore di formazione di idrogel.
  2. Sciogliere 4-braccio-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) e 4-braccio-PEG-tiolo (PEG-tiolo, 20 kDa) in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.4, per preparare 50 mg/mL soluzioni «stock» PEG-Mal e PEG-tiolo.
    Nota: Ci vuole almeno 1 ora per sciogliere completamente i reagenti PEG.
  3. Nel caso in cui l'aggiunta di peptidi derivati da ECM, sciogliere peptidi contenenti cisteina in PBS per preparare una soluzione di riserva.
    Nota: Utilizzare una concentrazione stock di 2-4 mM.
  4. Ammollo in gomma siliconica stampi in etanolo per almeno 20 min per pulirli e poi autoclave per la sterilizzazione.

3. idrogel reticolazione e incapsulamento cella

Nota: ad esempio, l'incapsulamento di quattro individui, 80 µ l idrogel con 0,5% (p/v) HA e modulo di compressione di 1 kPa Ecco descritto3. Consultare la tabella 1 per le ricette di esempio che producono gli idrogel con proprietà diverse: due idrogeli incorporando il peptide di integrina-associazione RGD e due idrogel che incorpora tappi di cisteina come controllo negativo per attività del peptide. Concentrazione di cellule GBM derivanti dal paziente il seeding è 500.000 cellule/mL.

  1. Diluire PEG-Mal soluzione madre (50 mg/mL, da passo 2.2) a 12,5 mg/mL aggiungendo 40 µ l della soluzione madre a 120 µ l di PBS. Dividere la soluzione diluita in due provette per microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che ogni tubo ha 80 µ l.
  2. Aggiungere 16 µ l di stock soluzione RGD (2,8 mM, dal passaggio 2.3) in una provetta e 16 µ l di soluzione stock cisteina (2,8 mM, dal passaggio 2.3) per il secondo tubo. Vortice di mescolare. Mettere le soluzioni di PEG-Mal-RGD o PEG-Mal-CYS sul ghiaccio fino all'utilizzo al punto 3.9.
    Nota: La procedura come descritto qui rese idrogel con ~ 140 µM del peptide. Ciò equivale a circa 1 su ogni 8 braccia PEG disponibile essere occupato con un peptide. Questo può essere variato modificando il rapporto molare di peptidi cisteina-terminato ai gruppi di maleimide disponibili. In generale, una concentrazione massima di 280 µM del peptide può essere raggiunto pur lasciando un numero sufficiente di maleimide gruppi disponibili per reticolazione di idrogel.
  3. Diluire la soluzione stock PEG-tiolo (50 mg/mL, da passo 2.2) a 5 mg/mL di miscelazione 4 µ l di 50 mg/mL soluzione di riserva con 36 µ l di PBS. Aggiungere 120 µ l di chitosani disciolto, HA dal passaggio 2.1 alla miscela.
    Nota: Soluzioni di HMW HA sono molto viscosi. Così, si consiglia di utilizzare la punta della micropipetta wide-orifizio al trasferimento di soluzioni. Pipettare lentamente per evitare soluzione attaccare alle pareti della punta della micropipetta e per migliorare l'accuratezza di misura.
  4. Posizionare gli stampi puliti e asciutti (preparati al punto 2.4) in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti trattata di non-tessuto cultura. Utilizzando l'estremità smussata, pulito di punta di una pipetta, premere il gel di muffa e doppio controllo tenuta tra stampi e inferiore della piastra di ben.
    Nota: Controllare la tenuta del nuovo destra prima di incapsulamento per evitare perdite.
  5. Passaggio di cellule GBM coltivate, dissociare a cellule singole e determinare concentrazione cellulare come precedentemente descritto3.
    Nota: Alcune linee GBM non possono essere dissociate di singole cellule. In questo caso, può essere incapsulato tutta gliomaspheres. Tuttavia, preparare singole cellule dissociate dopo conta cellulare precisi per migliorare la riproducibilità. Il protocollo per gliomasphere passaggio varia tra laboratori diversi e molti di questi sono probabilmente compatibile con incapsulamento di idrogel.
    1. (Consigliato) Centrifuga gliomaspheres a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di enzima di dissociazione della cellula per il pellet cellulare. Quindi, incubare per 5 min, picchiettando delicatamente il tubo ad agitare.
    2. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura completa (EGF, FGF-2, 25 µ g/mL eparina, G21 supplemento e 1% di penicillina/streptomicina di 20 ng/mL in DMEM/F12 50 ng/mL) per le cellule.
    3. Centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Infine, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno completo e passare le cellule sospese attraverso un colino di cella di 70 µm. (Consigliato) lavare il filtro con un ulteriori 4 mL di terreno completo per massimizzare il numero di celle recuperato.
  6. Stimare la concentrazione di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro. Dividere la sospensione cellulare in 2 provette da centrifuga, dove ogni tubo contiene cellule ~ 80.000. Centrifugare a 500 g per 5 min; in genere, 80.000 cellule compongono 2 80 µ l idrogeli.
  7. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di uno a 80 µ l di soluzione di PEG-MAL-RGD e un secondo pellet in 80 µ l di soluzione di PEG-MAL-CYS (preparata al punto 3.1).
  8. Usando un 200 µ l, punta larga-orifizio micropipetta, dispensare 40 µ l di soluzione HA (dal passaggio 3.3 sopra) in ogni stampo in silicone di gomma (come preparato al punto 3.4).
  9. Utilizzando un 200 µ l, punta larga-orifizio micropipetta, mescolare il 40 µ l di PEG-MAL-CYS o PEG-MAL-RGD cella soluzione con la soluzione HA nello stampo. Pipettare su e giù rapidamente non più di 10 volte. Ripetere per ogni cultura di gel in fase di preparazione.
    Nota: Questo passaggio richiede pratica, poiché la gelificazione iniziale si verifica rapidamente (entro 30 s). Pipettare su e giù mentre si muove la punta in diverse posizioni in stampi per garantire anche miscelazione. Tenere sempre la punta sotto il livello del liquido per evitare la formazione di bolle d'aria. Fare non mescolare la soluzione troppe volte come gel può ottenere formata all'interno la micropipetta suggerimento. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD possono essere combinati a vari rapporti per ottenere la desiderata concentrazione di peptide RGD.
  10. Posizionare la piastra di pozzetti contenenti cellule gel-incapsulati in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per 5-10 minuti per il completamento della reazione.
  11. Aggiungere 2-2.5 mL di terreno di coltura ad ogni pozzetto con formato gel. Utilizzare una sterile, punta della pipetta 2 µ l o micro-spatola, per separare delicatamente la muffa e gel. Utilizzare pinze pre-sterilizzate per togliere la muffa dalla piastra ben. Posizionare la piastra ben torna a incubatrice cellulare (37 ° C e 5% CO2) per la cultura e gli esperimenti futuri.
    Nota: Tirare lo stampo verticalmente verso l'alto per evitare di danneggiare le colture di gel. In generale, media in gel culture deve essere sostituito ogni 3-4 giorni. Fare attenzione a non per aspirare idrogel quando si toglie di mezzo. Se si tratta di un problema, si consiglia di utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica. Se è prevista la bioluminescenza imaging per monitorare il numero di cellule, cellule di GBM devono essere trasdotte con lentivirus codifica costitutivamente espressione di luciferase prima di incapsulamento, come descritto in precedenza3. Per l'imaging di bioluminescenza, aggiungere 1 mM di D-luciferina al terreno di coltura 1 h prima dell'imaging luminescenza.

4. lisato preparazione per macchiarsi occidentale

  1. Chill per microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio (1 a campioni di gel). Centrifuga raffreddare a 4 ° C.
  2. Rimuovere il mezzo di da piastre a pozzetti. Trasferire gel in microcentrifuga prechilled.
  3. Aggiungere 100 µ l di tampone RIPA con gli inibitori di proteasi/fosfatasi x 1.
  4. Usando una siringa da 1 mL con un ago di 20 G, rompere il gel spingendo la miscela intera attraverso ago almeno 20 volte.
  5. Flash spin l'esempio utilizzando la panca superiore microcentrifuga e posto il campione di nuovo sul ghiaccio.
  6. Vortice campioni brevemente ogni 5 minuti per un totale di 20 min.
  7. Centrifugare i campioni a 14000 x g per 15 min a 4 ° C.
  8. Trasferire il surnatante in nuove, pre-refrigerati per microcentrifuga e conservare a-20 ° C (a breve termine) o e -80 ° C (a lungo termine). Eseguire l'elettroforesi del gel utilizzando le procedure standard, come descritto in precedenza3.

5. estrazione di singole cellule da culture di idrogel per citometria a flusso

  1. Rimuovere cultura di gel medium e trasferimento (dal punto 3.11) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Incubare il gel con 500 µ l di enzima dissociazione della cellula (ad es., TrypLE Express) a 37 ° C per 5 min, occasionalmente sfogliando il tubo ad agitare.
  3. Trasferire il composto in una provetta da centrifuga 50ml con 5 mL di terreno completo. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
  4. Inserire un ago di 20G su una siringa da 10 mL. Tirare delicatamente la sospensione cellulare su e giù attraverso l'ago 8 volte.
  5. Fluire la miscela attraverso 70 µm colino di cella in una nuova provetta da centrifuga 50 mL. Applicare un ulteriore 5 mL di terreno completo attraverso il colino per raccogliere tutte le cellule rimanenti.
  6. Centrifugare il campione a 400 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet in buffer desiderato per citometria a flusso (utilizzando protocolli standard3).

6. Crioconservazione degli idrogeli per il sezionamento

  1. Rimuovere il mezzo di da culture di gel (dal punto 3.11).
  2. Incubare le colture di gel con 2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 ° C durante la notte.
    Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
  3. Il giorno successivo, rimuovere PFA. Aggiungere 2 mL di saccarosio al 5% in PBS per gel e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  4. Sostituire il 5% di soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% in PBS e incubare per 30 min.
  5. Sostituire la soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% fresco in PBS e incubare per altri 30 min.
  6. Per la terza volta, sostituire la soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% fresco in PBS. Incubare per una notte a 4 ° C.
  7. Preparare il 20% di saccarosio in composto di temperatura ottimale di taglio (OCT).
    Nota: A causa della viscosità di OCT, dissoluzione del saccarosio può richiedere alcuni tempo (fino a pernottamento). Si consiglia di mettere la miscela su un agitatore durante la dissoluzione di mantenere agitazione.
  8. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di saccarosio 20% e delicatamente versare il 20% di saccarosio in soluzione OCT sopra il gel. Assicurarsi di coprire il gel intero. Incubare a 4 ° C per 3 h.
  9. Trasferire il gel al centro di un incorporamento stampo usando una spatola grande, piatta; Questo deve essere fatto con attenzione per evitare di danneggiare il gel.
  10. 2-metilbutano cool all'interno di una criocamera con un eccesso di ghiaccio secco.
  11. Riempire lo stampo incorporamento con OCT puro (senza saccarosio). Riempire a appena sotto il bordo superiore dello stampo.
  12. Congelare il campione di idrogel per immersione in raffreddato 2-metilbutano e quindi procedere al sezionamento.
  13. Sezione il campione utilizzando un criostato; spessore di taglio di 10-18 µm e sezionamento temperatura intorno ai-26 ° c sono raccomandati.
  14. Eseguire procedure standard immunostaining sulla cultura gel sezionato, come descritto in precedenza3.
    Nota: PFA è noto irritante e cancerogeno. Maneggiare e smaltire PFA secondo le direttive e gli standard vigenti a livello locale.

7. estrazione di RNA totale da campioni in idrogel

Nota: Qui, descriviamo un protocollo utilizzando uno spot kit (vedere la tabella materiali) per estrarre RNA totale dalle cellule coltivate di idrogel. I buffer e tutto il materiale sono disponibili all'interno del kit utilizzato.

  1. Rimuovere il terreno di coltura. Utilizzare una pipetta di trasferimento P1000 con wide-bore punta a diffondere la cultura di idrogel in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Aggiungere 350 µ l di tampone RLT alla cultura di idrogel.
  3. Utilizzando un ago 20 G attaccato ad una siringa da 1 mL, tagliuzzare il gel spingendo la miscela intera attraverso ago almeno 20 volte.
  4. Trasferire la miscela intera in una colonna di omogeneizzatore collocata in una provetta da 2 mL. Centrifugare a 13.000 x g per 2 min.
  5. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulito 1,5 mL. Fare attenzione a non disturbare il precipitato di gel nella parte inferiore.
  6. Mescolare il campione lisato con 350 µ l di etanolo al 100%. Trasferire il campione di tutti in un posto di colonna (dal kit) di spin in un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare per 1 min a 13.000 x g.
  7. Per i passaggi successivi per la purificazione di RNA per PCR, seguire il protocollo generale fornito dal produttore del kit.
    Nota: Una volta estratto RNA, protocolli standard per la PCR possono essere utilizzati.

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Risultati

Per ogni lotto di tiolate HA, il grado di thiolation dovrebbe essere verificato utilizzando1H -NMR o prova di un Ellman. HA modifica utilizzando la procedura descritta qui costantemente genera thiolation ~ 5% (definito come il rapporto molare dei tioli a HA disaccaridi) (Figura 1).

Configurazione di questa nuova piattaforma di cultura richiederà ogni laboratorio per esegu...

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Discussione

Generazione di dati riproducibili utilizzando questo sistema di coltura 3D richiede: 1) coerente-lotto thiolation di HA, 2) pratica per raggiungere efficiente miscelazione dei precursori di idrogel e manipolazione di idrogel culture per evitare danni e 3) ottimizzato semina densità per ogni linea cellulare utilizzato.

Quando una percentuale di peso particolare di HA desiderata nell'idrogel, il grado di thiolation di HA determina la densità di reticolazione. Si consiglia di utilizzare una quant...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato con finanziamenti dal NIH (R21NS093199) e premio della UCLA ARC 3R. I nostri più sentiti ringraziamenti al laboratorio del Dr. Harley Kornblum per fornitura delle linee cellulari HK301 e HK157. Ringraziamo anche UCLA tessuto patologia Core laboratorio (TPCL) per il criosezionamento, funzione di memoria avanzate luce microscopia/spettroscopia (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) presso la UCLA per l'uso del microscopio confocale, UCLA Crump Istituto per Imaging molecolare per l'utilizzo del sistema di imaging IVIS, UCLA molecolare strumentazione Center (MIC) per fornire la spettroscopia a risonanza magnetica e flusso Cytometry Core in Jonsson completa Cancer Center (JCCC) presso la UCLA per la fornitura di strumentazione per il flusso cytometry.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Misuratore di pHThermo FisherN/AQualsiasi misuratore di pH con sensibilità al pH 2-10
Piastra di agitazioneThermo FisherN/A Attrezzaturagenerale di laboratorio
Pallone di Erlenmeyer (125 ml)ProvetteFB-501-125
Thermo Fisher21-152-14
Bicchiere in polipropilene da 2 litriThermo FisherS01916
acido ialuronico di sodioLifecoreHA700k-5500-750 kDa gamma
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-idrossisuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Acido cloridrico (HCl)Thermo FisherSA48-500
Idrossido di sodio (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cistamina dicloridratoThermo FisherAC111770250
Ditioltreitolo (DTT)Thermo FisherBP172-25
Reagente per test di Ellman (acido 5-(3-carbossi-4-nitrofenil)disolfanil-2-nitrobenzoicoSigma AldrichD218200-1G
Acqua deuterata (ossido di deuterio)Thermo FisherAC166301000
0,22µ m filtro a vuotoCellTreat229706
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-br-PEG-maleimmideJenKem TechnologyA7029-1peso molecolare circa 20kDa
4-br-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1peso molecolare intorno a 20kDa
L-Cisteina Sigma AldrichC7880-100G
RGD ECM peptide mimeticoGenscript BiotechN/APeptide personalizzato con sequenza "GCGYGRGDSPG", N-terminale deve essere
stampi in siliconeSigma AldrichGBL664201-25EAUtilizzare la lama di rasoio per tagliare in singoli pezzi
il terreno di coltura completoVariVariDMEM/F12 (Thermofisher) con integratore non sierico (G21 di GeminiBio), fattore di crescita epidermico 50ng/mL (Peprotech), fattore di crescita dei fibroblasti 20ng/mL (Pepro Tech) ed epraina 25µ g/mL (Sigma Aldrich), il terreno di coltura varia nei diversi laboratori cellule
GBM derivate dal pazienteN/AN/A Ago
da 20 G305175medico BD
siringa da 1 mlThermo Fisher14-823-434
Siringa da 10 ml302995
medico RIPA BufferThermo FisherPI-89901
proteasi/ mini compressa inibitore della fosfatasisigma aldrich5892970001
agitatore a vorticeThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µ Filtro cellulare mThermo Fisher22-363-548
ParaformaldeideThermo FisherAC416785000Sciogliere il 4% (p/v) in PBS, mantenere il pH 7,4
D-saccarosioThermo FisherBP220-1
Composto per temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) ThermoFisherNC9373881
Incubatore per colture cellulariThermo FisherN/AQualsiasi Generale con 5% di CO2 e 37C
frigorifero/congelatoreThermo FisherN/AQualsiasi attrezzatura di laboratorio generale con capacità di -20C e -80C
Stampi per inclusione monousoThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AQualsiasi liofilizzatore -105C
HEPESThermo FisherBP310-500
Fiala di ambraKimble Chase60912D-2
Punte per pipette con orifizio largoThermo Fisher9405120
2-metilbutanoThermo Fisher03551-4
Ghiaccio seccoN/AN/A
per dialisi Thermo Fisher acetilato

Riferimenti

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