Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

Sommario

Descriviamo tre metodi sperimentali per la valutazione dell'attività di hypopigmentation di sostanze chimiche in vitro: quantificazione del contenuto di attività e melanina 2) 1) cellulare tirosinasi e 3) misurazione della melanina di melanina cellulare colorazione e analisi delle immagini.

Abstract

Questo studio presenta metodi di laboratorio per la quantificazione di hypopigmentation attività in vitro. Melanina, il pigmento più importante nei melanociti, è sintetizzata in risposta a più fattori cellulari e ambientali. Melanina protegge le cellule della pelle da danno ultravioletto, ma ha anche funzioni biochimiche e biofisiche. Eccessiva produzione o accumulo di melanina nei melanociti possa causare problemi dermatologici, come lentiggini, macchie scure, melasma e talpe. Di conseguenza, il controllo della melanogenesi con agenti di ipopigmentazione è importante in individui con esigenze cliniche o cosmetici. Melanina è sintetizzata principalmente nei melanosomi dei melanocytes in un complesso processo biochimico chiamato melanogenesi, che sono influenzata dalla estrinseca e fattori intrinseci, quali ormoni, l'infiammazione, l'età e l'esposizione alla luce ultravioletta. Descriviamo tre metodi per determinare l'attività di ipopigmentazione dei prodotti chimici o sostanze naturali nei melanociti: misura della attività della tirosinasi 1) cellulare e contenuto 2) della melanina e melanina cellulare 3) colorazione e quantificare con immagine analisi.

Nella melanogenesi, tirosinasi catalizza la tappa limitante che converte L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa) e poi in Dopachinone. Di conseguenza, l'inibizione della tirosinasi è un meccanismo primario hypopigmentation. In melanociti coltivati, attività della tirosinasi può essere quantificato l'aggiunta di l-dopa come substrato e misurando dopachinone produzione mediante spettrofotometria. Melanogenesi possono anche essere misurata da quantificare il contenuto di melanina. La frazione cellulare melanina-contenenti è estratta con NaOH e melanina è misurata spettrofotometricamente. Infine, il contenuto di melanina può essere quantificato mediante analisi d'immagine seguendo Fontana-Masson colorazione della melanina. Anche se i risultati di queste analisi in vitro non possono essere sempre riprodotto in pelle umana, questi metodi sono ampiamente utilizzati nella ricerca di melanogenesi, soprattutto come il passo iniziale per identificare potenziali attività di ipopigmentazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare l'attività dei melanociti, la crescita e la differenziazione. Risultati coerenti con i tre diversi metodi garantiscono la validità degli effetti.

Introduzione

Melanina svolge un ruolo critico nella fisiologia, patologia e tossicologia di diversi organi tra cui la pelle, occhi e cervello¹. Le principali funzioni di melanina sono effetti foto-screening e biochimici. Melanina assorbe la luce visibile e vicino infrarosso, così come la radiazione ultravioletta (UV), con tassi di assorbimento aumentato a lunghezze d'onda più corta della luce; così, melanina protegge i tessuti dai danni causati dalla luce visibile o UV radiazione². Melanina è un antiossidante e ha un'affinità per metalli e altre sostanze chimiche tossiche; di conseguenza, può proteggere tessuti dallo stress ossidativ....

Protocollo

1. preparazione del Medium, composti e reagenti

1. Preparare mezzo completo di sviluppo di B16F10. Supplemento Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (PEST).
   1. Per fare 500 mL di terreno completo, mix 445 mL di mezzo di Eagle di Dulbecco modificato (DMEM) con 50 mL di FBS e 5 mL di PEST in una bottiglia di vetro sterilizzati 1 L. Dopo aver mescolato delicatamente, filtrare il mezzo attraverso un filtro di parte superiore della bottiglia da 0,2 µm per una nuova bottiglia di vetro sterilizzati e poi conservare a 4 ° C.
      Attenzione: Tutte le tecniche di coltura cellulare dovrebbero esser....

Risultati

Risultati rappresentativi per l'attività di ipopigmentazione dell'arbutina, un anti-melanogenetico compound, in B16F10 melanociti sono riportati di seguito. Figura 1A Mostra che quel arbutina ha soppresso significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto al controllo veicolo-trattati. Allo stesso modo, il contenuto di melanina delle cellule stimolate con arbutin è stata ridotta significativamente rispetto ai comandi (Figur.......

Discussione

Abbiamo presentato i protocolli per la valutazione dell'attività di ipopigmentazione dei composti di prova utilizzando melanociti coltivati. I risultati rappresentativi hanno mostrato l'effetto di ipopigmentazione dell'arbutina, un inibitore della tirosinasi che ha inibito il contenuto di melanina di attività e cellulare di tirosinasi. Questi metodi sono ampiamente usati nella ricerca di attività anti-melanogenic. Usando queste analisi, abbiamo identificato anche con successo parecchi composti bioattivi che hanno melanog.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3,4-Diidrossi-l-fenilalanina	Sigma	D9628
Soluzione di idrossido di ammonio	Sigma	#320145
Arbutina	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalina	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Cloruro d'oro	americano MasterTech	AHG0226	0,10%
HCl	Samchun chimico	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan prodotti chimici puri	#81
NaOH	Sigma	655104
Nucleare rosso rapido	Merck	100121	Nucleare rosso rapido 0,1% in 5% alluminio solfato.
Soluzione di penicillina e streptomicina	HyClone	SV30010
Nitrato d'argento	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodio fosfato monobasico (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodio tiosolfato pentaidrato	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(idrossimetil)amminometano	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tirosinasi dal fungo	Sigma	T3824	25 KU