Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Crescita di Saccharomyces cerevisiae ha servito come uno strumento prezioso per identificare decine di meccanismi fisiologici e molecolari. La crescita è misurata principalmente in tre modi: diluizioni seriali per spot test, unità formanti colonie contando e curve di crescita. Queste tecniche utilizzabile da solo o in combinazione con una varietà di substrati, condizioni ambientali, mutanti e prodotti chimici per esaminare le risposte specifiche o fenotipi.

La respirazione mitocondriale è un processo biologico in cui cinetica di crescita è stato applicato con successo per scoprire i meccanismi sconosciuti. In questo caso, il completamento della crescita media con carbonio non fermentabili fonti quali glicerolo, lattato o etanolo (che sono metabolizzati esclusivamente tramite respirazione mitocondriale), come l'unica fonte di carbonio e di energia permette di valutare la crescita delle vie respiratorie, che è importante per rilevare perturbazioni nella fosforilazione ossidativa attività¹. D'altra parte, è complicato da usare modelli di cinetica di crescita come un metodo per decifrare i meccanismi dietro la fermentazione.

Lo studio della fermentazione e respirazione mitocondriale è essenziale per delucidare i meccanismi molecolari dietro alcuni fenotipi come il Crabtree e Warburg effetti^2,3. L'effetto Crabtree è caratterizzata da un aumento del flusso glicolitico, repressione di respirazione mitocondriale e l'istituzione di fermentazione come la via primaria per generare ATP in presenza di alte concentrazioni di carboidrati fermentabili (> 0,8 mM)^4,5. L'effetto di Warburg è metabolicamente analogico all'effetto Crabtree, con la differenza è che in cellule di mammifero, il prodotto principale della fermentazione è lattato⁶. Infatti, l'effetto di Warburg è esposto da una varietà di cellule tumorali, innescando l'assorbimento del glucosio e consumo anche in presenza di ossigeno⁷. Quindi, studiare le basi molecolari dell'interruttore dalla respirazione alla fermentazione nell'effetto Crabtree ha ripercussioni biotecnologiche (per la produzione di etanolo) sia potenziali impatti nella ricerca sul cancro.

S. cerevisiae crescita può essere uno strumento adatto per studiare gli effetti di Crabtree e Warburg. Questa idea è basata sul fatto che nella fase esponenziale di lievito, le vie centrali, utilizzate per produrre ATP sono la respirazione mitocondriale e la fermentazione, che sono essenziali per sostenere la crescita. Per esempio, la crescita di S. cerevisiae è intimamente legata alla funzione delle vie di generazione di ATP. Nelle molecole di S. cerevisiae, la respirazione mitocondriale produce circa 18 ATP per molecola di glucosio, mentre la fermentazione genera solo 2 molecole di ATP, quindi ci si aspetta che il tasso di crescita ha stretti legami con le vie metaboliche la produzione di ATP⁸. A questo proposito, quando la fermentazione è la via principale per generare ATP, il lievito compensa la bassa produzione di ATP aumentando il tasso di assorbimento del glucosio. Al contrario, il consumo di glucosio dalle cellule di lievito che utilizzano la respirazione mitocondriale come la principale fonte di ATP è basso. Questo indica che è importante per il lievito a disponibilità di carboidrati senso prima di determinare come verrà generato ATP. Pertanto, la disponibilità di glucosio gioca un ruolo importante nello switch tra fermentazione e respirazione mitocondriale in S. cerevisiae. In presenza di elevate quantità di glucosio, il lievito preferisce fermentazione come la via centrale per generare ATP. È interessante notare che, quando il lievito è fermentazione, il tasso di crescita specifico viene mantenuto al suo massimo. D'altra parte, sotto i bassi livelli di glucosio, S. cerevisiae produce ATP utilizzando la respirazione mitocondriale, mantenere tassi di crescita inferiori. Quindi, variazione della concentrazione di glucosio e l'uso di altre fonti di carbonio indurre cambiamenti nella preferenza di lievito tra crescita fermentativa e respiratoria. Prendendo in considerazione questo fatto con l'equazione di crescita esponenziale, uno può ottenere il significato biologico dei parametri cinetici come raddoppiando il tempo (Dt) e tasso di crescita specifico (µ). Ad esempio, i valori di µ più bassi sono stati trovati quando il lievito utilizza la respirazione mitocondriale come la via primaria. Al contrario, in condizioni che favoriscono la fermentazione, i valori più alti di µ sono stati trovati. Questa metodologia può essere usata per misurare i probabili meccanismi di sostanze chimiche che influenzano la fermentazione e la respirazione mitocondriale in S. cerevisiae.

L'obiettivo di questa carta è di proporre un metodo basato sulla cinetica di crescita per gli effetti di un determinata sostanza/composto sulla respirazione mitocondriale o fermentazione di screening.

1. terreni di coltura e preparazione dell'inoculo

1. Preparare 100 mL di terreno liquido 2% lievito estratto-peptone-destrosio (YPD) (aggiungere 1 g di lievito estratto, 2 g di peptone di caseina, e 2 g di glucosio per 100 mL di acqua distillata). Versare 3 mL dei media in provette coniche da 15 mL sterilizzabile. Sterilizzare in autoclave i media per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi.
   Nota: I media possono essere memorizzati fino ad un mese a 4 – 8 ° C.
2. Inoculare un tubo conico riempito con 3 mL di brodo di YPD 2% sterile cool con 250 μL di cellule di Saccharomyces cerevisiae conservati in glicerolo a-20 ° C. Incubare per una notte in un agitatore orbitale a 30 ° C con agitazione a 200 giri/min.
3. Striscia di Petri (60 x 15 mm²) riempite di sterile 2% YPD agar (aggiungere 10 g di lievito estratto, 20 g di peptone di caseina, 20 g di glucosio, e 20 g di agar batteriologico a 1.000 mL di acqua distillata) con le cellule coltivate in provetta conica con un'ansa sterile. Incubi di Petri a 30 ° C fino a che le colonie isolate mostrano una crescita.
4. Preparare pre-l'inoculo inoculando una singola colonia isolata in una provetta conica riempita con 10 mL di brodo di YPD 2% sterile cool e incubare per una notte a 30 ° C con agitazione continua a 200 giri/min.

2. terreni di coltura e curve di crescita in micropiastra

1. Preparare 10 mL di brodo di YPD 1% (aggiungere 0,1 g di lievito estratto, 0,2 g di peptone, e 0,1 g di glucosio a 10 mL di acqua distillata), 10 mL di brodo di YPD 2% (aggiungere 0,1 g di lievito estratto, 0,2 g di peptone, e 0,2 g di glucosio a 10 mL di acqua distillata) e 10 mL di brodo di YPD 10% (aggiungere 0,1 g di lievito estratto, 0,2 g di peptone, e 1 g di glucosio per 10 mL di acqua distillata). Autoclave questi mezzi di crescita per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi.
   Nota: I terreni di coltura serve come controllo di crescita fermentativo.
2. Preparare 10 mL di brodo di 2% lievito estratto-peptone-etanolo (IPO) e 10 mL di brodo di 2% lievito estratto-peptone-glicerolo (YPG). 2% YPE: aggiungere 0,1 g di lievito estratto, 0,2 g di peptone, e 0,2 mL di etanolo a 10 mL di acqua distillata. 2% YPG: aggiungere 0,1 g di lievito estratto, 0,2 g di peptone, e 0,2 mL di glicerolo a 10 mL di acqua distillata. Autoclave questi mezzi di crescita per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi.
   Nota: Glicerolo e l'etanolo sono fonti di carbonio non fermentabili metabolizzati esclusivamente tramite respirazione mitocondriale. Per questo motivo, vengono utilizzati come controlli una crescita delle vie respiratorie. In questo passaggio, il tipo e la concentrazione della fonte di carbonio nel terreno di coltura può essere cambiati per testare gli effetti sul fenotipo di crescita utilizzando brodo di lievito estratto-peptone (YP) (10 g di Estratto di lievito e 20 g di peptone di caseina in 1.000 mL di acqua distillata) come base. Per testare gli effetti di altre sostanze nutrienti oltre a carbonio, mezzo (SC) completa sintetico è completato secondo lo scopo dell'esperimento. La base per mezzo di SC è 1,8 g di lievito azoto base senza aminoacidi, 5 g di solfato di ammonio [(NH₄)₂SO₄], 1,4 g di fosfato monosodico (NaH₂PO₄), e 2 g di abbandono mescolare in 1.000 mL di acqua distillata. Supplemento media con una fonte di carbonio e azoto supplementare fonte nelle concentrazioni necessarie.
3. Aggiungere 145 μL di idonei mezzi di coltura per il disegno sperimentale in ciascun pozzetto della micropiastra sterile (10 x 10-bene) con un coperchio e inoculare loro con 5 μL di pre-inoculo.
   Nota: Se l'obiettivo è di schermare l'influenza di sostanze/composti sul metabolismo energetico del lievito, quella sostanza/composto deve essere aggiunto durante questo passaggio. Inoltre, qualsiasi tipo di micropiastra con un coperchio dovrebbe essere utile.
4. Incubare la piastra multi-pozzetto in un lettore di micropiastre a 30 ° C con agitazione costante a 200 giri/min per 48 h. misura la densità ottica (OD) a 600 nm ogni 30 o 60 min.
   Nota: Se il lettore di micropiastre non dispone l'opzione per incubare la micropiastra, possono essere incubata in un agitatore orbitale alle stesse condizioni tra ogni misurazione del OD.

3. crescita curve in beute scossi

1. Aggiungere 4,8 mL di terreno di coltura adatto per autoclave e beute da 20 mL. Inoculare ciascuna beuta con 200 μL della cultura pre-inoculo a OD_600nm ~ 2 in brodo 2% YPD cool, sterile. Li Incubare a 30 ° C con agitazione costante a 250 giri/min per 24 h.
   Nota: Se il periodo di incubazione è superiore a 24 ore, aggiungere 12 mL di terreno di coltura adatto per autoclave e beute da 50 mL. Inoculare loro con 500 μL di pre-inoculo. È anche importante considerare la crescita fermentativo controlli (media YP con 1%, 2% o 10% glucosio) e respiratorie crescita (media YP con 2% di glicerina o etanolo).
2. Prendere 100 μL della cultura scosso beuta e diluirlo in 900 μL di acqua distillata in una cuvetta spettrofotometro 1ml e mescolare delicatamente pipettando. Misurare il diametro esterno a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro ogni 2 h. Per ottenere la reale OD, moltiplicare il risultato per dieci.

4. elaborazione dei dati e calcolo di parametri cinetici

1. Creare un nuovo file di progetto nel software pacchetto statistico. Nella sezione di "nuova tabella e grafico", scegliere l'opzione di "XY" .
   1. Selezionare l'opzione: "Inizia con una tabella dati vuota" nella sezione "Dati di esempio" .
   2. Selezionare il tipo di grafico "Punti e linea di collegamento" . Lasciare la sezione di "X" non è selezionata nel segmento del "Subcolumns per repliche o valori di errore" e a "Y" sezione scegliere l'opzione: "Immettere valori (10) replicati a fianco a fianco subcolumns e trama media e DS errore". Fare clic sul pulsante Crea.
      Nota: Il formato di tabella ha una colonna di X e più Y colonne, ciascuna con i 10 subcolumns scelto in precedenza.
2. Scrittura il tempo al quale OD misurazioni sono state effettuate nella colonna X (ad es., 0, 30, 60, 90 minuti o 0, 1, 1.5, 2 h). Nelle colonne Y, scrivere i valori di OD ottenuti dalle colture.
3. Identificare la fase di crescita esponenziale, trasformando i dati di colonna Y in logaritmi. Fare clic sul pulsante "Analizza" , scegliere l'analisi di "Trasformare" , selezionare i valori di Y con Y = Log(Y). Vai alla "Galleria dei risultati", selezionare "Trasformare" tabella dati, fare clic sul pulsante "Analizza" e scegli l'analisi di "Regressione lineare" . Escludere i valori OD che non seguono un comportamento lineare. Per escludere i valori, selezionarli nella tabella dati e digitare "Ctrl + E".
   Nota: È importante escludere i valori che non seguono la fase esponenziale poiché l'equazione di crescita esponenziale si adatta bene con la fase esponenziale.
4. Nella "Raccolta di tabelle di dati", selezionare la tabella dati "Data 1". Fare clic sul pulsante "Analizza" e scegliere l' analisi di "Regressione non lineare (curva fit)" tra le "analisi XY".
5. Selezionare i set di dati da analizzare e fare clic sul pulsante "OK" . Nella scheda "Fit" scegliete la sezione di "Equazione esponenziale" e selezionare "equazione di crescita esponenziale" (, dove X è la concentrazione cellulare, X₀ è la concentrazione di cellule a tempo zero, μ è il tasso di crescita specifico, e t è il tempo). Utilizzare la "adattamento ai minimi quadrati" come un metodo di montaggio e lasciare deselezionata la sezione di interpolare. Fare clic sul pulsante "OK" .
   Nota: La scheda con i risultati di misura non lineare è nella "Galleria dei risultati". Il software calcola raddoppio tempo (Dt) e specifico tasso di crescita (μ). Il software Visualizza μ come K nella scheda risultati.
6. Aprire un nuovo file di progetto e nella sezione "nuova tabella e grafico" , selezionare la scelta di colonna. Scegliere l'opzione "Inizia con una tabella dati vuota" e selezionare il grafico desiderato. Scegliere tracciare la media con lo SD. Selezionare il pulsante "Crea" .
7. Copiare i valori di Dt o μ dalla scheda risultati di forma non lineare che è la "Galleria dei risultati" e incollarli in una colonna. Infine, selezionare il pulsante "Analizza" e scegliere l'analisi desiderata nella sezione "Analisi colonna" per confrontare i parametri cinetici delle diverse condizioni nutrimental.
   Nota: I parametri cinetici ottenuti dai controlli fermentativo crescita (media YP con 1%, 2% o 10% glucosio) e controlli di crescita respiratoria (media YP con 2% di glicerina o etanolo) aiuta a stabilire la soglia della respirazione mitocondriale e fermentativa, rispettivamente. Confrontando la cinetica parametri dalla condizione nutrizionale e sostanza/composto dosati con la crescita delle vie respiratorie e fermentativa identificare possibili effetti sul metabolismo fermentativo o respiratorio.

Curve di crescita possono essere utilizzate per discriminare preliminarmente tra fenotipi respiratori e fermentativi del lievito S. cerevisiae . Di conseguenza, abbiamo effettuato batch colture di S. cerevisiae (BY4742) con le concentrazioni di glucosio differenti che sono state segnalate per indurre la crescita fermentativo: 1%, 2% e 10% (p/v)9. Culture che mostra un fenotipo fermentativo hanno una piccolo lag fase e una fase esponenziale con un tasso di crescita elevato (Figura 1). Etanolo, glicerolo e lattato sono le fonti di carbonio che possono essere metabolizzate solo attraverso la respirazione; così, abbiamo effettuato culture del lievito utilizzando quelle fonti di carbonio. Culture che ottengono l'energia principalmente da fosforilazione ossidativa ha mostrato una fase di ritardo più lungo e lento tasso di crescita durante la fase esponenziale (Figura 2).

Analisi delle curve di crescita fornisce solo informazioni qualitative; quindi, è importante calcolare i parametri cinetici per ottenere informazioni quantitative. Abbiamo calcolato la Dt e μ usando l'equazione di crescita esponenziale (Figura 3). Abbiamo fissato una soglia per i valori di crescita respiratoria al Dt ≥11.5 h e μ ≤0.059 / h. La soglia per la crescita fermentativo è stata fissata a Dt ≤6.5 h e μ ≥0.149 / h (Figura 3).

Per dimostrare l'utilità di questo strumento di screening abbiamo progettato tre esperimenti, con il primo per valutare gli effetti delle concentrazioni differenti resveratrolo (RSV) sulle cellule di Saccharomyces cerevisiae BY4742 con diverso stato energetico (Figura 4) in Boccette scossi. Il secondo esperimento finalizzato a rilevare gli effetti delle concentrazioni differenti di solfato di ammonio (NH4+) sul metabolismo energetico del BY4742 di S. cerevisiae (Figura 5) in una micropiastra. Infine, il terzo mirato ad illustrare come cambiamenti nella fonte di carbonio influenzano la crescita fermentativa nei due diversi ceppi di S. cerevisiae (W303 e l'industriale WLP530 utilizzato per la fermentazione della birra) (Figura 6). L'esperimento utilizzando RSV, variando la concentrazione di glucosio è stato modificato lo stato energetico cellulare. Al glucosio 10%, tutte le concentrazioni di RSV testate non cambiare la fase di respiro-fermentativa del lievito ma ha fatto diminuire la fase respiratoria (durante il turno di Coelho, S. cerevisiae metabolizzato l'etanolo prodotto durante la fase esponenziale di fosforilazione ossidativa). I valori μ ha confermato che in tutte le condizioni testate, S. cerevisiae ha mostrato fermentativo comportamento, contrario relativo fenotipo quando coltivate in 2% glicerolo (condizione usato come un controllo respiratorio) (Figura 4a). Quando le cellule sono state eccitate con solo 1% di glucosio, i valori μ ha confermato che a 0,1, 1, 10 e 100 µM RSV, fermentativo comportamento in fase di respiro-fermentativo non è stato colpito. Tuttavia, è stata osservata una diminuzione nella fase respiratoria durante il turno di Coelho. Inoltre, ad una concentrazione di 1.000 µM, RSV completamente inibito la crescita delle cellule.

Nel secondo esperimento, le cellule sono state completate con 10% di glucosio, una concentrazione considerata sufficiente per indurre l'effetto Crabtree in S. cerevisiae. Quindi, abbiamo potuto osservare l'effetto promosso dal completamento di diverse concentrazioni di NH4+ nel metabolismo fermentativo. Dt valori suggeriti che 0,13, 0.66 e metabolismo fermentativo 1,99% NH4+ favore, e può essere osservato nelle curve di crescita che queste concentrazioni estesa fase esponenziale delle impostazioni cultura. Ciò nonostante, a mM 3,31% NH4+, un incremento nel valore Dt ha mostrato che questa concentrazione induce un metabolismo fermentativo respiro. Questo fenotipo ha mostrato una fase di ritardo prolungato nelle curve di crescita e più lento tasso di crescita nella fase esponenziale (Figura 5).

Nel terzo esperimento, le cellule di due diversi ceppi di S. cerevisiae (W303 e WLP530) sono state coltivate in diverse concentrazioni di saccarosio o galattosio per verificare se sono stati gli effetti della fonte di carbonio sui valori Dt ceppo-dipendente. Come controllo fermentativo, entrambi i ceppi sono stati coltivati in 2% di glucosio e Dt i valori sono stati calcolati per impostare una soglia per crescita fermentativo. Il fermentativo Dt i valori per i ceppi sono stati diversi, con ≤3.25 h per il ceppo di W303 e ≤6.84 h per il WLP530 ceppo. Pertanto, è importante sottolineare la necessità di convalidare la soglia Dt per i diversi ceppi utilizzati. Inoltre, quando il saccarosio è stato usato come fonte di carbonio, un fenotipo fermentativo è stato osservato al 2% e 10% in entrambe le razze. Tuttavia, quando si utilizzava il galattosio, il ceppo W303 non ha mostrato comportamento fermentativo in una qualsiasi delle concentrazioni provate, mentre il ceppo di WLP530 ha mostrato un fenotipo fermentativo a 2% galattosio. È interessante notare che, il ceppo di W303 è cresciuto in tutte le concentrazioni di entrambe le fonti di carbonio testate. Però, il ceppo di WLP530 non ha mostrato la crescita alla concentrazione più bassa di carbonio utilizzato (0,01%). Questo può essere perché WLP530 è utilizzato nel settore della birra e le concentrazioni di carbonio a cui è esposto sono generalmente molto più alto (Figura 6).

Complessivamente, i dati da questi tre esperimenti dimostrano che le curve di crescita e i parametri cinetici sono utili per la discriminazione preliminare tra crescita respiratoria e fermentativa in S. cerevisiae. Inoltre, è importante sottolineare che questo è uno strumento versatile che può essere utilizzato in diversi aspetti della ricerca sull'energia di metabolismo.

Figura 1: Effetto delle concentrazioni di glucosio diverso sul fenotipo di crescita di S. cerevisiae . Curve di crescita sono state costruite misurando la densità ottica a 600 nm ogni 30 min per 48 h. Quando le cellule di S. cerevisiae fermentano, colture hanno mostrato una fase di breve ritardo e il tasso di crescita veloce durante la fase esponenziale. La fase fermentativa respiro potrebbe essere seguita da una fase di rallentamento della crescita (fase respiratoria), dove l'etanolo prodotto dalla fermentazione viene metabolizzato usando la via fosforilazione ossidativa, quindi la fase stazionaria è raggiunto. I dati sono presentati come media ± errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto di fonti di carbonio respirabile sul fenotipo di crescita di S. cerevisiae . Curve di crescita sono state costruite misurando la densità ottica a 600 nm ogni 30 min per 48 h. cellule di S. cerevisiae ha mostrato una fase di ritardo prolungato e il tasso di crescita lenta durante la fase esponenziale e generalmente non ha mostrato uno spostamento di Coelho. I dati sono presentati come media ± errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della fonte di carbonio e la sua concentrazione su parametri cinetici di S. cerevisiae . (un) Dt i valori di S. cerevisiae BY4742 crescita sotto fonti di carbonio diversi; (b) i valori μ di S. cerevisiae BY4742 crescita sotto le concentrazioni differenti di fonti di carbonio diversi. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Le analisi statistiche sono state effettuate usando un one-way ANOVA seguita da test di Dunnett, un (*p < 0.01 vs 2% di glucosio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: effetto del completamento del resveratrolo su stati di energia differenti delle cellule. (a) crescita fenotipo e μ i valori usando il glucosio 10%; (b) fenotipo e μ valori di crescita usando il glucosio di 1%. Dati da curve di crescita sono presentati come media ± errore standard e valori μ sono presentati come media ± deviazione standard. Analisi statistiche per valori μ sono state eseguite utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di Dunnett, un [*p < il controllo respiratorio 0,01 vs. con 2% glicerolo (RC)]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Effetto del completamento del solfato di ammonio sul metabolismo energetico S. cerevisiae . Curve di crescita sono state costruite misurando la densità ottica a 600 nm ogni 30 min per 48 h. dati da curve di crescita sono presentati come media ± errore standard e valori μ sono presentati come media ± deviazione standard. Analisi statistiche per i valori Dt sono state eseguite utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di Dunnett, un [* p < il controllo respiratorio 0,01 vs. con 2% glicerolo (RC)]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: effetto della concentrazione di saccarosio e del galattosio nel metabolismo fermentativo di Saccharomyces cerevisiae. (un) Dt valori per valori di Dt W303 lab ceppo e (b) per il ceppo industriale WLP530. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Analisi statistiche per i valori Dt sono state eseguite utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di Dunnett, un [* p < 0.01 vs 2% glucosio (controllo fermentativo)]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.