Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.
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Articolo metodologico
Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attiva i neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), che possono catturare e distruggere i microbi. Studi recenti suggeriscono che le reti siano coinvolti nei vari processi di malattia, quali le metastasi del tumore, la trombosi e la malattia autoimmune. Qui, ci mostra una tecnica dettagliata in vitro per rilevare attività netto durante l'intrappolamento delle cellule del tumore libero, che si sviluppano dopo allegato ai NETs. In primo luogo, abbiamo raccolto i neutrofili a bassa densità (LDN) dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatorio da pazienti sottoposti a laparotomie. Coltura a breve termine di LDN provocato dalla massiccia formazione netta che è stato visualizzato con verde fluorescente nucleare e colorante di contrasto del cromosoma. Dopo co-incubazione di linee cellulari di cancro gastrico umano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 con le reti, molte cellule del tumore erano intrappolate dai NETs. Successivamente, l'allegato completamente è stata abrogata dal degrado delle reti con dnasi I. Time-lapse video ha rivelato che le cellule del tumore intrappolate dalle reti non è morto ma invece è cresciuta vigorosamente in una cultura di continua. Questi metodi possono essere applicati alla rilevazione di interazioni adesive tra reti e vari tipi di cellule e materiali.
Introduzione
Neutrofili nucleari polimorfo nel sangue circolante in genere sono separati dalle cellule mononucleari attraverso il metodo di preparazione gradienti di densità. Tuttavia, alcuni neutrofili conosciuti come i neutrofili a bassa densità (LDN), con i fenotipi di CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), sono co-purificati con cellule mononucleari. Il numero relativo di LDN aumenta significativamente in varie condizioni patologiche tra cui malattie autoimmuni1,2, sepsi3e cancro4,5. Gli studi precedenti hanno dimostrato che LDN sono una ....
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Protocollo
LDN sono stati ottenuti da pazienti arruolati in questo studio e sono stati approvati dalla istituzionale recensione Consiglio di Jichi Medical University.
1. isolamento di LDN dalla cavità addominale lavande e rilevamento netto
- Acquisizione del campione
- Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale.
Nota: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno subito una gastrectomia, colectomia o esofagectomia senza pregiudizi basati sull'età o sesso. Soluzio....
- Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale.
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Risultati
Nella cultura 2 ore, LDN CD66b(+) derivata da lavaggio peritoneale fluido stringa ha mostrato strutture colorate con colorante verde fluorescente per nucleare e cromosoma (Figura 1B), mentre CD66b(-) cellule mononucleari non ha fatto (Figura 1). Tuttavia, quando le culture LDN sono state pretrattate con 100 U/mL dnasi I, la caratteristica struttura è stato distrutta (Figura 1), che indica che sono st.......
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Discussione
Gli studi precedenti hanno segnalato che cellule tumorali circolanti possono essere intrappolati dal netto substrati in vivo10,11. Cellule di carcinoma mammario metastatico sono state indicate per stimolare i neutrofili e indurre la formazione di reti, che assiste nella crescita delle cellule del tumore nell' organo bersaglio17. Inoltre, abbiamo trovato che colture di breve durata di LDN dal fluido di lavaggio postoperatorio prodo.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo Sig. ra J. Shinohara e I. Nieda per il lavoro di tecnico e di segreteria. Inoltre, ringraziamo la d. ssa Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi per la loro collaborazione per l'acquisizione del campione in sala operatoria. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell'istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone e della Japan Society per la promozione della scienza (17K 10606).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SVEZIA | 17-1440-02 | |
| StraightDa&commercio; Microsfere CD66b di sangue intero | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-104-913 | |
| Blocco Fc | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-059-901 | |
| Soluzione di risciacquo MACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-091-222 | |
| Soluzione madre MACS BSA | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-091-376 | |
| Colonne LS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-041-306 | |
| Separatore magnetico MACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-501 | |
| Soluzione 5mM per colorante di acido nucleico verde SYTOX in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 per l'etichettatura generale della membrana cellulare | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluente C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Glucosio medio-alto (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0,5mol/l-EDTA Soluzione (pH 8,0) | nacalai tesque, Giappone | 06894-14 | |
| Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate dall'USDA | gibco da life technologies, Messico | 10437-028 | |
| Siero bovino Albumina liofilizzata in polvere, ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillina Streptomicina | Life Technologies Giappone | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophyttic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| MICROPIASTRA rivestita di poli-L-lisina 6Well | IWAKI, Giappone | 4810-040 | |
| MICROPIASTRA rivestita in poli-L-lisina 24 pozzetti | IWAKI, Giappone | 4820-040 | |
| stereomicroscopio a fluoresceina | BX8000, Keyence, Osaka Giappone | BZ-X710 | |
| Sistema di osservazione cellulare a vista intera | Nikon, Kanagawa, Giappone | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 linea cellulare per cancro gastrico umano | Riken, Tukuba Giappone | N/A | |
| Linea cellulare di cancro gastrico umano NUGC-4 | Riken, Tukuba Giappone | N/A | |
| OCUM-1 linea cellulare di cancro gastrico umano | Osaka City University, Giappone | N/A | Regalo dal Dr. M.Yashiro |
Riferimenti
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al.
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Ristampe e permessi
