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Articolo metodologico

Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

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DOI:

10.3791/58209

⸱

18 settembre 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 2Guangdong Key Laboratory of Nanomedicine, CAS Key Lab for Health Informatics, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 3Department of Chemistry, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.

Abstract

Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Le nanoparticelle attivamente targeting offrono un approccio promettente per la terapia del cancro. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è espresso su una vasta gamma di cellule tumorali e trofoblasto placentare e malarica proteine che var2csa in particolare può essere associato a plCSA. Un peptide di associazione segnalata placentare condroitina solfato A (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA, specificamente anche possibile associare a plCSA sulle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Quindi, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle potrebbero essere usate come uno strumento per somministrazione di farmaci mirati a cancri umani e trofoblasto placentare. In questo protocollo, descriviamo un metodo per sintetizzare nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero caricate con doxorubicina (plCSA-DNPs); il metodo consiste in un singolo sonicazione passo e bioconjugate tecniche. Inoltre, sono descritti diversi metodi per la caratterizzazione plCSA-DNPs, compresa la determinazione di loro proprietà fisico-chimiche e l'assorbimento cellulare di cellule placentari coriocarcinoma (JEG3).

Introduzione

Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Quindi, targeting tumorale selettiva è la chiave per esplorare metodi di successo terapeutici. Le nanoparticelle offrono un'opportunità promettente per la terapia del cancro, e molecolare assembly con diversi gruppi funzionali saranno che permettono di migliorare l'efficacia dei farmaci e ridurre gli effetti collaterali associati1,2. Inoltre, i sistemi di nanoparticella utilizzano principalmente attivi e passivi di targeting per raggiungere target tumori3.

Passivo di targeting sfrutta le caratteristiche innate di nanoparticelle e permeabilità migliorata ed effetti di ritenzione (EPR) per raggiungere le cellule del tumore. Liposomi cationici sono stati utilizzati con successo per fornire varie droghe anticancro a tumori in applicazioni cliniche4,5,6. Nonostante il potenziale effetto terapeutico del cancro efficace, una concentrazione di farmaco basso nella regione del tumore e un'incapacità di distinguere le cellule del tumore dai tessuti normali sono due principali limitazioni del passivo-targeting nanoparticelle7.

Strategie di targeting attive approfitta di antigene-anticorpo, ligando-recettore e altre interazioni di riconoscimento molecolare per consegnare i farmaci specificamente a tumori8. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è largamente espresso sulla maggior parte delle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Inoltre, la proteina malarica VAR2CSA specificamente possibile associare a plCSA9,10. Quindi, VAR2CSA può essere uno strumento per il targeting di cellule tumorali umane. Tuttavia, quando VAR2CSA è coniugato a nanoparticelle, la proteina full-length può limitare la penetrazione di nanoparticelle nelle cellule del tumore. Recentemente, abbiamo scoperto un peptide di associazione plCSA (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA. plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle rapidamente legato ad coriocarcinoma cellule e significativamente aumentato doxorubicina (DOX) attività antitumorale in vivo11; Queste particelle anche specificamente legato al trofoblasto placentare e potrebbero servire come strumento per la somministrazione mirata di farmaci per la placenta12.

Le nanoparticelle lipidiche-polimero sono costituiti da un guscio di monostrato lipidico e un nucleo idrofobo polimerico e rappresentano un nuovo vettore per la consegna della droga. Queste nanoparticelle combinano i vantaggi dei liposomi e polimerici nanovettori, quali dimensioni delle nanoparticelle controllabile, elevata biocompatibilità, rilascio prolungato di farmaci, efficienza di carico alta droga (LE) e un'eccellente stabilità13. In questo lavoro, abbiamo usato un metodo a passo singolo sonicazione per sintetizzare nanoparticelle lipidiche-polimero. Questo metodo è veloce, comodo e adatto per scale-up ed è stato ampiamente utilizzato per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero dal nostro gruppo11,14 e gli altri15,16,17,18 .

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) è un popolare carbodiimide usato come un agente di reticolazione per biomolecole contenenti ammine e carbossilati19di coniugazione. Oltre a EDC, N-Idrossisulfosuccinimide (NHS) è il più comune reagente di coniugazione in superficie e nanoparticelle coniugazione reazioni20,21. NHS può ridurre il numero di reazioni secondarie e migliorare la stabilità e rendimento di estere intermedi22,23.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. In primo luogo, la sintesi di passo singolo sonicazione delle nanoparticelle di DOX-caricati del lipido-polimero (DNPs) è descritto. Quindi, una tecnica di bioconjugate EDC/NHS per la generazione di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero è stato introdotto. Questa tecnica di bioconjugate è utilizzabile anche per coniugare altri anticorpi e peptidi alle nanoparticelle. Infine, descriviamo l'analisi fisico-chimica di proprietà e in vitro utilizzato per caratterizzare le nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. Crediamo che queste nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero potrebbero costituire un sistema efficace per la somministrazione mirata di farmaci per tumori più umani e la somministrazione mirata di payload di placenta per trattare i disordini placentari.

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Protocollo

1. preparazione delle soluzioni madri

  1. Preparare una soluzione acquosa di etanolo al 4% diluendo 4 mL di etanolo assoluto con 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione a 4 ° C.
    Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza contaminanti come batteri, particelle, ioni o nucleasi. Acqua ultrapura è stata ottenuta da un sistema di purificazione dell'acqua con una resistività di destinazione di mΩ·cm fino a 18,2, che significa bassa contaminazione anionici.
  2. Preparare un 1 mg/mL di soluzione madre di lecitina di soia sciogliendo 20 mg di lecitina di soia in 20 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione stock di lecitina di soia a 4 ° C.
  3. Preparate un 25 mg/mL soluzione di riserva (2000)-COOH DSPE-PEG sciogliendo 100mg di DSPE-PEG-COOH in 4 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.
  4. Preparate un 10 mg/mL soluzione di riserva di DOX sciogliendo 50 mg di DOX in 5 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva di DOX a 4 ° C al buio.
  5. Preparate un 2 mg/mL soluzione di riserva di PLGA sciogliendo 20 mg di PLGA in 10 mL di acetonitrile. Conservare la soluzione stock di PLGA a 4 ° C.
    Attenzione: Acetonitrile è infiammabile e tossico. Operare con cura in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi personali, quali camici, occhiali di sicurezza e guanti in lattice.
  6. Preparare una soluzione stock di 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acido (MES, pH 6.0) sciogliendo 2,17 g di MES in 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.

2. sintesi di DNPs

Nota: Per evitare la degradazione fotochimica DOX, tutte le operazioni sono state eseguite nel buio.
Le nanoparticelle sono state sintetizzate da un precedentemente segnalati passo singolo sonicazione metodo11,13,14.

  1. Aggiungere 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4% in una provetta sterile da 10 mL. Quindi, aggiungere 90 µ g della soluzione madre di lecitina di soia, 210 µ g di soluzione di riserva DSPE-PEG-COOH e 750 µ g di soluzione di riserva DOX a 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%.
  2. Inserire la provetta da centrifuga in un bagno di ghiaccio e posizionare il bagno di ghiaccio su un processore ad ultrasuoni.
  3. Con una siringa da 1 mL, pipettare 2 mg di soluzione di riserva di PLGA goccia a goccia (1 goccia/4-6 s) nella provetta della centrifuga. Nel frattempo, Sonicare tubo usando un processore ad ultrasuoni ad una frequenza di 20 kHz e un'ampiezza di uscita di 30% per 5 min per sintetizzare il DNPs.
    Nota: Per sintetizzare particelle uniformi con piccole dimensioni, la velocità alla quale la soluzione PLGA è gocciolata nella provetta deve essere lento, e generazione di bolla dovrebbe essere evitato.
  4. Purificare il DNPs lavando la soluzione di cui sopra in tampone MES 0.1 M (pH 6.0) 3 volte usando un filtro di centrifuga (MWCO, 10 kDa). Centrifuga a 4 ° C e 1000 × g per 3 minuti ogni volta. Infine, dovrebbero rimanere circa 1 mL di nanoparticelle MES-risolto.
    Nota: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Se non utilizzato per coniugare peptidi, le nanoparticelle possono essere purificate da tampone PBS (pH 7,4), e il DNPs purificata possono essere memorizzati a 4° C al buio.

3. coniugazione di peptidi a DNPs

  1. Attivazione dell'estere
    1. Aggiungere 0,4 mg di EDC (concentrazione finale di 2 mM) a 1 mL di DNPs.
    2. Aggiungere 0,24 mg di NHS alla reazione (concentrazione finale di 2 mM).
      Nota: Per aggiungere facilmente la corretta quantità di EDC e NHS, una soluzione di riserva può essere preparata se i reagenti sono dissolti e utilizzati immediatamente.
    3. Mescolare bene i componenti di reazione e posizionare la reazione su un agitatore; permettono di reazione per 30 min - 1 h a temperatura ambiente al buio.
  2. Reazione di ammina
    1. Aumentare il tampone a pH 7.2-7.5 utilizzando PBS (20 ×, pH 7.4).
    2. Aggiungere alla soluzione di reazione 0,5 mg del peptide plCSA-targeting (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC).
      Nota: Prima dell'addizione, sciogliere i peptidi in 20% acetonitrile. Se peptidi non sono solubili, sonicazione in un sonicatore vasca può utili.
    3. Mescolare bene la soluzione e poi posto su un agitatore; consentire la reazione di procedere a 4 ° C durante la notte nel buio.
    4. Posizionare la soluzione di coniugato in sacchetti di dialisi (MWCO, Da 3.500) a Dializzare e purificare il plCSA-DNPs utilizzando il tampone PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente per 24 h al buio.
      Nota: In alternativa, purificazione potrebbe essere eseguita come descritto al punto 2.4 per ottenere plCSA-DNPs.
    5. Per applicazioni della coltura delle cellule, filtrare la soluzione ricostituita per filtro da 0,22 µm siringa sterile per rimuovere potenziali precipitati.

4. caratterizzazione del lipido plCSA-mirati-nanoparticelle polimeriche

  1. Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS)
    1. Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (diluizione 50 volte). Caricare 500 µ l di campione in una provetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta.
      Nota: Potenziale Zeta e cuvette DLS possono variare basato sulle specifiche dello strumento.
    2. Una volta completata la misurazione, registrare il diametro della particella, indice di polidispersione (PDI) e potenziale zeta. Media i risultati ottenuti da 4 ripetono letture e calcolare la deviazione standard.
  2. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    Nota: La morfologia delle nanoparticelle è stata osservata da TEM con il metodo della macchia negativa. 24
    1. Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (400-fold diluizione). Aggiungere 20 µ l del campione su una griglia TEM e lasciar per riposare per 5 min.
    2. Aggiungere 100 µ l di acido fosfotungstico 2% (p/v) e lasciar per riposare per 2 min. stoppino via la goccia.
    3. Asciugare la griglia TEM a temperatura ambiente.
    4. Impostare la tensione di accelerazione TEM a 80 kV e ingrandire l'immagine a 100.000 × visualizzare le nanoparticelle.
  3. Determinazione dell'efficienza di incapsulamento (EE) e LE
    1. Generazione di curva standard. Sciogliere DOX in acqua ultrapura per preparare soluzioni DOX di cinque diverse concentrazioni: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. Generare una curva standard basata sulle concentrazioni di DOX.
    2. Diluire 25 µ l di nanoparticelle con 500 µ l di acqua ultrapura. Misurare l'assorbimento a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. La curva standard per calcolare le concentrazioni di farmaco.
    3. Calcolare LE usando la seguente equazione:
      LE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (Totale peso dei materiali)) × 100%.
    4. Calcolare il EE usando la seguente equazione:
      EE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta di droga)) × 100%.
  4. Misurazione dell'efficienza coniugazione usando l'analisi (BCA) acido bicinconinico 25 , 26 , 27
    1. Dispensare 25 µ l di soluzioni del peptide standard (tabella 1) o plCSA-DNPs nei pozzetti di micropiastre in duplice copia. Aggiungere 200 µ l del reagente lavoro in ciascun pozzetto e mescolare la piastra bene su un agitatore per piastre per 30 s.
    2. Coprire la piastra e incubare a 37 ° C per 30 min.
    3. Misurare l'assorbanza a 562 nm su un lettore di piastra. Utilizzare la curva standard generata per calcolare le concentrazioni di plCSA di plCSA-DNPs.
    4. Calcolare l'efficienza di coniugazione usando la seguente equazione:
      Efficienza di coniugazione = ((importo del peptide in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta del peptide)) × 100%.
FlaconcinoVolume di diluente (μL)Volume e origine del peptide (μL)Concentrazione finale del peptide (μg/mL)
A0300 di Stock1000
B250250 di fiala una diluizione500
C250250 di diluizione flaconcino B250
D250250 di diluizione flacone C125
E300200 di diluizione fiala D50
F250250 di diluizione del flaconcino E25
G400100 di diluizione flaconcino F5
H50000

Tabella 1. Preparazione di peptidi Standard

5. fluorescenza microscopia valutazione dell'assorbimento di nanoparticelle plCSA-mirati in cellule di coriocarcinoma (JEG3)

  1. Le cellule sui 12 pozzetti sterili a 1.0 × 10 di semi4 cellule/pozzetto con completa DMEM/F12 (cDMEM/F12, contenente 1% penicillina/streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS)). Permettono alle cellule di crescere alla confluenza del 60% a 37 ° C e 5% di CO2 in condizioni umide.
  2. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di media freddo fresco con un contenuto basso del siero (5% FBS) e DNPs o plCSA-DNPs (5 µ g di equivalenti DOX).
  3. Incubare la miscela delle cellule e nanoparticelle a 4 ° C per 1 h.
  4. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di fresco cDMEM/F12 e incubare le cellule a 37 ° C per 30 min.
  5. Rimuovere il cDMEM/F12 e lavare le cellule tre volte con PBS.
  6. Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule.
  7. Rimuovere il PFA. Lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Aggiungere 1 mL di PBS contenente DAPI (1 µ g/mL) per i nuclei di colorazione e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  8. Aspirare il PBS e lavare le cellule tre volte con PBS.
  9. Aggiungere liquido di montaggio e immagine della fluorescenza con un microscopio a fluorescenza, utilizzando canali verde e blu per visualizzare la DOX e nuclei, rispettivamente.

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Risultati

In questo protocollo, PLGA, DSPE-PEG-COOH e soia lecitina sono un polimero rappresentativo, coniugato del lipido-PEG-COOH e lipidi, rispettivamente. La sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati del lipido-polimero tramite un singolo passaggio sonicazione metodo e una tecnica EDC/NHS è illustrata nella Figura 1. In primo luogo, in condizioni di sonicazione, lecitina di soia, PLGA e DSPE-PEG-COOH si autoassemblano per formare nucleo-conchiglia strutturato...

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Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo efficace e riproducibile per la sintesi di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero. Il metodo di passo singolo sonicazione per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero è veloce, riproducibile e diverso dai metodi di nanoprecipitazione tipici che coinvolgono riscaldamento, Vortex o evaporazione. Quindi, il metodo sviluppato riduce significativamente il tempo di sintesi. Inoltre, l'EDC/NHS bioconjugate utilizzato in questo protocollo è una tecnica comunemente usata e co...

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Dichiarazioni

X.F. e B.Z. sono gli inventori il brevetto PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 inviato da SIAT che copre un metodo di sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati e applicazione. Nessun potenziali conflitti di interesse sono stati divulgati dagli altri autori.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da nazionali chiave della ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1000402), la Fondazione nazionale di scienze naturali (81571445 e 81771617) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Guangdong (2016A030313178) per Il fondo di ricerca di Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) a X.F. e X.F.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
plCSA peptideShanghai GL Biochem573518per la sintesi di peptidi
Etanolo assolutoSinopharm 10009218chimico per la sintesi di nanoparticelle
Lecitina di soiaAvanti Polar Lipids441601per la sintesi di nanoparticelle
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125per la sintesi
di nanoparticelleDoxorubicinaJKC 113424 chimicoper la sintesi di nanoparticelle
AcetonitrileShanghai Lingfeng1008621per la sintesi di nanoparticelle
PLGASigma-Aldrich 719897per la sintesi di nanoparticelle
Processore ad ultrasuoniSonicsVCX130per la sintesi di nanoparticelle
Filtro centrifugo (MWCO 10 kDa)MilliporeUFC801024per centrifuga di purificazione di nanoparticelle
Sigma3-18KSper purificazione di nanoparticelle
2-[morfolino]acido etansolfonico (MES)Sigma-AldrichM3671per coniugazione di peptidi
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) cloridrato di carbodiimmide (EDC)Sigma-Aldrich3450per coniugazione di peptidi
N-idrossisuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich56480per coniugazione di peptidi
, Sacche per dialisi,Spectrum132592Tper la purificazione di nanoparticelle
PBSHycloneSH30028.01per colture cellulari
, provette da centrifuga da 10 mL, polipropileneAladdinS-025per la sintesi di nanoparticelle
, provette da centrifuga da 15 mL, polipropileneCorning430791per varie applicazioni
0,22 μ m filtro siringa sterileMilliporeSLGV033RBper la purificazione di nanoparticelle
siringa da 1 ml, polipropileneBD328421per la sintesi di nanoparticelle
Malvern ZetasizerMalvernNano ZSper analizzatore granulometrico
Acidoper TEM
Griglia TEMEMCNBZ10024aper TEM
Spettrometro UV-VISLeageneDZ0035per TEM
Trasmissione
microscopio elettronico		JEOL JEM-100CXIIper analizzatore granulometrico
Reagente BCA AThermo Fisher Scientific23228per saggio BCA
Reagente BCA BThermo Fisher Scientific23224per saggio BCA
Piastre a 96 pozzettiCorning3599per BCA
test Lettore di piastreThermo Fisher ScientificMultiskan™ GOper il test BCA
Piastre a 12 pozzettiCorning3513per colture cellulari
JEG3 Bancacellulare dell'Accademia cinese delle scienzeTCHu195Planta umana
DMEM/F12HycloneSH30272.01fenolo privo di rosso
Siero fetale bovino (FBS)GIBCO10100per colture cellulari
Penicillina/streptomicinaGIBCO15070063per coltura cellulare
Microscopio a fluorescenzaOLYMPUSCKK53per captazione cellulare
ParaformaldeideShanghai Lingfeng1372021per captazione cellulare
DAPISangon BiotechA606584per captazione cellulare
Substrato di montaggioLifeP36961per captazione cellulare
, , fosfotungstico

Riferimenti

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