Articolo metodologico

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

DOI:

10.3791/58210

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20 settembre 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

In questo articolo

Sommario

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Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Abstract

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Gut homing delle cellule del sistema immunitario è importante per la patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Adesione di integrina-dipendente delle cellule di addressins è un passo fondamentale in questo processo e interferire con l'adesione di strategie terapeutiche sono state stabilite con successo. L'anticorpo di anti-α4β7 integrina, vedolizumab, è utilizzato per il trattamento clinico del morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) e altri composti sono propensi a seguire.

I dettagli della procedura di adesione e i meccanismi di azione degli anticorpi anti-integrina sono ancora poco chiari per quanto riguarda molti a causa delle limitate tecniche disponibili per la ricerca funzionale in questo campo.

Qui, presentiamo un saggio di adesione dinamico per l'analisi funzionale di adesione delle cellule umane in condizioni di flusso e l'impatto delle terapie anti-integrina nel contesto di IBD. Si basa sull'aspersione di cellule umane primarie attraverso capillari di vetro ultrasottile α4β7 rivestite con l'analisi al microscopio in tempo reale. Il saggio offre una varietà di opportunità per modifiche e perfezionamenti e detiene potenzialità per applicazioni traslazionale e meccanicistici scoperte.

Introduzione

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Movimento delle cellule è un processo strettamente regolato indispensabile per lo sviluppo e la funzione degli organismi pluricellulari, ma inoltre è implicata nella patogenesi di una moltitudine di malattie1. Recentemente, il processo di homing delle cellule immuni dal flusso sanguigno ai tessuti periferici ha guadagnato l'attenzione aumentante, poiché contribuisce al rifornimento e all'espansione delle cellule patogene in tessuti infiammati in malattie immunologicamente mediate2 ,3. In particolare, l'homing ha dimostrato di avere rilevanza traslazionale in malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Il terapeutico anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferire con homing gut ha indicato l'efficacia in studi clinici di grandi4,5 ed è stato utilizzato con successo nel mondo reale pratica clinica6,7 , 8. ulteriori composti sono propensi a seguire9,10. Allo stesso modo, l'anticorpo di integrina terapeutico anti-α4, natalizumab, è utilizzato per il trattamento della sclerosi multipla (MS)11.

Tuttavia, la nostra comprensione funzionale del processo di homing in generale e il meccanismo di azione di tali anticorpi terapeutici in particolare è ancora limitato. È assodato che homing è costituito da diversi passaggi tra cui cella tethering e rotolamento con adesione successiva delle cellule che conduce all'arresto costante seguita da trans migrazione endoteliale12,13. I suddetti anticorpi neutralizzano le integrine sulla superficie delle cellule impedendo l'interazione con addressins sull'endotelio della parete del vaso. Questo è pensato per impedire cella ferma adesione14,15. Eppure, stiamo solo cominciando a capire la rilevanza differenziale delle integrine specifiche per homing delle cellule dei sottogruppi distinti delle cellule. Inoltre, gli effetti degli anticorpi anti-integrina su diversi sottoinsiemi del cellulare e associazioni di dose-risposta sono in gran parte sconosciute che conduce a un sacco di domande aperte nel campo delle terapie di homing e anti-adesione di intestino in IBD.

Pertanto, strumenti utili per affrontare tali questioni sono disperatamente necessari. L'effetto degli anticorpi anti-integrina sull'interazione integrina α4β7 finora è stata valutata principalmente valutando l'inibizione di efficacia/associazione associazione con citometria a flusso o tramite adesione statica saggi16,17 ,19,18,20, così con apparente semplificazione e deviazione dalla situazione fisiologica. Recentemente abbiamo stabilito un'analisi di adesione dinamico per studiare l'adesione integrine-dipendente delle cellule umane per addressins e gli effetti degli anticorpi anti-integrina sotto sollecitazione di taglio2. Il principio della tecnica è stato dimostrato in precedenza con mouse cellule21,22. Qui, si era adattato e sviluppato per affrontare le questioni di cui sopra traslazionale, apertura nuovi viali per meglio comprendere i meccanismi della terapia con anticorpi anti-integrina in vivo.

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Protocollo

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Gli studi descritti nelle sezioni seguenti sono stati eseguiti secondo l'approvazione del comitato etico dell'Università Friedrich-Alexander Erlangen-Norimberga.

1. preparazione dei capillari

  1. Collegare rettangolari capillari al tubo di gomma che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0.5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra tubo con pellicola di plastica paraffina e capillare.
  2. Cappotto del capillare con 20 µ l di MADCAM1 (ricombinante Fc chimera; 5 µ g/mL α4β7, ad es. MAdCAM-1, in tampone di rivestimento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES)) o la soluzione di controllo di isotipo appropriato utilizzando una pipetta p20 (fluido stesso si immergeranno nel capillare). Quindi, il lato non collegato al tubo con la pellicola di plastica paraffina ed incubare per almeno 1 h a 37 ° C. Utilizzare un capillare riempito solo con il tampone di rivestimento o con il controllo di isotipo appropriato come controllo negativo.
  3. Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare, svuotare il rivestimento lasciando il liquido soak fuori il capillare su un capillari di asciugamano e blocco di carta per almeno 1 h con 20 µ l di blocco soluzione (1x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sigillare il lato aperto del capillare con pellicola di plastica paraffina. Non rimuovere la soluzione bloccante prima di procedere alla microscopia.

2. cella di isolamento, trattamento e preparazione per microscopia

Nota: Questa procedura può essere eseguita durante l'incubazione periodi necessari per la preparazione capillare.

  1. Raccogliere 18 mL di sangue intero umano anticoagulated con un prelievo di sangue asettica impostato dalla vena cubitale del volontariato persone (per esempio, pazienti affetti da IBD e/o controlli sani) dopo consenso informato scritto secondo le regolazioni del locale Comitato etico.
    Nota: Questa operazione deve essere eseguita solo da personale medico qualificato ed esperto secondo le normative nazionali e/o locale.
  2. Riempire il sangue in una provetta da 50 mL e diluire fino ad un volume di 35 mL con PBS 1X. Quindi sottoposto la miscela di sangue-PBS con 10 mL di terreno di gradienti di densità.
  3. Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità per 15 min a 800 x g e 24 ° C, senza freno per separare le cellule.
  4. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) aspirando lo strato delle cellule bianche proprio sopra lo strato medio gradiente di densità (strato trasparente centrale). Trasferire PBMCs in una provetta di fresca 50 mL, riempire fino a 50 mL con 1x PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g e 10 ° C.
  5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS successivamente contare i numeri di cellulare, per esempio, utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.
  6. Facoltativo: Per studiare l'adesione dei granulociti eseguire la procedura seguente. In caso contrario, procedere con il passaggio 2.7 o 2,8.
    1. Raccogliere lo strato del granulocyte (livello più basso dopo centrifugazione in gradiente di densità contenente anche eritrociti). Risospendere le cellule in 40 mL di PBS 1X. Quindi aggiungere 8 mL di 6% destrano in PBS 1X, mescolare delicatamente e lasciare il sedimento di celle a temperatura ambiente per 30 minuti.
      Nota: Gli eritrociti affonderanno alla parte inferiore del tubo, mentre i granulociti rimarrà in sospensione.
    2. Dopo 30 min, raccogliere il surnatante, trasferire in un tubo fresco da 50 mL e centrifugare per 6 min a 300 x g e a 4 ° C. Scartare il surnatante e lisare gli eritrociti rimanenti aggiungendo 5 mL di 0,2% NaCl in ddH2O. Incubare per 1 min.
    3. Aggiungere 5 mL di 1,4% NaCl in ddH2O e incubare per un altro minuto. Fermare la Lisi ipotonica aggiungendo 20 mL di 1X PBS e centrifugare per 6 min a 300 x g e 4 ° C.
    4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS. Quindi, contare i numeri di cellulare utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.
  7. Facoltativo: Per studiare l'adesione dei sottoinsiemi PBMC, purificare diversi tipi di cellule o sottoinsiemi (ad es., CD4+ e CD8+ T cellule o CD19+ B cellule) utilizzando microsfere secondo il protocollo del produttore o di fluorescenza-attivato cella ordinamento (FACS). In caso contrario, procedere con il passaggio 2.8.
  8. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 300 x g e 10 ° C. Scartare il surnatante e macchia le cellule con cellulare tracciante (ad es., CFSE) secondo le istruzioni del produttore.
  9. Successivamente, centrifugare le cellule per 10 min a 300 x ge scartare il surnatante. Risospendere in 1X PBS, determinare il numero di cell e centrifugare nuovamente per 10 min a 300 x g.
  10. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
    Nota: Queste cellule sono ora pronte per microscopia.
  11. Opzionale: Curare le cellule con citochine, neutralizzando gli anticorpi o altri composti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.
    1. Omettere il passaggio 2.10 e risospendere il pellet cellulare macchiato dal passaggio 2.9 nel medium RPMI (con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina) per ottenere una concentrazione di 1.5 x 106 cellule/mL.
    2. Pipettare 1 mL di questa sospensione cellulare in altrettanti pozzetti di una piastra di 48-bene come ci sono le condizioni per essere analizzati. Sempre preparare un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare non patinata come controllo negativo e un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare α4β7 rivestite come controllo positivo.
    3. Per il trattamento con anticorpi anti-integrina, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (ad esempio, 10 µ g/mL vedolizumab) alla sospensione di cellule. Incubare per 1 h a 37 ° C. Per il trattamento con citochine, aggiungere la quantità appropriata di citochina ricombinante (ad esempio, 10 ng/mL CXCL10) alla sospensione di cellule. Incubare per 5 min a 37 ° C.
    4. Dopo l'incubazione, è necessario raccogliere le cellule di risospendere le cellule più volte utilizzando una pipetta p1000. Trasferire le cellule in una provetta da 2 mL, risciacquare bene con 1 mL di PBS 1X e aggiungere alla provetta 2 mL. Determinare il numero di cellulare.
      Nota: L'incubazione di popolazioni di cellule aderenti (ad es., monociti) potrebbe richiedere ulteriori misure (ad es., il trattamento con tripsina) per staccare le cellule dalla piastra.
  12. Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g e a 10 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in quantità adeguata di buffer di adesione per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Quando il pretrattamento con chemochine non aggiungere MnCl2 alla sospensione di cellule. Queste cellule sono ora pronte per microscopia.
    Nota: Il volume minimo utilizzato per il dosaggio dipende dalla pompa e la tubazione utilizzata. In questo studio, utilizzando la pompa peristaltica e la tubatura specificato nella Tabella materiali, era richiesto un volume minimo di 400 µ l. Se desiderata e applicabile (a seconda del tipo di cella e rendimento), la concentrazione di cellule in sospensione può essere aumentata per misurare più alta adesione in un breve periodo di tempo.
  13. Possibili modifiche: analisi di adesione dinamica competitiva
    1. Eseguire i passaggi di cui sopra con popolazioni differenti delle cellule per essere confrontate tra loro (ad es., regolamentazione e cellule T effettrici isolate attraverso l'isolamento di biglie magnetiche seguendo le istruzioni del produttore secondo il punto 2.7).
    2. Macchia di ogni popolazione con un colorante diverso (ad es., CFSE e Fichera) come descritto nei passaggi 2.8 – 2,9 per essere in grado di distinguere le popolazioni delle cellule durante la microscopia.
    3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL.
    4. Volumi uguali di sospensioni di cellule (ad es., 500 µ l di cellule T regolatorie) e 500 µ l di cellule T effettrici di mescolare per ottenere un finale misto della concentrazione cellulare di 1.5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Tali sospensioni possono essere utilizzati successivamente per analisi competitiva del processo di adesione irrorando popolazioni differenti delle cellule attraverso la capillare stesso.

3. live Cell Imaging di aderenza dinamica

  1. Accendere il microscopio e selezionare il filtro appropriato o laser per eccitare la cellula di rilevamento dye(s) (ad es., 488 laser di nanometro per CFSE), un obiettivo appropriato (ad es., 40 X) e un imaging di intervallo di acquisizione modalità abilitazione tempo.
  2. Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare e collegare il capillare con un breve pezzo di tubo (circa 5 cm di lunghezza) che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0,5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra il tubo con la pellicola di plastica paraffina e capillare.
  3. Montare il capillare su un vassoio di fissazione (ad es., coperchio da una piastra a 6 pozzetti con un cut-out rettangolare leggermente più corto rispetto alla lunghezza del capillare) e posizionare il capillare fisso sul titolare del vassoio del microscopio, in modo che il capillare è in stato attivo e pronto per microscopia.
  4. Inserire il tubo di gomma nella corrispondente tacca della pompa peristaltica e posizionare l'estremità non collegato alla capillare nella provetta del campione secondo contenente la sospensione cellulare. Inserire il tubo corto sul lato opposto del capillare in una provetta da 15 mL per raccogliere flusso continuo.
  5. Lasciate che il riempimento della tubazione con una portata di 500 µ l al minuto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge quasi il capillare. Poi lasciare che il riempimento capillare con una portata di 100 µ l/min.
    Nota: Un rapido riempimento del capillare assicura una distribuzione regolare della sospensione delle cellule all'interno del capillare.
  6. Quando il capillare è riempito con una sospensione cellulare, regolare la portata a 10 µ l/min.
    Nota: Queste portate possono variare, quando vengono utilizzati i capillari di dimensioni diverse o diverse pompe peristaltiche. In questo studio, il tasso di flusso di 10 µ l/min è stato ottimizzato per la pompa e capillari per simulare il flusso sanguigno in vivo .
  7. Catturare immagini time-lapse delle cellule si muove lentamente attraverso il capillare lungo la α4β7 rivestite all'interno muro ogni 2 s per un totale di 3 min.
    Nota: Gli intervalli e il tempo totale può variare a seconda del tipo di cella e questione da affrontare.
  8. Prima di gettare il capillare, schermo intero capillare attraverso l'oculare del microscopio per assicurarsi che la sezione mostrata nel video è rappresentante. Se necessario, effettuare una seconda registrazione.
  9. Liberate il tubo dalla pompa e lasciate che il liquido rimanente correre indietro nella provetta 2 mL, poi scollegare la tubazione e capillare dal vassoio di fissazione e continuare con il successivo capillare.

4. valutazione e conta cellulare

  1. Aprire la sequenza di time-lapse con il software appropriato ed esportare le prime tre immagini ("inizio") e le ultime tre immagini ("fine") come file Tiff.
  2. Aperte le tre immagini "Beginning" in ImageJ, convertire a 32 bit ('immagine | Tipo | 32 bit') e unire immagini (' immagine | Colore | Unire i canali; assegnare i colori rossi, verdi e blu per le differenti immagini). Convertire immagine composita in RGB (' immagine | Type-RGB') e salvare come file Tiff. Ripetere l'operazione con le immagini di "Fine".
    Nota: Nell'analisi di adesione dinamica competitiva con le cellule colorate con colori diversi, in primo luogo dividere i canali delle immagini per analizzare separatamente adesione delle popolazioni differenti delle cellule.
  3. Contare le celle bianche visibili nel composito "Inizio" e "Fine" e sottrarre il numero di globuli bianchi nel «Principio» da cellule bianche alla "fine".
    Nota: La differenza rappresenta il numero di nuovi aderenti cellule nell'intervallo di tempo di 3 min. Nell'immagine composita, cellule che spostato sono visibili nel colore specifico che è stato assegnato al rispettivo telaio poiché essi localizzare in un altro posto nel frame precedente e seguente. Per le celle che sono aderenti, i segnali rossi, verde e blu nel stesso posto si sovrappongono al bianco.
  4. Per visualizzare meglio i risultati, è necessario compilare un video dalle sequenze di time-lapse, per esempio, usando ImageJ.

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Risultati

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Il metodo presentato in questo manoscritto ha lo scopo di simulare il processo di in vivo di adesione delle cellule umane per la parete endoteliale quanto più possibile a funzionalmente valuta adesione delle cellule e il ruolo degli anticorpi interferenti. Di conseguenza, ultrasottili capillari sono rivestiti con addressins e irrorati con le cellule umane fluorescente contrassegnate di interesse utilizzando una pompa di perfusione. Utilizzando cellule vive l'adesione delle cellul...

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Discussione

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Il protocollo di cui sopra descrive una tecnica utile per studiare la dinamica adesione delle cellule immuni umane a ligandi endoteliali. Attraverso la variazione di ligandi rivestiti, tipi cellulari irrorato o sottoinsiemi, incubazione con stimoli ulteriori o diversi anticorpi neutralizzanti, ha quasi illimitato di potenziali applicazioni. Pertanto, tali dosaggi di adesione dinamica possono essere utile per rispondere a entrambe le domande fondamentali della ricerca di base, nonché query traslazionale che potrebbe contr...

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Dichiarazioni

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M.F.N. ha servito come consulente per Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. M.F.N. e S.Z. ha ricevuto il sostegno alla ricerca da Takeda e Roche.

Ringraziamenti

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La ricerca di CN, IA, MFN e SZ è stata sostenuta dal centro interdisciplinare per ricerca clinica (IZKF) e il programma ELAN dell'Università di Erlangen-Norimberga, l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung di Crohn tedesco e Colite Foundation (DCCV), la clinica ricerca gruppo CEDER di Consiglio di ricerca tedesca (DFG), il programma di argomento DFG sul Microbiota, l'iniziativa di campo emergente ed il DFG Collaborative Research centri 643, 796 e 1181.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 48 pozzettiSarstedt833.923
Tampone di adesione: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
Soluzione bloccante: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Albumina sierica bovina (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Capillari Merck2382
: tubo Boro rettangolare 0,20 mm x 2,00 mm ID, lunghezza 50 mmCM Scientific3520-050
CCL-2, immunotools umano11343384
CD4-Microbeads,Miltenyi Biotec130-045-101
umano CellTrace™ Kit di proliferazione cellulare CFSEThermoFischer ScientificC34554
Centrifuga (Rotixa 50 RS)TamponeHettrich
: 150 mM NaCl + 1 mM Microscopio
(TCS SP8)Leica
CXCL-10, umanoImmunotools11343884
destrano 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falcons (50 mL)Sarstedt62,547,004
Fc chimera controllo isotipoR& D Systems110-HG
Portate Pompa peristaltica (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Controllo dell'isotipo IgG umanoThermoFischer Scientific31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimeraR& D Systems720-IC-050
LS-ColonneMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
controllo dell'isotipo IgG del topoMiltenyi Biotec130-106-545
Indirizzo vascolare della mucosa nella molecola di adesione cellulare 1 (MAdCAM-1)R& D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer Camera di conteggioRothT729.1
Pancoll, umanoPAN BiotechP04-601000
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) BiochromL 182-10senza Mg e Ca
Film di paraffina plastica: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
CD18 anti-umano purificatoBiolegend 302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Tubi in gomma: SC0059T tubi LMT-55 a 3 stop, diametro interno 1,02 mm, lunghezza 406,4 mmIsmatecSC0059
Pipetti sierologiciSarstedt861,254,025
Trypan blueRothCN76.1
Molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend553706
Vedolizumab (Entyvio)Takeda
di rivestimento confocale HEPES

Riferimenti

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