Articolo metodologico

Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

DOI:

10.3791/58229

⸱

30 ottobre 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) nel cervello. Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloide-β (Aβ) provoca disturbi della memoria nel morbo di Alzheimer (annuncio). Anche se terapeutica sono stati indicati per ridurre i livelli di Aβ nei cervelli dei pazienti dell'annuncio, questi non migliorano le funzioni di memoria. Poiché Aβ aggrega nel cervello prima della comparsa dei disturbi della memoria, targeting Aβ può essere inefficiente per il trattamento di pazienti dell'annuncio che già esibiscono i deficit di memoria. Pertanto, la segnalazione a valle a causa della deposizione di Aβ deve essere bloccato prima di sviluppo AD. Aβ induce degenerazione assonale, che conduce alla rottura delle reti neuronali e disturbi della memoria. Anche se ci sono molti studi sui meccanismi della tossicità Aβ, la fonte di tossicità Aβ rimane sconosciuta. Per identificare la fonte, vi proponiamo un romanzo protocollo che utilizza la microscopia, la transfezione genica e live cell imaging per studiare i primi cambiamenti causati da Aβ in coni di crescita assonali dei neuroni coltivati. Questo protocollo ha rivelato che Aβ indotta endocytosis clathrin-mediato in coni di crescita assonali seguita da collasso di cono di crescita, che dimostrano che l'inibizione dell'endocitosi impedisce la tossicità Aβ. Questo protocollo sarà utile per studiare gli effetti iniziali di Aβ e può condurre al trattamento annuncio più efficace e preventivo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depositi di amiloide-β (Aβ) si trovano nel cervello dei pazienti con morbo di Alzheimer (annuncio) e sono considerati una causa critica AD1 che interrompono le reti neuronali, che conduce a memoria i danni2,3,4. Molti clinici farmaci candidati hanno dimostrati di prevenire efficacemente la produzione di amiloide-β (Aβ) o rimuovere i depositi di Aβ. Tuttavia, nessuno ha avuto successo nel migliorare la funzione di memoria in annuncio pazienti5. Aβ è già depositato nel cervello prima dell'inizio di memoria menomazioni6; di conseguenza, diminuire i livelli Aβ nei cervelli dei pazienti espositrici menomazioni di memoria possono essere inefficace. Deposizione di Aβ è presente nei pazienti dell'annuncio preclinici; Tuttavia, questi pazienti presentano raramente con deficit di memoria e degenerazione neuronale6. C'è un ritardo tra la deposizione di Aβ e disturbi della memoria. Pertanto, una strategia critica per la prevenzione dell'annuncio sta bloccando la tossicità Aβ segnalazione durante le prime fasi dell'annuncio, prima dello sviluppo dei deficit di memoria. Deposizione di Aβ induce assone degenerazione7,8,9,10,11,12,13, che può portare a una rottura del reti neurali e danno permanente della funzione di memoria. Molti studi hanno studiato i meccanismi di tossicità Aβ; ad esempio, gli assoni degenerati di cervelli dell'annuncio topi sono stati indicati per hanno aumentato l'autofagia14. Attivazione di calcineurina è stata segnalata come un possibile meccanismo di degenerazione assonale indotta da Aβ15; Tuttavia, l'innesco diretto di degenerazione assonale rimane sconosciuto.

Questo studio si concentra sul crollo delle terminazioni assonali chiamati coni di crescita. Il crollo dei coni di crescita assonale può essere causato da repellenti per la crescita assonale, come semaforine-3A ed efrina-A516,17,18,19,20. Collasso-come terminazioni assonali distrofici sono state osservate nei cervelli dei pazienti AD21,22. Inoltre, un fallimento della crescita cono funzionamento può provocare la degenerazione assonale23. Tuttavia, non è noto se Aβ induca collasso del cono di crescita. Di conseguenza, questo studio presenta un romanzo protocollo per osservare i primi effetti di Aβ in colture di neuroni e indagare il collasso del cono di crescita indotta da Aβ.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio presso il Campus di Sugitani della Università di Toyama e sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali e uso di animali da laboratorio presso il Campus di Sugitani della Università di Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. crollo Assay

  1. Rivestimento di poli-D-lisina
    1. Cappotto di diapositive di cultura 8 pozzetti con 400 μL di 5 μg/mL poli-D-lisina (PDL) in tampone fosfato salino (PBS) e li Incubare a 37 ° C durante la notte.
    2. Rimuovere la soluzione PDL e lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata.
  2. Neurone cultura24
    1. Tritare appena isolate cortecce cerebrali da giorno embrionale 14 (E14) del ddY con microforbici nel neurone mezzo di coltura contenente 12% di siero equino, 0,6% glucosio e 2 mM L-Glutammina (medium A). Non aggiungere antibiotici.
      Nota: In questo protocollo, viene utilizzato il mouse ddY. Si tratta di un ceppo nazionali comunemente utilizzato in Giappone. Questo protocollo di cultura del neurone può essere applicato anche per i neuroni corticali del ratto7,25.
    2. Centrifugare i tessuti a 87 x g per 3 min.
    3. Eliminare il surnatante. Quindi per il pellet, aggiungere 2 mL di tripsina 0.05% e incubare per 15 min a 37° C. Mescolare scuotendo ogni 5 min.
    4. Aggiungere 4 mL di medium A e mix toccando.
    5. Centrifugare i tessuti a 178 x g per 3 min.
    6. Rimuovere il surnatante e incubare i tessuti con 600 U/mL dnasi I e inibitore della tripsina della soia di 0,3 mg/mL disciolto in PBS per 15 min a 37 ° C. Mescolare scuotendo ogni 5 min.
    7. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 mL di medium A e mix toccando.
    8. Centrifugare i tessuti a 178 x g per 3 min.
    9. Dopo aver rimosso il sovranatante, aggiungere 4 mL di medium A e triturare i tessuti con una pipetta Pasteur lucido.
    10. Filtrare i tessuti triturati con una mesh di formato del poro di 70 µm. Dopo filtrazione, calcolare la densità delle cellule con un emocitometro.
    11. Cultura le cellule nella cultura 8 pozzetti scivolo a 0,8 x 104 cellule/pozzetto con medium A e mantengono in un incubatore a CO2 con atmosfera umidificata di 10% CO2 a 37 ° C.
    12. Dopo 4 h di coltura, sostituire il terreno di coltura per un contenenti 2% supplemento per coltura neuronale, 0,6% glucosio e 2 mM L-Glutammina (medium B).
      Nota: La purezza dei neuroni era circa il 75%, come descritto in precedenza26.
  3. Crollo dosaggio27
    1. Sciogliere commercialmente ottenuti full-length amiloide β1-42 (Aβ1-42) in acqua distillata ad una concentrazione di 0,5 mM e incubare a 37 ° C per 7 giorni. Dopo l'incubazione, è necessario conservare la soluzione di Aβ1-42 aggregata in un congelatore a-30 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: al termine dell'incubazione è necessario per l'aggregazione e la tossicità di Aβ27,28,29,30.
    2. Dopo 4 giorni di coltura neuronale, trattare i pozzetti con 100 μL di nuovi media B, contenenti 0,5 μM aggregati Aβ1-42 o veicolo soluzione (acqua distillata) per 1 h.
      Nota: Gli effetti del Aβ1-42 dose-dipendente erano aumentati da 0,1 a 5 μM e ha raggiunto la posizione di 0,5 μM come descritto in precedenza27. Risultati simili possono essere osservati quando dal trattamento Aβ1-42 per 1 h dopo 3 giorni di coltura neuronale31.
    3. Rimuovere il terreno di coltura e risolvere immediatamente i neuroni con paraformaldeide al 4% contenente saccarosio 4% in PBS per 1h a 37 ° C su una piastra calda.
    4. Dopo la fissazione, lavare i neuroni 3 volte con PBS e montarli con un mezzo di montaggio acquoso. Asciugare il mezzo di montaggio a 4 ° C per 2 – 4 giorni.
    5. Catturare l'intera area (7.8 x 9 mm2) di ciascun pozzetto con un 20 X obiettivo asciutto sul microscopio invertito.
    6. Classificare i neurites più lungo di ogni neurone in fase 3 o 4 come assoni, come descritto in precedenza32,33.
    7. Classificare i coni di crescita secondo i seguenti criteri: coni di crescita 1) axonal carente lamellipodi o 2) possesso di meno di tre filopodi sono considerati crollato coni di crescita, come descritto in precedenza17.
      Nota: I coni di crescita sano sono segnati come punto 0; coni di crescita compresso sono segnati come 1 punto. Significa crollo i punteggi sono calcolati per ogni trattamento.

2. amiloide β Immunostaining

  1. Neuroni corticali di topo di cultura per 3 giorni, come descritto al punto 1.2.
  2. Trattare con aggregati Aβ1-42 (5 μM) o veicolo per 4 h a 37 ° C in un incubatore a CO2 .
  3. Senza rimuovere il mezzo, aggiungere un volume uguale di paraformaldeide 4% contenente saccarosio 4% in PBS in ciascun pozzetto e mantenere la coltura a 37 ° C su una piastra calda per 5 min.
  4. Sostituire la soluzione con 400 μL di paraformaldeide 4% contenente saccarosio 4% in PBS e mantenere a 37 ° C sulla piastra calda per 1 h. Questo protocollo di fissazione è stato modificato da una relazione precedente34.
  5. Lavare i neuroni 3 volte con PBS.
  6. Bloccare con siero di capra normale di 5% in PBS.
  7. Incubare i neuroni con immunoglobulina di topo anti-amiloide β G (IgG) (01:50) e 1% albumina di siero bovino in PBS a 4 ° C durante la notte.
  8. Lavare i neuroni 3 volte con PBS.
  9. Incubare i neuroni con un anticorpo secondario coniugato fluorescenza (1: 400) e 1% albumina di siero bovino in PBS a temperatura ambiente per 2 h.
  10. Lavare i neuroni 3 volte con PBS e montarli con un mezzo di montaggio acquoso.
  11. Catturare immagini di fluorescenza e immagini luminose del campo con illuminazione obliqua utilizzando un obiettivo asciutto 40 X il microscopio invertito B.

3. axonal Immunostaining27

  1. Lavare i neuroni 3 volte con PBS dopo la fissazione del neurone coltivate, come descritto al punto 1.3.3.
  2. Incubare i neuroni con mouse anti-tau-1 IgG (1: 500), proteina associata ai anti-microtubuli di coniglio 2 (MAP2) IgG (1: 500) in siero di capra normale 5% e 0.3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol in PBS a 4 ° C durante la notte.
  3. Lavare i neuroni 3 volte con PBS.
  4. Incubare i neuroni con anticorpi secondari coniugati a fluorescenza (1: 400) e t- octylphenoxypolyethoxyethanol 0,3% in PBS a temperatura ambiente per 2 h.
  5. Lavare i neuroni 3 volte con PBS e montare utilizzando un mezzo di montaggio acquoso.
  6. Acquisire immagini a contrasto (DIC) interferenza differenziale e fluorescenza utilizzando una lente obiettiva secco 20 × sul microscopio invertito A.

4. live Cell Imaging27

  1. Cappotto di piatti a base di vetro con 500 μL di PDL (5 μg/mL), come descritto al punto 1.1.1.
    Nota: In questo protocollo, piatti fatti in casa a base di vetro sono stati utilizzati. Piatti a base di vetro disponibili in commercio possono essere utilizzati anche per l'imaging in vivo. Piatti fatti in casa a base di vetro sono stati preparati come segue: 1) fare un foro di circa 1,4 mm di diametro al centro di un piatto di 35mm con un pugno con la mano e 2) collegare un vetrino coprioggetti (diametro 22 mm) sul retro del piatto con del silicone.
  2. Lavare i piatti con acqua distillata, come descritto al punto 1.1.2 e cultura i neuroni corticali nel piatto a base di vetro a 3 x 104 cellule/piatto con A medio, come descritto al punto 1.2.
  3. Dopo 4 giorni di coltura cellulare, sostituire il mezzo con 2 mL di terreno nuovo B e trasferimento il piatto al microscopio r. Maintain invertito la cultura in atmosfera umidificata 10% CO2 a 37 ° C.

5. endocitosi esperimento

  1. Come descritto al punto 1.2 della coltura i neuroni corticali di topo.
  2. Quattro giorni dopo, sostituire il mezzo con 100 μL di nuovo mezzo B contenente la sonda membrana fluorescenza di 20 μM per 1 min.
  3. Aggiungere 1 μL di 0,05 mM aggregati Aβ1-42 (finale 0,5 μM) o soluzione del veicolo (acqua distillata) e mescolare pipettando. Incubare per 20 minuti.
  4. Rimuovere il supporto e lavare i pozzetti due volte con mezzo B che è stato pre-riscaldato a 37 ° C.
  5. Difficoltà, lavare e montare i neuroni come descritto ai punti 1.3.3 e 1.3.4.
  6. Catturare immagini DIC con un 63 X olio obiettivo sul microscopio invertito A. e fluorescenti
  7. Quantificare la densità della zona di sonda-positivi membrana di fluorescenza in ciascun cono di crescita sana utilizzando un software di immagine.

6. Gene transfezione

  1. Preparare i neuroni corticali come descritto al punto 1.2. Dopo aver completato i passaggi 1.2.1-1.2.10, centrifugare i neuroni a 178 x g per 3 min.
  2. Eliminare il surnatante, aggiungere 4 mL di Ca2 +-libero e Mg2 +-libera soluzione salina bilanciata di Hanks' (CMF-HBSS) e Miscelare pipettando.
  3. Centrifugare le cellule a 178 x g per 3 min.
  4. Eliminare il surnatante, aggiungere 4 mL di CMF-HBSS e Miscelare pipettando. Successivamente, calcolare la densità delle cellule, come descritto nel passaggio 1.2.10.
  5. Trasferire 5 x 106 cellule in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.677 x g per 1 min.
  6. Eliminare il surnatante, aggiungere 100 μL di soluzione di transfezione con supplemento e 3 μg di plasmide DNA codifica EGFP o EGFP-AP180 C-terminus e Miscelare pipettando.
  7. Trasferire la soluzione di cui sopra (punto 6.6) a una cuvetta certificata e transfect con un electroporator, secondo il protocollo del produttore.
  8. Immediatamente dopo la trasfezione, aggiungere 500 μL di medium A nella cuvetta e trasferire la soluzione in una provetta da 1,5 mL con una pipetta certificata. Successivamente, calcolare la densità delle cellule, come descritto nel passaggio 1.2.10.
  9. Coltura, le cellule in una diapositiva di 8 pozzetti cultura a 0,8 x 104 cellule/pozzetto, come descritto nei passaggi 1.2.11 e 1.2.12.
  10. Dopo 4 giorni di coltura cellulare, è necessario eseguire un'analisi di crollo come descritto al punto 1.3.

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Risultati

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In questo protocollo, Aβ1-42 è stato incubato a 37 ° C per 7 giorni prima dell'uso, perché l'incubazione di Aβ1-42 era necessario per la produzione di forme tossiche27,28,30,35. Dopo questa incubazione, forme aggregate di Aβ sono state osservate (Figura 1A). È stato segnalato che l'incubazione simile di Aβ1-42 prodotto forma fibrill...

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Discussione

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Il protocollo descritto in questo studio abilitato l'osservazione di fenomeni precoce nei coni di crescita assonale dopo il trattamento Aβ1-42. Aβ1-42 indotto endocitosi in coni di crescita assonali entro 20 min, e collasso del cono di crescita è stato osservato entro 1 h di trattamento. Questa endocitosi probabilmente è stata mediata da clatrina. Utilizzando questo protocollo, l'inibizione dell'endocitosi clatrina-mediata è stata confermata per prevenire il collasso del cono di crescita indotta da Aβ1-42 e degenerazione...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla di divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di ricerca da JSP (KAKENHI 18K 07389), Giappone, Takeda Science Foundation, Giappone e Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ddY topiSLC
Vetrino di coltura a otto pozzettiFalcon354108
poli D lisinaWako168-19041
Terreno di coltura, terreno neurobasaleGibco21103-049
siero domesticoGibco26050-088
glucosioWako049-31165
L-glutamminaWako074-00522
0,05% tripsinaGibco25300-054
DNasi IWorthingtonDP
inibitore della tripsina di soiaGibco17075-029
Filtro con 70 µ m dimensione delle maglie, filtro cellulareFalcon352350
B-27 supplementoGibco17504-044
CO2 incubatoreAstecSCA-165DS
Amiloide &; 1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldeideWako162-16065
saccarosio Wako196-00015
Mezzo di montaggio acquoso, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Microscopio invertito ACarl ZeissAxio Observer Z1 Collegato con AxioCam MRm, unità di riscaldamento XL S, modulo CO2 S1 e TempModule S1
Obiettivo Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Obiettivo Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amiloide e beta; anticorpoIBL10379clone 11A1
siero di capra normaleWako143-06561
siero bovino albuminaWako010-25783
t-ottilfenossipolietossietossietanoloWako169-21105
capra anti-topo IgG coniugata con AlexaFluor 594InvitrogenA11032
capra anti-coniglio IgG coniugata con AlexaFluor 488InvitrogenA11029
piastra riscaldanteNISSINNHP-M30N
vetro di coperturaFisher Scientific12-545-85
piatto da 35 mmIWAKI1000-035
Silicone RTVShin-EtsuKE42T
punzone a manoRoper WhitneyNo. XX
Sonda a membrana per fluorescenza, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- e Mg2+-free Soluzione salina bilanciata di HanksGibco14175-095
Soluzione di trasfezione, Soluzione nucleofettriceLonzaVPG-1001
Elettroporatore, Nucleofector IAmaxa
Microscopio invertito BKeyenceBZ-X710
Software di immagine, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/

Riferimenti

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