Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

Sommario

Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) nel cervello. Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.

Abstract

Amiloide-β (Aβ) provoca disturbi della memoria nel morbo di Alzheimer (annuncio). Anche se terapeutica sono stati indicati per ridurre i livelli di Aβ nei cervelli dei pazienti dell'annuncio, questi non migliorano le funzioni di memoria. Poiché Aβ aggrega nel cervello prima della comparsa dei disturbi della memoria, targeting Aβ può essere inefficiente per il trattamento di pazienti dell'annuncio che già esibiscono i deficit di memoria. Pertanto, la segnalazione a valle a causa della deposizione di Aβ deve essere bloccato prima di sviluppo AD. Aβ induce degenerazione assonale, che conduce alla rottura delle reti neuronali e disturbi della memoria. Anche se ci sono molti studi sui meccanismi della tossicità Aβ, la fonte di tossicità Aβ rimane sconosciuta. Per identificare la fonte, vi proponiamo un romanzo protocollo che utilizza la microscopia, la transfezione genica e live cell imaging per studiare i primi cambiamenti causati da Aβ in coni di crescita assonali dei neuroni coltivati. Questo protocollo ha rivelato che Aβ indotta endocytosis clathrin-mediato in coni di crescita assonali seguita da collasso di cono di crescita, che dimostrano che l'inibizione dell'endocitosi impedisce la tossicità Aβ. Questo protocollo sarà utile per studiare gli effetti iniziali di Aβ e può condurre al trattamento annuncio più efficace e preventivo.

Introduzione

Depositi di amiloide-β (Aβ) si trovano nel cervello dei pazienti con morbo di Alzheimer (annuncio) e sono considerati una causa critica AD¹ che interrompono le reti neuronali, che conduce a memoria i danni^2,3,4. Molti clinici farmaci candidati hanno dimostrati di prevenire efficacemente la produzione di amiloide-β (Aβ) o rimuovere i depositi di Aβ. Tuttavia, nessuno ha avuto successo nel migliorare la funzione di memoria in annuncio pazienti⁵. Aβ è già depositato nel cervello prima dell'inizio di memoria menomazioni

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio presso il Campus di Sugitani della Università di Toyama e sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali e uso di animali da laboratorio presso il Campus di Sugitani della Università di Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. crollo Assay

1. Rivestimento di poli-D-lisina
   1. Cappotto di diapositive di cultura 8 pozzetti con 400 μL di 5 μg/mL poli-D-lisina (PDL) in tampone fosfato salino (PBS) e li Incubare a 37 ° C durante la notte.
   2. Rimuovere la soluzione PDL e lavare i pozzetti 3 volte con ....

Risultati

In questo protocollo, Aβ1-42 è stato incubato a 37 ° C per 7 giorni prima dell'uso, perché l'incubazione di Aβ1-42 era necessario per la produzione di forme tossiche^27,28,30,35. Dopo questa incubazione, forme aggregate di Aβ sono state osservate (Figura 1A). È stato segnalato che l'incubazione simile di Aβ1-42 prodotto forma fibrill.......

Discussione

Il protocollo descritto in questo studio abilitato l'osservazione di fenomeni precoce nei coni di crescita assonale dopo il trattamento Aβ1-42. Aβ1-42 indotto endocitosi in coni di crescita assonali entro 20 min, e collasso del cono di crescita è stato osservato entro 1 h di trattamento. Questa endocitosi probabilmente è stata mediata da clatrina. Utilizzando questo protocollo, l'inibizione dell'endocitosi clatrina-mediata è stata confermata per prevenire il collasso del cono di crescita indotta da Aβ1-42 e degenerazione.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ddY topi	SLC
Vetrino di coltura a otto pozzetti	Falcon	354108
poli D lisina	Wako	168-19041
Terreno di coltura, terreno neurobasale	Gibco	21103-049
siero domestico	Gibco	26050-088
glucosio	Wako	049-31165
L-glutammina	Wako	074-00522
0,05% tripsina	Gibco	25300-054
DNasi I	Worthington	DP
inibitore della tripsina di soia	Gibco	17075-029
Filtro con 70 µ m dimensione delle maglie, filtro cellulare	Falcon	352350
B-27 supplemento	Gibco	17504-044
CO2 incubatore	Astec	SCA-165DS
Amiloide &; 1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldeide	Wako	162-16065
saccarosio	Wako	196-00015
Mezzo di montaggio acquoso, Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
Microscopio invertito A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Collegato con AxioCam MRm, unità di riscaldamento XL S, modulo CO2 S1 e TempModule S1
Obiettivo Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901
Obiettivo Plan-Apochromat 63x	Carl Zeiss	440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X	Nikon
anti-MAP2 IgG	Abcam	ab32454
anti-tau-1 IgG	Chemicon	MAB3420
anti-amiloide e beta; anticorpo	IBL	10379	clone 11A1
siero di capra normale	Wako	143-06561
siero bovino albumina	Wako	010-25783
t-ottilfenossipolietossietossietanolo	Wako	169-21105
capra anti-topo IgG coniugata con AlexaFluor 594	Invitrogen	A11032
capra anti-coniglio IgG coniugata con AlexaFluor 488	Invitrogen	A11029
piastra riscaldante	NISSIN	NHP-M30N
vetro di copertura	Fisher Scientific	12-545-85
piatto da 35 mm	IWAKI	1000-035
Silicone RTV	Shin-Etsu	KE42T
punzone a mano	Roper Whitney	No. XX
Sonda a membrana per fluorescenza, FM1-43FX	Invitrogen	F35355
Ca2+- e Mg2+-free Soluzione salina bilanciata di Hanks	Gibco	14175-095
Soluzione di trasfezione, Soluzione nucleofettrice	Lonza	VPG-1001
Elettroporatore, Nucleofector I	Amaxa
Microscopio invertito B	Keyence	BZ-X710
Software di immagine, ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/