Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Summary

Un protocollo dettagliato per il funzionamento simultaneo di 48 colture parallele sotto varie condizioni in un sistema di microbioreactor è presentato. Processo di coltura cellulare, raccolta e analisi di titolo dell'anticorpo successivi sono descritti.

Abstract

Automatizzata su microscala bioreattori (15 mL) possono essere uno strumento utile per gli ingegneri di cultura cellulare. Facilitano l'esecuzione simultanea di una vasta gamma di condizioni sperimentali, riducendo al minimo la potenziale variabilità del processo. Le applicazioni di questo approccio includono: clonare screening, cambiamenti di temperatura e pH, ottimizzazione media e supplemento. Inoltre, i volumi di piccolo reattore sono favorevoli al grande disegno di esperimenti che indagano una vasta gamma di condizioni. Questo consente di essere notevolmente ottimizzata prima di implementare la scalabilità verticale a Monte processi dove la sperimentazione è più limitato in ambito a causa del tempo e dei vincoli economici. Automatizzata su microscala bioreattore sistemi offrono vari vantaggi rispetto ai tradizionali su piccola scala unità di cultura cellulare, quali shake boccette o boccette di spinner. Tuttavia, durante su scala pilota processo sviluppo significativo deve prestare attenzione per assicurare che questi vantaggi siano realizzati. Quando eseguito con cura, il sistema può attivare automazione di livello elevato, può essere programmato per eseguire DOE con un numero maggiore di variabili e può ridurre il tempo di campionamento quando integrato con un analizzatore di nutrienti o contatore di cellule. Integrazione dell'euristica esperto-derivato ha presentato qui, con esperimenti di bioreattore corrente Microscala automatizzato può minimizzare trabocchetti comuni che ostacolano i risultati significativi. In casi estremi, il mancato rispetto dei principi stabiliti qui può portare a danni all'apparecchiatura che richiede costose riparazioni. Inoltre, i sistemi di microbioreactor hanno volumi di piccola coltura rendendo difficile la caratterizzazione delle condizioni di coltura delle cellule. Il numero e la quantità di campioni prelevati in-process nella cultura modalità batch è limitato come volumi operativi non possono cadere inferiore a 10 mL. Questo metodo discuterà i benefici e svantaggi dei sistemi di bioreattore su microscala.

Introduction

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono stati prodotti in cellule di ibridoma topo nel 1975¹. Da allora, un aumento nello sviluppo della produzione di proteine ricombinanti ha avuto luogo a umanizzare mAbs a aumentano in vivo la sicurezza e l'efficacia^2,3,4. La maggior parte dei processi di produzione di proteina ricombinante utilizza cellule di ovaio di criceto cinese (CHO) per la facilità con cui possono essere adattati per media liberi di siero, loro capacità di produrre proteine con modificazioni post-traduzionali simile a quella di un essere umano innato proteine e la loro affidabilità come host cellule^5,6.

Domanda è in crescita di consegnare il prodotto più velocemente e per più grandi popolazioni di pazienti con qualità costante. Oltre ai vantaggi economici, è in aumento il repertorio delle malattie trattate da mAbs, che ora include le malattie autoimmuni, le complicazioni post-trapianto, artrite e tumori⁷. Rendimenti medi per linee di produzione di mAb commerciale moderno sono tipicamente nella gamma di 5-6 g/L e continuano ad aumentare di⁵. In parte, questo è stato compiuto attraverso ingegneria cellulare CHO e l'esame di una migliore linea di produzione utilizzando bioreattori di alto-rendimento⁸. Tuttavia, la maggior parte aumenti nella produzione di proteine sono stati attribuiti per elaborare miglioramenti, tra cui gli avanzamenti in ottimizzazione dei media, le condizioni di coltura delle cellule e migliorata alimentazione strategie^7,9,10. Il completamento nutriente è essenziale non solo per una crescita adeguata delle cellule ma anche per la produzione efficiente di proteine di alta qualità. Inoltre, le cellule richiedono l'aggiunta stechiometrico di nutrienti specifici, che richiedono ulteriore comprensione per l'alimentazione di strategia ottimizzazione^6,11. Metodi di ottimizzazione tradizionali includono singoli supporti componente titolazione e media la fusione con disegni di miscela. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo, labor intensive e comportano rischi associati all'errore umano^12,13.

Gli studi di ottimizzazione media invocata in precedenza shake boccette e bioreattori di 1-2 L che possono essere proibitivi in termini di materie prime e capitale umano. Piastre microtiter inoltre sono stati usati, ma questi metodi forniscono scalabilità limitata. Inoltre, questo potrebbe richiedere ancora più esecuzioni che richiede tempo che introducono variabilità lotto che oscura la variabilità CQA causata da composizione media e alimentazione strategia^14,15,16. Pertanto, la necessità di alto-rendimento e altamente coerente bioreattore parallelo sistemi emerse^17,18,19,20.

Con i pesanti costi associati all'operazione di bioreattori bilancia da banco tradizionale (0,5-5 L), microbioreactors offrono un'alternativa di riduzione dei costi per valutare la produzione di biologicamente derivati farmaci. ²¹ -bilancia da banco agitata-serbatoio bioreattori sono affidabili e forniscono i dati densi tramite matrici sensoriali. Sistemi di controllo di feedback consentono facile supervisione dell'operazione. Tuttavia, il montaggio, calibrazione, pulizia, costi di manodopera, costi di substrato e requisiti di sterilizzazione fare scala agitata-serbatoio bioreattori costosi e laborioso da operare. Boccette di agitare e piastre di microtitolazione rimuovere alcuno del costo e lavoro problemi associati con bioreattori di scala più grande, ma queste alternative forniscono il controllo debole condizioni di lavorazione e producono dati di densità bassa, spesso solo misure di punto finale. ²²

In alternativa, microbioreactors utilizzare un piccolo volume di lavoro per fornire un approccio scalare alla linea cellulare e a Monte del processo di sviluppo. La scala di microbioreactor esperimenti può ridurre notevolmente il costo di esercizio attraverso un utilizzo inferiore di potenza, substrato, labor, spazio e utilità. ²³ Microbioreactors sono come shake boccette in quanto sono facili da gestire a causa delle loro dimensioni, ma mantengono i vantaggi di bioreattori bilancia da banco tradizionale attraverso il loro controllo di feedback on-line di pH, temperatura, dissolto ossigeno e acido/base consumo, nonché la loro uscita di dati in tempo reale dei parametri di qualità compreso fuori composizione del gas. Microbioreactor scala permette capacità di screening ad alta resa, che può essere utile per lo sviluppo di processo di selezione e di clone. ²⁴

Il bioreattore Microscale avanzata ha dimostrato di essere uno strumento efficace per la caratterizzazione di processo CHO cella cultura e sviluppo¹⁸. Qui, un sistema automatizzato ambr15, composto da 48 microbioreactors in parallelo, che sono stati indicati per essere paragonabile alla classica mescolata reattori serbatoio in scala gli studi,²⁵ è stato usato in maniera analoga al lavoro prima che ottimizzato i media composizione per una linea di cellule di CHO-DG44 producendo un modello chimerico IgG1⁶. Gli effetti delle diverse condizioni di media sulla crescita e titolo erano rispetto ed analizzati. In questa carta è stata presentata una linea guida generale per eseguire il sistema di microbioreactor e analisi dei campioni dei supporti grezzi.

Protocol

1. le sementi treno espansione

Nota: Questo protocollo utilizza scorte di cellulare ricombinante DG44 CHO 1 mL che sono state conservate ad una densità di ~ 3 x 10⁷ cellule/mL. Diluizioni e le tempistiche per singole linee di cellule CHO varierà. Misurare le curve di crescita della linea cellulare da utilizzare in anticipo e regolare di conseguenza. Le cellule sono inizialmente scongelate in shake palloni e successivamente trasferite in un matraccio da spinner. Determinare il numero di boccette di agitare e boccette di spinner necessari per l'esperimento basato sul numero di microbioreactors che verrà eseguito e la densità di semina di destinazione.

1. Scongelare rapidamente stock flaconcino (i) di cellule CHO immergendo in bagnomaria a 37 ° C fino a solo un piccolo frammento di resti di ghiaccio. Decontaminare l'esterno della fiala con soluzione di etanolo 70% e un tessuto privo di lanugine. Trasferire in una cappa di biosicurezza.
2. Risospendere le cellule da delicatamente su e giù il pipettaggio e trasferire 1 mL in un pallone di agitare ventilato 125ml sterile contenente 29 mL pre-riscaldato supporto integrato con 8 mM L-Glutammina e 1 x penicillina/streptomicina.
   Nota: Se non diversamente indicato, il termine "media" nel presente protocollo sarà pertanto definire come OptiCHO media.
3. Posto agitare flask(s) in un'incubatrice mantenuta a 37 ° C e 8% CO₂. Utilizzare un agitatore orbitale ad per agitare le cellule ad una velocità di 130 giri/min.
4. Monitorare la densità di cellule vitali (VCD) ogni giorno utilizzando una cella automatica dispositivo di conteggio o manualmente con un emocitometro e blu di trypan. Sottocultura (diluire) le celle 72 ore dopo l'inoculazione nei mezzi freschi (pre-riscaldare i media a 37 ° C ogni volta che deve essere aggiunto alle cellule) tale che il volume finale è di 100 mL in un pallone di spinner 125 mL. Incubare le colture spinner alle stesse condizioni usate per agitare boccetta culture ad una velocità di 70 giri/min.
   Nota: Dopo subcoltura, cellule dovrebbero essere ad una densità di 0,7-1 x 10⁶ cellule/mL. Assicurarsi che la densità finale non sia inferiore a 0,5 x 10⁶ cellule/mL. Sottocultura dopo 96 h se la densità delle cellule bersaglio per inoculazione in filatori non è raggiungibile.
5. In tre giorni (un giorno prima della preparazione dell'inoculo), aggiungere file multimediali fresco, pre-riscaldato a spinner-flask(s) ≥ 90% vitalità. Non superare 125 mL di volume totale. ⁶

2. in esecuzione il sistema automatizzato microbioreactor

Prerequisiti: Utente deve aver ricevuto l'addestramento appropriato dal produttore e deve avere familiarità con la sicurezza e le condizioni di funzionamento per il sistema.

1. Inizializzazione e collegamento al contatore di cellule
   1. Inizializzare il sistema di funzionamento del software. Prima di aprire il software, assicurarsi che il contatore di cellule (Vedi Tabella materiali) è in esecuzione insieme con il rispettivo software. Il contatore di cellule è integrato con il sistema.
   2. Connettersi a connessione remota del contatore di cella prima di aprire il software. Fare clic sull'icona del desktop remoto e fare clic su "Connetti". Una volta collegato il desktop remoto, aprire il software contatore cellulare. Installare una nuova confezione di reagenti, vuota il blu di trypan rifiuti e innescano il sistema.
   3. Ridurre al minimo la connessione remota e aprire il software micro bioreattore utilizzando un esperimento esistente come modello per creare un nuovo esperimento. Nome e salvare l'esperimento. Assicurarsi che il contatore di cellule automatizzato è collegato sotto la scheda stato nel software. La condizione può essere controllata anche sul software contatore delle cellule.
2. Definizione di piatti e vasi di carico
   Nota: si prega fare riferimento alla Figura 1 per orientare il caricamento di materiali di consumo e reagenti sulle stazioni di cultura e ponti. Le flange dovrebbero essere sterilizzato nell'autoclave su un prima del ciclo (utilizzato per materiali solidi) gravità di utilizzare.
   1. Prima di iniziare a correre, definire le piastre utilizzate durante l'esecuzione nella sezione mimica del software. Nome di ogni piastra utilizzata e designare ogni piatto per un ponte sulla stazione di cultura microbioreactor.
   2. Utilizzare una piastra a 24 pozzetti per la ricarica di media e posto sul ponte designato della stazione della cultura. Posizionare 1 mL e 4 mL puntale caselle nelle sezioni come indicato nella Figura 1.
   3. Posizionare una piastra a 24 pozzetti inoculazione sul rispettivo ponte della stazione della cultura. Posizionare il singolo-pozzo 1x tamponato fosfato salino (PBS) piastra sul deck 1. Posizionare la piastra di NaOH 1m singolo-pozzo sul ponte 2 e la piastra 24 pozzetti antischiuma sul ponte 7 (posizioni come indicato nella Figura 1). Il diagramma viene visualizzato il numero di sdraio sotto la scheda "Imitare" nel software.
   4. Disfare i recipienti di coltura (dotati di sparger) all'interno della cappa di armadietto di sicurezza. Posto dodici recipienti di coltura sterile per ogni stazione di cultura. Posto in autoclave piastre di serraggio nella parte superiore dei vasi. Assicurarsi che i fori negli inserti forniti per gli agitatori tutti rivolti nella stessa direzione per il posizionamento più facile.
      Nota: Usando un pennarello indelebile, categorizzare i recipienti di coltura prima di metterli nella stazione di cultura per risparmiare tempo ed evitare confusione al momento della vendemmia.
   5. Piastra di serraggio O-ring sono la prima parte all'usura dopo ripetuta autoclavaggio, pertanto attentamente controllare prima della sterilizzazione in autoclave prima di ogni esperimento. Mantenere una piastra di bloccaggio sterile come back-up in caso di guasto o-ring è raccomandato.
   6. Posizionare le piastre di mescolare in cima delle placche delle pinze, garantendo ogni pin è saldamente inserito. Fissare le flange con le viti e le manopole in dotazione. Serrare le manopole fino a che sono strette di mano. Serrare le manopole di sinistra e destra in alternativa per il posizionamento anche della piastra di bloccaggio.
      Nota: Se la pinza non è a filo contro la superficie o le viti all'estremità della piastra di bloccaggio siano serrate in modo non uniforme, i vasi sperimenteranno problemi di controllo di ossigeno disciolto (DO). Se queste regolazioni non si correggono il problema, controllare gli O-ring come incompleta sigillatura delle piastre può condurre a gassificazione inefficiente di cultura.
3. In esecuzione il Software automatizzato bioreattore Micro
   Nota: uso "Fasi di processo" scheda per modificare o creare nuovi passi. Passaggi devono essere programmato individualmente per avviare e interrompere qualsiasi processo. Clicca sul tasto "Inserisci passo" sotto la scheda di passaggi di processo per creare nuovi passi o fare doppio clic su un passo esistente per modificare quel passaggio. Fasi del programma sono suddivisi in dieci sezioni principali: avvio, supporto di ricarica, aggiunta di antischiuma, / pH controllo, sfondo Base aggiunte, Paused pH, inoculazione, 5 X Cell Count, conteggio di cellule X 10, sostanza nutriente Analyzer campionamento e cultura stazione Shutdown. La durata dell'esecuzione è solitamente fra 7-9 giorni quando esegue in modalità batch.
   1. Il sistema Inizializza e verifica la presenza dei vasi appropriati. Eseguire la scansione del codice a barre fornito con i vasi di coltura. Il codice a barre stesso può essere applicato per le stazioni di cultura con vasi vuoti o vasi non viene utilizzati.
   2. Il sistema avrà inizio con il programma progettato dopo controllo controllo, fornire di gas e altri collegamenti.
      Nota: L'utente può procedere con il programma anche se un errore si verifica, ma lo fanno a rischio dell'utente e se procedere avanti non danneggiano il sistema e non verranno interrotto l'esperimento. Ad esempio, fornire di gas può essere disattivata per alcuni vasi non utilizzati nell'esperimento che verrà visualizzato come un errore, ma può essere aggirato.
4. Avvio e caricamento Media
   1. L'impostazione del giorno prima il sistema o il supporto di ricarica giorno viene designato come giorno 0 di tempo della coltura.
   2. Nella sezione avvio, primo carico dispensare consigli, suggerimenti sia 1 mL e 4 mL, come programmato. Se già inserito, clicca su continua. Posizionare il piatto di media, 1x PBS, NaOH 1 M, piastra antischiuma, supporto di ricarica media e piastra di inoculazione in ponti designati o, se già inserito, premere continua passare alla fase successiva.
   3. Come parte del protocollo di avvio, iniziare il controllo della temperatura e impostare la temperatura a 37 ° C. Accendere l'agitazione a 1000 giri/min e la DO / pH monitor.
   4. Successivamente, eseguire il programma di ricarica media. Il gestore di liquido del sistema automatizzato microbioreactor erogherà i media dalla piastra di supporto per i recipienti di coltura mappato nel programma. Il supporto aggiunto è OptiCHO con diverse condizioni di processo.
      Nota: Due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti sono necessari per riempire un vaso di cultura alla capacità (13ml), come ogni pozzetto può ospitare solo 8 mL di media. Uso 7-8 mL in ciascun pozzetto per impedire l'aria disegno quando media è essere mescolato dal gestore liquido prima della carica.
   5. Una volta fatto la media di carica, 35 µ l di antischiuma Ex-cella verrà aggiunto dalla piastra antischiuma alla nave di cultura. Attendere 30 minuti per mezzo di coltura per essere ben mescolato e l'ottico DO / sensori di pH per essere idratati.
      Nota: Lo stesso volume di antischiuma è aggiunto a intermittenza durante tutto il tempo di cultura quando viene rilevata la formazione di schiuma. ⁶ schiumogeno è rilevato visivamente, e vasi reattore vengono controllati ogni giorno per la schiumatura. Antischiuma viene aggiunto immediatamente al momento del rilevamento.
   6. Il DO / controllo del pH è quindi acceso per iniziare il monitoraggio e la registrazione della DO e il pH del terreno di coltura. Consentire la DO raggiungere il set point del 50%, che impiegano almeno 2 ore.
   7. Dopo l'equilibratura, accendere il aggiunte base sfondo per raggiungere un pH set point di 7.1 per tutti i recipienti di coltura. Permettono di fare e pH per equilibrare una notte e per essere completamente idratati.
5. In pausa pH - pH 1 giorno Offset
   1. Il giorno successivo (contrassegnato come giorno 1), eseguire il passaggio di pH in pausa per cui selezionare cultura vasi vengono analizzati e un offset di correzione del pH è determinato.
      Nota: Il numero di navi di pH da campionare per compensare il pH è determinato utente. Un campione da ogni reattore potrebbe non essere necessario se si dispone di una buona rappresentazione della popolazione bioreattore.
   2. Posizionare le piastre di supporto del tubo campione sui ponti designati e carico micro centrifuga tubetti con tappo Apri e nascosto accanto a loro. Il gestore di liquido erogherà 600 µ l di liquido della coltura la cella nel tubo mappato nel programma.
   3. Rimuovere immediatamente il pH del campione e misura su un bioanalyzer nutriente che è stato calibrato correttamente e per il quale sono stati eseguiti il QCs (Vedi sotto, "Quotidiana nutriente e analisi del metabolita").
      Nota: I campioni vengono eseguiti singolarmente, immediatamente dopo il disegno, per evitare variazioni di pH a causa di esposizione all'aria, come il degassamento di CO₂ del campione può causare variazioni di pH.
   4. Premere "continuare" dopo ogni campione, altrimenti che non verrà eseguito il passaggio successivo.
   5. Immettere i valori di pH esterno, FLEX-derivato nel software, "compilazione" gli offset per i vasi campionati automaticamente. Manualmente media gli offset ottenuti per i vasi di campione e inserire il numero nella colonna utente pH offset sotto la scheda "Dati di nave". L'offset medio sarebbe quindi applicato a tutti i vasi. Consentire il pH a equilibrare per almeno 2-3 ore, dopo di che i recipienti di coltura possono essere inoculati.
6. Inoculazione
   1. Dopo la misurazione VCD, trasferire l'intero contenuto del filatore-flask(s) in una sterile, 250 mL conica per centrifuga tubo pellet cellule e mediante centrifugazione per 10 min a 140 x g e a temperatura ambiente. Decantare i vecchi media e risospendere in media abbastanza fresco tale che la densità finale dovrebbe essere 1 x 10⁶ cellule/mL dopo aver aggiunto l'inoculo per la nave di cultura.
   2. Aggiungere le cellule sospese in designato bene di una piastra a 24 pozzetti con coperchio sterile. Aggiungere 3 mL di inoculo in ciascun pozzetto, di cui 2 mL verrà rimosso come inoculo per ogni nave di cultura.
   3. Posizionare la piastra di inoculo sul ponte designato all'interno della cappa. Assicurarsi di spruzzare all'esterno della piastra con coperchio inoculo con alcool al 70% prima di posizionarlo all'interno della cappa.
7. Conta cellulare utilizzando automatizzato Cell Counter
   1. Dopo l'inoculazione, lasciate che i recipienti di coltura equilibrare per almeno un'ora. Dopo un'ora, è possibile eseguire il 5 X cella conteggio passo nel programma. 5 X indica il fattore di diluizione utilizzato per leggere il numero di celle.
      Nota: numero di celle 5 X viene utilizzato inizialmente quando le cellule sono in fase di ritardo. Dopo che le cellule raggiungono la loro fase esponenziale verrà utilizzato il conteggio delle cellule di 10x. Basato sul campione e il DILUENTE volumi lo strumento automaticamente rappresenta il fattore di diluizione e regola di conseguenza il valore finale.
   2. Il gestore di liquido aggiunge dapprima 480 µ l di 1X PBS alla Coppa del contatore di cellulare seguito dall'aggiunta di 120 µ l di liquido della coltura la cella dal recipiente di cultura. Il conteggio delle cellule viene poi letto utilizzando il contatore di cellule automatizzato. Questo passaggio viene ripetuto per tutti i vasi.
   3. Il conteggio delle cellule è l'ultimo passo per il giorno 1 del tempo cultura. Insieme ai dati e pH il conteggio delle cellule dati (densità di cellule vitali e redditività) sono anche registrati giornalmente dal software.
      Nota: Pulire la tazza del contatore di cella almeno due volte durante la durata dell'esecuzione con 70% IPA per impedire l'intasamento delle linee. Linee e cella di flusso vengono cancellate automaticamente dopo ogni conteggio delle cellule.
8. In pausa pH - pH giorno 2 Offset
   1. Il giorno 2 del tempo della coltura, ripetere il passaggio "In pausa pH" utilizzando recipienti di coltura diversi da quelli che sono stati provati dalla durante il passaggio di pH in pausa iniziale.
      Nota: Campionamento della popolazione nave per pH in pausa fornirà un migliore offset per la correzione del pH. Quindi, non assaggiare le stesse navi utilizzate per pH in pausa dal giorno precedente.
9. Analisi del metabolita e quotidiana degli elementi nutritivi
   1. Campioni saranno prese per analisi dei nutrienti dal 2 ° giorno della cultura fino alla fine dell'esperimento e analizzati con nutrienti bioanalyzer.
   2. Posizionare le piastre di supporto del tubo campione sui ponti designati e carico micro centrifuga tubetti con tappo Apri e nascosto accanto a loro. Il gestore di liquido erogherà il liquido della coltura delle cellule nel tubo mappato nel programma.
      Nota: Per l'iniziale alcuni giorni (2-4 giorni) la quantità di campione prelevato dal recipiente di cultura è 300 µ l. Questa è diluita con 300 µ l di 1X PBS erogato dal gestore di liquido. Questo viene fatto per conservare il volume cultura e impedisce che il livello scenda di sotto 10 mL. Inoltre, valori nutrizionali per i primi giorni rientrano nell'intervallo di rilevamento di strumento dopo la diluizione.
   3. Posizionare i campioni nel cassetto analizzatore per eseguire l'analisi dei nutrienti.
      Nota: Congelare i campioni che non verranno analizzati nello stesso giorno.
10. Arresto del sistema
    1. Per terminare la corsa, prima di disattivare il controllo della temperatura seguito dall'agitazione. In secondo luogo, interrompere il DO / aggiunte di base di controllo del pH e sfondo. In terzo luogo, arrestare tutti gli altri controlli. Infine, fermare il monitor di sistema.
    2. Svitare la fascetta e mescolare piastre e rimuovere recipienti di coltura. Pulire l'interno della stazione di cultura con un panno privo di lanugine. Posizionare le piastre di secchezza sulla stazione cultura e avvitarli.
       Nota: Ciclo di asciugatura è richiesto per la versione raffreddata del sistema e non è necessario per la versione standard del sistema.
    3. Eseguire il ciclo di asciugatura 2 ore sul programma. Pulire le flange utilizzando acqua ultrapura seguirono da 70% alcool isopropilico (IPA) per rimuovere possibile liquido condensato nelle linee. Sciacquare con aria per rimuovere eventuali residui di liquido.
    4. Fai clic su "Stop" nel software bioreattore una volta ha terminato il ciclo di asciugatura.

3. cellula cultura Harvest

1. Trasferire il liquido della coltura delle cellule dai vasi reattore ed il pellet di cellule a 1.962 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Decantare il supernatante. Usando un 0,22 µm PVDF filtro sterile filtro il liquido della coltura cellulare decantato.
3. Aliquotare 1 mL di liquido della coltura la cellula sterile in 1,5 mL Eppendorf provette per l'analisi del titolo. Conservare le provette da 1 mL a-20 ° C. Purificare il resto del liquido della coltura delle cellule raccolte utilizzando il sistema di cromatografia liquida della proteina veloce. ⁶

4. misurazione IgG titoli

Nota: Questa è una panoramica sommaria di esecuzione e analisi dei campioni utilizzando il sistema di biosensore di proteinA. Tutti i parametri di analisi ( ad es. temperatura, tempo di lettura, rpm, ecc. ) deve essere determinata empiricamente per ogni tipo di campione.

1. Accendere il sistema e attendere che la lampada di scaldarsi per campioni di rimuovere almeno 1 h. dal congelatore a scongelare e stabilizzare a temperatura ambiente.
2. Nel software di sistema, impostare la temperatura della piastra a 26 ° C. Pre-ammollo il numero di punte di proteina A da utilizzarsi nella matrice del campione (ad es. cell supporti) per almeno 30 minuti.
   Nota: La temperatura ottimale deve essere determinata empiricamente. Una temperatura di 26 ° C è qui utilizzata per ridurre al minimo l'evaporazione del campione durante tempi di analisi e consentire lo strumento mantenga una temperatura costante (da essere parecchi gradi sopra la temperatura ambiente). I campioni devono essere pre-equilibrato alla temperatura di analisi selezionate prima misurazione incubando il piatto di campione sul palco campione per ≥ 10 minuti.
3. Costruire una curva standard di proteine utilizzando lo stesso anticorpo concentrato a 10 mg/mL e diluire in serie nella matrice del campione (vale a dire media) nell'intervallo che deve essere rilevata.
   Nota: È importante ottenere un'alta concentrazione di anticorpo per ridurre al minimo gli effetti di matrice a causa della diluizione, ma è anche importante non sopra concentrare l'anticorpo e indurre aggregazione. L'esecuzione di una curva standard a piastra per ogni piatto di campione è preferibile. Come minimo, un controllo positivo deve essere utilizzato per rappresentare la variabilità di punta-a-punta e piastra-to-plate. Una nuova curva standard deve essere generato per ogni nuovo lotto di proteina utilizzata una serie di suggerimenti.
4. Design piatto del campione (per un esempio, vedere Figura 2). In una proteina A test che utilizza la rigenerazione, fino a 80 campioni possono essere analizzati, che include esempi di cultura sconosciuta, norme e controlli. Per ogni piastra analizzato, una punta singola proteina A serviranno a misurare fino a 10 campioni su tutta la piastra (colonne 1-10), con un ciclo di rigenerazione tra ciascun campione.
   Nota: È consigliabile che l'intera riga prima della piastra (riga A) di essere utilizzato come riferimento e controllo negativo. Nell'analisi della discussa qui, righe B e C sono utilizzate per due controlli positivi; quella inferiore e quella al limite superiore della risposta lineare. In questo modo che ogni punta misura controlli positivi e negativi prima di analizzare i campioni. Questo set-up semplifica anche la sottrazione di riferimento del software di analisi. Pozzetti rimanenti vengono quindi utilizzati per campioni incogniti. Se c'è un divario di campione in una delle righe, ci deve essere una matrice in quel pozzo per evitare l'essiccazione della punta (cioè pozzetti A2 attraverso G2 hanno campione mentre H2 non. Garantire H2 contiene la matrice del campione per garantire il suggerimento non si asciughi prima di procedere a campione H3). Infine, non esauriscono suggerimenti utilizzando un set di piastre multiple di analizzare. Utilizzando un nuovo, non rigenerata serie per ogni piastra è consigliato.
5. Preparare i campioni per analisi mescolando delicatamente , mediante inversione o pipettaggio, seguita da un giro di impulso per raccogliere il campione nella parte inferiore del tubo. Per campioni concentrati, è possibile creare repliche di diluizione appropriata diluendo in matrice del campione.
   Nota: La gamma lineare di binding per un anticorpo per la proteina un misure di interferometria (BLI) bio-strato varierà da sia l'anticorpo, metodiche e matrice. Questo dovrebbe essere determinato empiricamente in anticipo affinché siano utilizzati diluizioni di campione appropriato.
6. Preparare piastre a 96 pozzetti campione più vicino al tempo di analisi possibile. Garantire bolle d'aria in uno qualsiasi dei pozzi. Rimuovere le bolle d'aria con una pipetta pulita o mediante centrifugazione.
7. Piastra di carico nel sistema ed eseguire test utilizzando il valore predefinito "Alta sensibilità dosaggio con rigenerazione" del software di acquisizione dati. Analizzare utilizzando software di analisi dei dati di HT.
   Nota: Se le piastre sono di essere preparati in anticipo a causa di vincoli, tappare bene con la pellicola per evitare l'evaporazione. A seconda i titoli attesi, tempi e velocità di acquisizione potrebbero essere necessario essere regolata. Consultare il manuale per l'orientamento.
8. Utilizzando il software di analisi dei dati, riferimento sottrarre e calcolare la concentrazione dei campioni sconosciuti utilizzando la curva standard e la funzione pendenza iniziale (IS) con un punto a punto lineare adatta.

Results

Monitoraggio dei parametri di processo critici e altri parametri di cultura delle cellule durante il funzionamento di colture cellulari è un aspetto importante nel bioprocessing. Il contatore di cellule e analizzatore di nutrienti sono stati utilizzati per quantificare cinque attributi che caratterizzano la crescita delle cellule, consumo di nutrienti e formazione di sottoprodotto. I conteggi delle cellule sono stati ottenuti tutti i giorni per tutte le condizioni di coltura. La densità media delle cellule vitali e viabilità sono come si vede nella Figura 3 insieme al loro intervallo di ± 1 SD. I profili di sottoprodotto e nutrienti sono indicati anche con l'intervallo di ± 1 SD attraverso la fase stazionaria delle culture. La pendenza di questo profilo rappresenta i tassi di glucosio e glutammina consumi e produzione di lattato, medi. Nel complesso, questi risultati dimostrano la fattibilità di questi attributi di monitoraggio del sistema di microbioreactor; così come la capacità del sistema microbioreactor per mantenere questi parametri all'interno di una gamma stretta.

La produttività totale delle colture cellulari è stata quantificata utilizzando un sistema di biosensore proteinA dopo i terreni di coltura delle cellule raccolte è stato passato attraverso un filtro PVDF 0,22 micron. La produttività specifica per ogni cella ha variato da 0,87 pg/cellula-d a 1.15 pg/cellula-d come si vede nella Figura 4. Basato su questi risultati, una vasta gamma di condizioni possa essere studiata per selezionare composizione media e strategie che massimizzare la quantità di proteine alimentari prodotte per un investimento minimo in procedure sperimentali.

Figura 1 : Layout del sistema microbioreactor con 4 stazioni di cultura (CS) avendo 12 vasi reattore ogni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2 : Esempio esempio piastra messa a punto per una quantificazione base con rigenerazione esperimento sul sistema proteinA biosensore. riga 1 (rosso "R") è riservata per il campione di riferimento (i.e . matrix assente analita); riga 2 (acquamarina) è un insieme di standard (le concentrazioni sono in µ g/mL); le righe 3 e 4 (arancione) sono insiemi di controlli positivi di alti e Bassi ("PL" e "PH", rispettivamente); righe da 5 a 10 (viola) contengono campioni incogniti; le righe 11 e 12 (grigio) sono posizioni di programma predefinito per la rigenerazione ("R") e buffer di neutralizzazione ("N"). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3 : un) media profili di densità e l'attuabilità delle cellule vitali sopra l'età di un batch. ± 1 SD è inoltre indicato per indicare il controllo stretto della crescita delle cellule nei sistemi microbioreactor. b) medio profilo nutrizionale per glucosio e Glutammina, nonché il profilo medio sottoprodotto di lattato. ± 1 SD è inoltre indicato per indicare il controllo stretto sopra composizione media nei sistemi microbioreactor. (N = 3, tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Rappresentanza casella-trama di produttività media specifiche delle varie condizioni media. (N = 3, tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Discussion

Funzionamento del sistema automatizzato bioreattore micro correttamente e in modo efficiente comporta la tempestiva esecuzione di più passaggi automatizzati. Una delle parti più importanti del funzionamento del sistema è il software di programmazione. Se ci è qualunque errore durante la scrittura del programma, ci saranno gravi errori nell'esperimento che può provocare modifiche impreviste nel processo, strategia, strategia di campionamento o qualità del prodotto finale che può invalidare i risultati dello studio di alimentazione. Un altro aspetto importante del funzionamento del sistema è a posto e stringere la piastra di bloccaggio correttamente per garantire un controllo adeguato. L'indicazione più comune che la piastra di bloccaggio sia stretto in modo non uniforme è inaspettate variazioni nelle misurazioni per navi 1, 6, 7 e 12 (vasi reattore di angolo). Nel complesso instabilità indica un allentamento delle guarnizioni presso le linee di ingresso del gas delle placche delle pinze. Questo scenario può ostacolare raggiungendo il punto di set. Un'altra trappola comune da evitare quando iniziare un esperimento è lasciare che le cellule sedersi troppo a lungo durante il passaggio di inoculazione, causando loro di stabilirsi. Minore è il tempo che trascorrere le cellule seduta, meno possibilità c'è che i conteggi delle cellule di inoculo progressivamente inferiori vengono aggiunti cronologicamente ai vasi reattore che possono indurre significativi pregiudizi che involontariamente danneggia i risultati dello studio. È meglio inoculare in più fasi, cioè inoculare ciascuna stazione di cultura uno dopo l'altro con passaggi di pausa in mezzo così le cellule non sono seduto nella piastra di inoculazione per più di 15 minuti.

Per quanto riguarda uso giorno per giorno, mantenendo la sterilità è vitale. Sebbene il sistema sia in una cappa di sicurezza biologica, la sterilità non è garantita a causa di frequenti spostamenti dentro e fuori la cappa. Di conseguenza, tutto ciò che va nella cappa devono essere irrorati con 70% IPA. In secondo luogo, è essenziale garantire che minima schiuma si verifica durante la cultura; media può intasare il fornire di gas e scarico linee, che conducono ai danni della piastra di bloccaggio e anche i componenti di base qui sotto. Preventiva anti-schiuma aggiunta punti sono fondamentali per qualsiasi programma di progettazione di micro bioreattore. In caso di una "schiuma fuori" sarebbe benefico per seguire i produttori protocollo di pulizia e può prevenire danni permanenti delle placche delle pinze. In alternativa, uso dei vasi non sparged può essere utile per la bassa densità delle cellule o durante l'esecuzione in modalità batch in quanto consente maggiore superficie in rapporto al volume ossigeno efficiente anche con la mancanza di un sparger. Tuttavia, non sparged navi potrebbero non essere utile per colture ad alta densità o aspersione come spazio di testa non è sufficiente per tenere il passo con il crescente consumo di ossigeno di culture.

Ci sono numerosi vantaggi forniti dal sistema microbioreactor, in quanto consente molteplici culture controllate da eseguire in parallelo su una piccola scala con maggiore controllo che agitare boccette. ¹⁷ pertanto, il sistema facilita l'esecuzione di studi, fa, elevato throughput clone studi e studi di transfezione di screening. Processatore automatico riduce anche analista-analista variabilità riducendo contemporaneamente al lavoro noioso e richiede molto tempo per personale addestrato. Mentre ci sono diversi vantaggi per il sistema, ci sono parecchi svantaggi chiavi che dovrebbero essere considerati. In primo luogo, un volume di cultura di 15 mL limita significativamente in-processo di campionamento e materiale di raccolta finale e più alternativi su piccola scala bioreattori (fino a 500 mL) recentemente sono diventato disponibili. Un recente progresso al sistema è l'integrazione del bioreattore Microscala automatizzato con l'analizzatore di BioProfile FLEX 2 da Nova Biomedical, che attenua il problema di processo-campionamento in riducendo il volume di campione per l'analisi degli elementi nutritivi e la densità delle cellule . Benefici possono includere una configurazione veloce e praticamente nessuna pulizia portando a risparmi operativi, tuttavia il costo delle unità monouso dovrebbe essere considerato per progetti a lungo termine, come può essere più costoso di acquistare le unità rispetto ai sistemi convenzionali riutilizzabili.

Il metodo illustrato in questo documento è principalmente adatto per colture cellulari di batch modalità, ma può essere modificato a seconda delle esigenze dell'utente. Ogni stazione di cultura ha controllo indipendente della temperatura, mentre DO e pH può essere variate a livello dei vasi reattore individuali. Sartorius offre anche DoE software progettato specificamente per consentire esperimenti di pianificazione per essere su misura per il sistema di micro bioreattore. Studi di DoE su larga scala utilizzando il nuovo software DoE fornito dal produttore possono aiutare nei media e supplemento di ottimizzazione. Anche se non usato qui, il sistema microbioreactor permette inoltre studi di fed-batch. Il sistema non è stato ancora ottimizzato per colture cellulari di aspersione. Tuttavia, ci sono stati studi limitati e prove di imitare operazione cultura delle celle aspersione nell'attuale sistema micro bioreattore. ²⁶ questo metodo può essere modificato per imitare culture perfusione ad alta densità di sedimentazione delle cellule. Variando l'altezza a cui la pipetta viene inserita nel reattore e ottimizzando il tempo di assestamento, i media può essere rimosso e riforniti per modalità di profusione di specchio della cultura. Ci sono nuovi prodotti in questo settore in via di sviluppo che potrebbe funzionare meglio il sistema presentato qui se non si desidera modalità di perfusione della cultura.

In sintesi, questo studio dimostra l'uso di micro-bioreattori automatizzati e associati analitico per le operazioni di cultura delle cellule CHO per produrre e caratterizzare un anticorpo monoclonale IgG1 di modello. Essa sottolinea il ruolo di micro-bioreattori su piccola scala nella produzione di bioprocessi e loro impatto sullo sviluppo di cultura delle cellule e proiezione multimediale. Mentre ci sono molti vantaggi di utilizzare un sistema automatizzato su piccola scala, per realizzare pienamente i loro benefici processo comprensione e caratterizzazione analitica è imperativo. Questo studio fornisce all'utente con una linea guida per l'utilizzo di un sistema di reattore automatizzato su microscala, che possa essere sviluppato e migliorato per le esigenze di ricerca individuale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO DG44 Linea cellulare	Invitrogen	A1100001
ambr 15 sistema microbioreattore automatizzato	Sartorius	001-2804	microbioreattore automatizzato
ambr 15 Coltura cellulare 24 bioreattori monouso - Sparged	Sartorius	001-2B80
1 mL puntali per pipette monouso, sterilizzati	Sartorius	A-0040
5 mL pipetta monouso punte, sterilizzate	Sartorius	A-0039
Piastre a pozzetti profondi a 24 pozzetti	Sartorius	A-0038
Piastre a 1 pozzetto	Sartorius	A-0068
Contatore di cellule Vi-Cell XR	Beckman Coulter	731050	contatore di celle automatizzato
EX-CELL  Antischiuma (irradiato con raggi gamma)	Sigma-Aldrich	59920C-1B
CD OptiCHO AGT Medium	Thermo Fisher Scientific	A1122205
200 mM L-glutammina	Corning	25-005-CV
100X Penicillina/Streptomicina	Corning	30-001-CI
125 mL F-Bottom Shake Flasks (sterili, ventilati)	Fisher Scientific	PBV12-5
Fiasche da 125 mL in vetro Fiasche	Corning Life Sciences Glass	4500-125
Provette da centrifuga coniche in PP da 250 mL (sterili)	Nalgene (Thermo Scientific)	376814
Contatore di cellule automatizzato TC20	BioRad Laboratories, Inc.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
10x PBS	Corning	46-013-CM
Analizzatore BioProfile FLEX Nova	Biomedical	49418	Analizzatore di nutrienti
Ottetto Rosso 96	Pall Forté Bio	99-0042	Proteina A Biosensore
Proteina A Immergi e Leggi Biosensori	Pall Forté Bio	18-5010
Micropiastra in polipropilene a 96 pozzetti, fondo F, a camino, nera	Greiner Bio-One	655209