La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Sommario

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

Abstract

Misura in tempo reale delle oscillazioni a livello di singola cellula è importante scoprire i meccanismi di orologi biologici. Anche se alla rinfusa gli estratti preparati con uova di Xenopus laevis di sono stati potenti in reti biochimiche che sono alla base della progressione del ciclo cellulare di dissezione, loro misura media ensemble in genere porta ad un'oscillazione smorzata, nonostante ciascuno oscillatore individuale essendo sostenuta. Ciò è dovuto la difficoltà di sincronizzazione perfetta tra singoli oscillatori in sistemi biologici rumorosi. Per recuperare la cella singola dinamica dell'oscillatore, abbiamo sviluppato un sistema di cellula artificiale basata su goccia che può ricostituire mitotic cicli nei compartimenti di cellula-come incapsulare ciclismo estratti citoplasmatici di uova di Xenopus laevis . Queste semplici cellule solo citoplasmatici presentano oscillazioni sostenute per oltre 30 cicli. Per costruire più complicate cellule con i nuclei, abbiamo aggiunto della cromatina di sperma demembranated per attivare l'auto-assemblaggio nuclei nel sistema. Abbiamo osservato una progressione periodica del cromosoma condensazione/decondensazione e nuclei avvolgono ripartizione/riforma, come nelle celle reali. Questo indica che l'oscillatore mitotica funzioni fedelmente per guidare più a valle eventi mitotic. Contemporaneamente abbiamo rintracciato la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale e oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l'analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l'orologio.

Introduzione

Estratti citoplasmatici preparati con uova di Xenopus laevis di rappresentano uno dei modelli più predominanti per lo studio biochimico dei cicli cellulari, dato il grande volume di ovociti, la progressione del ciclo cellulare rapida e la capacità di ricostituzione eventi mitotic in vitro^1,2. Questo sistema ha permesso la scoperta iniziale e caratterizzazione meccanicistico di regolatori del ciclo cellulare essenziale come fattore di promozione di maturazione (MPF) così come i processi mitotici a valle tra cui spindle assembly e cromosoma segregazione^{1 ,}

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. preparazione dei materiali per il rilevamento e la ricostituzione del ciclo cellulare

1. Assemblea di Gibson clonazione per la costruzione del DNA del plasmide e la purificazione di mRNA di securin-mCherry
   1. Preparare tre frammenti di DNA, tra cui una spina dorsale di vettore di pMTB2, securin e mCherry tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) e gel purificazione^21,22.
   2. Misurare le concentrazioni d....

Risultati

In Figura 2, indichiamo che questo protocollo produce oscillazioni mitotiche in cellule semplici, senza nucleare così come complicate cellule con i nuclei, dove l'oscillatore spinge l'alternanza ciclica di formazione di nuclei e deformazione. Le goccioline privo di nuclei generano oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli undamped nell'arco di tempo di 92 ore, come indicato dal periodico sintesi e degradazione di una fluorescenza reporter securin-mCherry (

Discussione

Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola cellula. Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Uova di Xenopus in primo luogo, appena spremute con una buona qualità, rispetto alle uova deposte, tendono a produrre estratti con attività di più lunga durata di oscillazione. In s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Xenopus laevis rane	Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit	QIAGEN	27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)	QIAGEN	28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione	Ambion	AM1340
BL21 (DE3)-T-1 cellula competente	Sigma-Aldrich	B2935
Ionoforo di calcio	Sigma-Aldrich	A23187
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Tricloro tossico
	Sigma-Aldrich	448931	tossico
(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano
PFPE-PEG tensioattivo	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutatione Sepharose 4B perline	Sigma-Aldrich	GE17-0756-01
Colonna PD-10	Sigma-Aldrich	GE17-0851-01
Tubo in vetro cavo miniaturizzato VitroCom		5012
Olympus SZ61 Microscopio stereo	Microscopio Olympus
Olympus IX83	Olympus
Olympus FV1200	Spettrofotometro Olympus
NanoDrop	Thermofisher	ND-2000
0,4 mL Microprovette con tappo a scatto	E& K Scientific	485050-B
Mini kit PureLink RNA	ThermoFisher (Ambion)	12183018A
Fisherbrand Miscelatore a vortice analogico	Fisher	Scientific 2215365
Imaris	Bitplane	Versione 7.3	di analisi delle immagini

Microscopio confocale Software