Method Article

Caratterizzazione fisica ad alta risoluzione di nanoparticelle metalliche singole

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare cluster di ossigeno metallico discreti, poliossimetalati (POM), al limite di singole molecole utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Il metodo fornisce un approccio complementare agli strumenti chimici analitici tradizionali utilizzati nello studio di queste molecole.

Abstract

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Le singole molecole possono essere rilevate e caratterizzate misurando il grado con cui riducono la corrente ionica che scorre attraverso un singolo poro su scala nanometrica. Il segnale è caratteristico delle proprietà fisico della molecola e delle sue interazioni con il poro. Dimostriamo che i nanopori formati dalla proteina batterica exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (ZHL) sono in grado di rilevare i poliossimiti (POM, ammassi di ossigeno anionico), al limite della singola molecola. Inoltre, più prodotti di degradazione di 12-foshotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in soluzione sono misurati simultaneamente. La sensibilità a singola molecola del metodo nanoporo consente di caratterizzare i POM a concentrazioni significativamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica potrebbe servire come nuovo strumento per i chimici per studiare le proprietà molecolari dei poliossimetalati o di altri cluster metallici, per comprendere meglio i processi sintetici POM e possibilmente migliorare la loro resa. Ipoteticamente, la posizione di un dato atomo, o la rotazione di un frammento nella molecola, e lo stato di ossidazione del metallo potrebbero essere studiati con questo metodo. Inoltre, questa nuova tecnica ha il vantaggio di consentire il monitoraggio in tempo reale delle molecole in soluzione.

Introduction

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Il rilevamento di analiti biomolecolari a livello di singola molecola può essere eseguito utilizzando nanopori e misurando modulazioni di corrente ionica. Tipicamente, i nanopori sono divisi in due categorie in base alla loro fabbricazione: biologica (auto-assemblata da proteine o origami di DNA)1,2,3o stato solido (adesempio, prodotto con strumenti di elaborazione dei semiconduttori)4,5. Mentre i nanopori allo stato solido sono stati suggeriti come potenzialmente più robusti fisicamente e possono essere utilizzati in un'ampia gamma di condizioni di soluzione, i nanopori proteici finora offrono una maggiore sensibilità, maggiore resistenza all'incrostazione, una maggiore larghezza di banda, una migliore chimica selettività e un maggiore rapporto segnale/rumore.

Una varietà di canali ionici proteici, come quello formato da Staphylococcus aureus -emolysina ( , può essere utilizzato per rilevaresingolemolecole, compresi gli ioni (ad es. e RNA)6,7,8, DNA danneggiato9, polipeptidi10, proteine (piegate e spiegate)11, polimeri (glicole di polietilene e altri)12,13 , 14, nanoparticelle d'oro15,16,17,18,19e altre molecole sintetiche20.

Recentemente abbiamo dimostrato che il nanoporo di HL può anche facilmente rilevare e caratterizzare ammassi metallici, poliossimetalati (POM), a livello di singola molecola. I POM sono cluster di ossigeno metallici su scala nanometrica discreti che sono stati scoperti nel 182621, e da allora, molti altri tipi sono stati sintetizzati. Le diverse dimensioni, strutture e composizioni elementali di poliossimetalati che sono ora disponibili hanno portato a una vasta gamma di proprietà e applicazioni tra cui chimica22,23, catalisi24, scienza dei materiali25 ,26, e ricerca biomedica27,28,29.

La sintesi POM è un processo di auto-assemblaggio tipicamente eseguito in acqua mescolando le quantità stoichiometricamente richieste di sali metallici monomerici. Una volta formati, i POM mostrano una grande diversità di dimensioni e forme. Ad esempio, la struttura in polianione di Keggin, XM12O40q- è composta da un eteroatoma (X) circondato da quattro ossigeno per formare un tetraedro (q è la carica). L'eteroatomo si trova in posizione centrale all'interno di una gabbia formata da 12 ottaedriMO MO6 unità (dove M - metalli di transizione nel loro stato di alta ossidazione), che sono collegati tra loro da atomi di ossigeno condivisi vicini. Mentre la struttura dei tungsteno poliossimetalati è stabile in condizioni acide, gli ioni idrossidi portano alla scissione idrolitica dei legami metallo-ossigeno (M-O)30. Questo complesso processo comporta la perdita di una o più sottounità ottahedrali MO6, che porta alla formazione di specie monovacanti e trivacanti e alla fine alla completa decomposizione dei POM. La nostra discussione qui sarà limitata ai prodotti di decomposizione parziale dell'acido 12-foshotungstic a pH 5.5 e 7.5.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare cluster di ossigeno metallico discreti al limite di singola molecola utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Questo metodo consente il rilevamento di cluster metallici nella soluzione. Più specie in soluzione possono essere discriminate con maggiore sensibilità rispetto ai metodi analitici convenzionali33. Con esso, sottili differenze nella struttura POM possono essere chiarite, e a concentrazioni nettamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia NMR. È importante sottolineare che questo approccio consente anche la discriminazione delle forme isomeriche di Na8HPW9O341.

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Protocol

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Nota:< Il protocollo riportato di seguito è specifico per il sistema Nanopatch DC di Electronic BioSciences (EBS). Tuttavia, può essere facilmente adattato ad altri apparecchi di elettrofisiologia utilizzati per misurare la corrente attraverso le membrane pianologiche planari (camera standard del bistrato lipidico, geometria U-tube, microcapillari tirati, ecc.). L'identificazione dei materiali commerciali e delle loro fonti è data per descrivere i risultati sperimentali. In nessun caso questa identificazione implica una raccomandazione del National Institute of Standards and Technology, né implica che i materiali siano i migliori disponibili.

1. Preparazione della soluzione e dell'analita

  1. Preparare tutte le soluzioni elettrolitiche con 18 M-cm di acqua da un sistema di purificazione dell'acqua Type-1 per rimuovere le specie organiche traccia e quindi filtrare tutte le soluzioni elettrolitiche attraverso un filtro a vuoto di 0,22 m immediatamente prima delle registrazioni del canale ionico.
    Nota:< La qualità dell'acqua è un fattore critico per la stabilità e la longevità del sistema nanoporo a membrana.
  2. Tipo selvaggio: HL.
    1. Seguire le precauzioni MSDS durante la manipolazione della proteina tossina .
    2. Mescolare la polvere di tipo monomerico lofilfato-selvaggio S. aureus -Hemolysin ()con 18 M-cm di acqua a 1 mg/mL. Distribuire da 10 a 30 gradi del campione in tubi di centrifuga crio-sicuri, congelare rapidamente in azoto liquido e quindi conservare a -80 gradi centigradi. In alternativa, utilizzare purificato eferoerica preformato :HL31.
  3. Sciogliere il lipido 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhyPC) a 0,2 mg/mL in n-decane in una fiala di vetro da 4 mL con un cappuccio rivestito in politetrafluoroetileneflon. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi per un uso ripetuto per un massimo di un mese.
  4. Preparare soluzioni di acido fosfofongtico.
    1. Seguire le precauzioni MSDS durante la manipolazione della polvere di acido fosfotungtico e preparare una soluzione di 2 mm di stock di acido fosfotungstico sciogliendo 57,6 mg di H3PW12O40 in 10 mL di 1 M NaCl e 10 mM NaH2PO4 soluzione, che costituisce la soluzione di stock.
    2. Prendi 5 mL di questa soluzione e regola il pH a 5,5 con 3 M NaOH. Regolare il pH degli altri 5 mL della soluzione di riserva a 7,5 con 3 M NaOH.
      Nota:< A pH 5.5, l'acido 12-phosphotungstic (PTA, H3PW12O40) si decompone principalmente nell'anione monovuoto [PW11O39]7-.

2. Assemblaggio delle celle di prova

  1. Assemblare la cella di prova in base alle istruzioni del produttore.
  2. Immergere un filo Ag/AgCl in candeggina (ipoclorito di sodio) per 10 minuti dopo abraderlo con 600 carta vetrata a grana. Posizionare l'elettrodo all'interno della membrana nanoporo al quarzo (QNM).
  3. Posizionare un elettrodo a pellet AgCl cilindrico incorporato in un filo d'argento all'esterno del QNM.
  4. Una volta configurata la cella di test, attivare l'alimentatore e il programma di acquisizione dati. Assicurarsi che la lettura corrente del controller di dominio sia 0 pA in assenza di soluzione nella cella di test.
  5. Utilizzare una siringa collegata alla cella di prova tramite una linea fluida per aggiungere una soluzione elettrolitica tamponata sopra la faccia del QNM e per garantire che la corrente ionica saturi l'amplificatore. In caso contrario, il QNM potrebbe essere intasato. Applicare una tensione pop (1 V) e/o una pressione superiore a 300 mm Hg per cancellarla. Se funziona, ridurre la tensione e la pressione.

3. Formazione Bistrato Lipidico

  1. Compilare la soluzione nella cella di test in modo che il livello della soluzione sia ben al di sopra della faccia del QNM. Quindi abbassare il livello della soluzione tramite siringa al di sotto della faccia, in modo che la corrente diminuisca a zero.
  2. Immergi una punta di pipetta da 10 l'l nella fiala lipida. Spingere sul retro della punta della pipetta e toccarlo sul lato della fiala per rimuovere tutti i lipidi visibili.
  3. Toccare la punta pipetta sull'interfaccia aria-acqua della soluzione nella cella di prova quando il livello della soluzione è al di sopra del volto del QNM e attendere da due a cinque minuti affinché il lipido si diffonda uniformemente.
  4. Abbassare lentamente il livello di soluzione al di sotto della faccia del QNM fino a quando l'attuale si satura, e quindi lentamente alzare il livello della soluzione oltre la faccia del QNM per formare una membrana lipidia-bistrato.
    1. Una volta che un biostrato sembra formarsi (cioèquando la corrente va a zero), provare a popping più volte aumentando la pressione e assicurarsi che il QNM non è intasato. Per riformare la membrana lipidica bistrato, abbassare il livello di soluzione sotto la faccia del QNM e lentamente sollevarlo.
  5. Se la membrana lipidiana bistrato non si forma la prima volta, abbassare la soluzione sotto il viso e sollevarlo di nuovo. Se non si forma dopo 3 prove, aggiungere altri lipidi come descritto in 3.2 e 3.3.
  6. Dopo aver formato una membrana, impostare l'offset corrente su zero quando il potenziale applicato è zero.

4. -Formazione dei Pori HL

  1. Aggiungere 2,5 ng di un campione di proteine eferare purificato diHL (o 250 ng di monomerico ) alla cella di prova (volume n. 200) per consentire la formazione del canale.
  2. Aumentare la pressione sul bistrato con una siringa a tenuta di gas (Figura 1) dopo la formazione di un bistrato, per espandere la membrana dal QNM, e facilitare l'inserimento di nanopori. Aumentare la pressione posteriore applicata in genere tra 40 a 200 mmHg, a seconda di ogni QNM.
    Nota:< Il software EBS ha una funzione di inserimento automatico che applica una distorsione superiore (in genere da 200 a 400 mV) per indurre la formazione di pori e quindi riduce automaticamente la tensione desiderata alla distorsione di misurazione una volta che un singolo canale si forma.
  3. Dopo la forma di un nanoporo, ridurre la pressione posteriore a circa 1/2 della pressione di inserimento. Se si osservano più canali, rimuoverli riducendo significativamente la pressione.

5. Partizionamento del cluster metallico nel Nanopore

  1. Per tenere conto degli squilibri degli elettrodi, impostare la tensione di offset DC in modo che quando il potenziale applicato sia impostato su zero non vi è corrente misurata.
  2. Prima di aggiungere il campione POM, eseguire un esperimento dicontrollo per assicurarsi che non vi siano contaminanti (ad esempio, traccia di POM da un esperimento precedente) nel serbatoio. In particolare, acquisire una traccia di corrente ionica sotto un potenziale applicato di 120 mV a -120 mV in assenza di QUALSIASI POM per verificare che non siano presenti blocchi di corrente spontanei.
    Nota:< A causa della struttura asimmetrica del canale di hL (Figura 1), la grandezza della corrente ionica differirà per i potenziali applicati positivi e negativi. Il rapporto tra la corrente misurata al di sopra di questa tensione applicata è indicativo dell'orientamento del nanoporo HL nella membrana.
  3. Aggiungere il campione di POM scaricando il serbatoio con una soluzione a grappolo metallico a concentrazione da 1 a 5 mM. In alternativa, caricare il campione nel capillare prima dell'assemblaggio cellulare per studiare il partizionamento dei POM nell'altra estremità del canale .
  4. Registrare la corrente ionica utilizzando il software del produttore per rilevare i blocchi di corrente transitori causati dal partizionamento di singoli POP nel nanoporo. Stimare le proprietà fisiche e chimiche della molecola dalla profondità del blocco della corrente ionica, dalla frequenza degli eventi e dalla distribuzione del tempo di residenza dei blocchi.

6. Registrazioni e analisi dei dati del canale Ion

  1. Acquisisci le misurazioni delle serie temporali correnti ioniche utilizzando un amplificatore ad alta impedizione, a basso rumore e un sistema di acquisizione dei dati. Eseguire le misurazioni a una tensione applicata di -120 mV (relativa al lato del canale) per ogni pH.
  2. Applicare un filtro Bessel a 8 poli a 8 poli a passate basso al segnale, che viene successivamente digitalizzato a 500 kHz (cioè 2 ms/punto). Estrarre gli eventi dalla serie temporale e analizzare gli eventi utilizzando l'algoritmo ADEPT nel pacchetto software MOSAIC 32,33.

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Results

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Negli ultimi due decenni, i pori su scala nanometrica delle proteine legate alla membrana sono stati dimostrati come sensori versatili a singola molecola. Le misurazioni basate su nanopori sono relativamente semplici da eseguire.  Due camere piene di soluzione elettrolitica sono separate da un nanoporo incorporato in una membrana lipidica isolante elettricamente. Un amplificatore patch-clamp o un alimentatore esterno fornisce un potenziale elettrostatico attraverso i nanopori tramite<...

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Discussion

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A causa della loro carica anionica, i POM probabilmente si associano alle contro-zioni organiche attraverso interazioni elettrostatiche. Pertanto, è importante identificare le condizioni di soluzione appropriate e gli ambienti elettrolitici corretti (in particolare le cazioni nella soluzione) per evitare la formazione complessa con i POM. Particolare attenzione è necessaria nella scelta del buffer. Ad esempio, la velocità di acquisizione dei POM con soluzioni tris(idrossimetile) aminomethane e citrico-buffered è signific...

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Acknowledgements

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Siamo grati per il sostegno finanziario dell'Organizzazione europea di biologia molecolare per una borsa di studio post-dottorato (a J.E.) e una sovvenzione del NIH NHGRI (a J.J.K.). Apprezziamo l'aiuto dei professori Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Columbia University) per aver fornito eptameric SRl, e per aver ispirato le discussioni con il professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nanopatch DC SystemElectronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAKFiltro
1,2-Diphytanoil-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850356P
Decano, ReagentPlus, ≥ 99%,Sigma-AldrichD901
α HLList Biological Laboratories, Campbell, CA
Filo AgAlfa Aesar
2 mm Ag/AgCl elettrodo a discoIn Vivo MetricE202
Sistema di amplificazione ad alta impedenzaBiosciences, San Diego, CA
capillari
di prova
Elaborazione e analisi dei dati MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
Acido fosfotungstico idratoSigma-Aldrich455970
Cloruro di sodioSigma-AldrichS3014
fosfato di sodio monobasico monoidratoSigma-Aldrich71507
sottovuoto Millipore Electronic di quarzo cella personalizzata in policarbonato

References

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