Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Summary

Qui, presentiamo un metodo per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila , sostituendo il primo esone codifica dei geni con driver di trascrizione. Il metodo basato su CRISPR/Cas9 inserisce una sequenza di transactivator ai sensi del regolamento endogeno di un gene sostituito e di conseguenza facilita transctivator espressione esclusivamente in reticoli spatiotemporal gene-specifico.

Abstract

Sistemi di trascrizione binario sono potenti strumenti genetici ampiamente usati per la visualizzazione e manipolazione cellulare destino e l'espressione genica in specifici gruppi di cellule o tessuti in organismi modello. Questi sistemi contengono due componenti distinte linee transgeniche. Un'autista linea esprime un attivatore trascrizionale sotto il controllo di promotori tessuto-specifici/Enhancer, un reporter/effettrici linea porticcioli e un gene bersaglio posizionato a valle per il sito di legame dell'attivatore di trascrizione. Animali che harboring entrambi i componenti inducono la transattivazione di tessuto-specifica di un'espressione di gene di destinazione. Spazio-temporale precisa espressione del gene in tessuti mirati è critica per interpretazione imparziale dell'attività del gene e delle cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un metodo per la generazione di linee di esclusivo cellula/tessuto-specifico driver è essenziale. Qui presentiamo un metodo per generare il sistema di espressione mirati altamente tessuto-specifica con l'ausilio di un "cluster regolarmente Interspaced breve palindromi Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas)-base tecnica di editing genomico. In questo metodo, l'endonucleasi Cas9 è bersagliato da due chimerico guida RNAs (gRNA) a siti specifici nel primo esone codifica di un gene nel genoma della drosofila per creare rotture a doppio filamento (DSB). Successivamente, utilizzando un plasmide di donatore esogeno contenente la sequenza di transactivator, il macchinario di riparazione delle cellule-autonoma consente il ripristino diretto di omologia (HDR) del DSB, con conseguente eliminazione precisa e sostituzione dell'essone con il transactivator sequenza. Il transactivator bussò-in è espresso esclusivamente in cellule dove il cis-elementi regolatori del gene sostituito sono funzionali. Il protocollo dettagliato passo-passo qui presentato per la generazione di un driver binario trascrizionale espresso in Drosophila fgf/prive-producendo le cellule epiteliali/neuronali può essere adottato per qualsiasi espressione di gene - o tessuto-specifico.

Introduction

Casella degli strumenti genetico per espressione genica mirata è stato ben sviluppato in Drosophila, che lo rende uno dei migliori sistemi di modello per studiare la funzione dei geni coinvolti in un'ampia varietà di processi cellulari. Sistemi di espressione binaria, come il lievito Gal4/UAS (sequenza di attivazione a Monte), fu adottato per risultati di intrappolamento e gene tessuto-specifici enhancer in Drosophila modello genetico¹ (Figura 1). Questo sistema ha facilitato lo sviluppo di un gran numero di tecniche come la regolazione spazio-temporale della sovraespressione genica, risu....

Protocol

1. progettare e costruire il gRNA vettore di espressione

1. Per appunto sostituire una regione lungo definita di un esone, utilizzare una gRNA doppio approccio⁶, in cui ogni gRNA puoi indirizzare specificamente due estremità dell'area di interesse selezionata. Per ottenere un'accurata espressione spatiotemporal gene-specifico del driver, selezionare due siti di destinazione gRNA entro il primo esone codifica del gene.
2. Per Drosophila melanogaster, selezionare i siti di destinazione gRNA utilizzando lo strumento ottimale Target Finder flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Altri strume....

Results

Questo protocollo è stato usato con successo per generare un sistema specifico di espressione binaria mirati reporter per bnl che esprimono le cellule⁵. Il cis-elementi regolatori (CREs) che controllano l'espressione complessa spatiotemporal bnl non sono caratterizzati. Pertanto, per raggiungere spatiotemporal espressione sotto il controllo della sequenza regolamentazione endogeno bnl , solo il primo esone codifica di bnl

Discussion

Tradizionalmente, trappole del rinforzatore di Drosophila sono stati generati da due diversi metodi. Uno dei modi include l'inserimento casuale di un driver (es., Gal4) sequenza del genoma di recepimento (ad es., trasposizione elemento P)¹ . In alternativa, le sequenze di driver possono essere posizionate sotto il controllo trascrizionale di una regione enhancer/promotore presunto in un costrutto di plasmide, che sarebbe poi integrato in una sede ectopica del genoma

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	clonazione
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	clonazione
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Biologia molecolare
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Biologia molecolare
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Biologia molecolare
Acqua ultrapura senza DNasi/RNasi	ThermoFisher Scientific	10977-023	Biologia molecolare
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Biologia molecolare
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Biologia molecolare
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Biologia molecolare
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kit	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Primer enzimatici
	di restrizione IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA modello e vettore per gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa biosystems)Kapa	biosystems	KK2601	PCR
Q5-alta fedeltà Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	Assemblaggio del DNA
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		Modello di DNA per l'amplificazione LexA
Proteinasi K	ThermoFisher Scientific	25530049	Biologia Molecolare
2x PCR PreMix, con colorante (rosso)	Sydlab	MB067-EQ2R
Kit di eluizione in gel	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300
Reagente	TRI per biologia molecolareSigma-Aldrich		Biologia molecolare
Kit di purificazione diretta dell'RNA	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Biologia molecolare
OneTaq Kit RT-PCR One-Step	NEB	E5315S	Biologia molecolare
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Laboratorio		Volare la cima
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Microscopio confocale SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereomicroscopio	Olympus	SZ-61	fly pushing
Pestelli omogeneizzatori per microprovette	Fisher-Scientific	03-421-217	Isolamento genomico del DNA
Spettrofotometro NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-1000	Quantificazione del DNA