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Articolo metodologico

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

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DOI:

10.3791/58270

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4 dicembre 2018

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1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

In questo articolo

Sommario

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l'uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.

Abstract

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è caratterizzata dall'espansione di cloni di cellule B maligne e rappresenta la leucemia più comune nei paesi occidentali. La maggior parte dei pazienti affetti da LLC Mostra un corso indolent della malattia così come un fenotipo anergic delle loro cellule di leucemia, riferendosi a un recettore delle cellule B non risponde a stimoli esterni. Abbiamo recentemente dimostrato che il fattore di trascrizione NFAT2 è un regolatore cruciale di anergy in CLL. Una sfida importante nell'analisi del ruolo del fattore di trascrizione in diverse malattie è l'identificazione dei suoi geni bersaglio specifico. Questo è di grande importanza per la delucidazione dei meccanismi patogenetici e gli interventi terapeutici potenziali. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA e può, pertanto, essere utilizzato per identificare i geni bersaglio diretto di fattori di trascrizione nelle cellule dei mammiferi. Qui, ChIP è stata usata per identificare LCK come un gene bersaglio diretto di NFAT2 in cellule CLL umane. DNA e proteine associate sono reticolati con formaldeide e successivamente Tosato di sonicazione in frammenti di DNA di circa 200-500 paia di basi (bp). Reticolato frammenti di DNA associati NFAT2 sono quindi selettivamente immunoprecipitata da detriti cellulari usando un anticorpo di αNFAT2. Dopo la purificazione, frammenti di DNA associati vengono rilevati tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Sequenze di DNA con evidente arricchimento rappresentano regioni del genoma che sono mirate per NFAT2 in vivo. Tosatura appropriato del DNA e la selezione dell'anticorpo richiesto sono particolarmente cruciale per la riuscita applicazione di questo metodo. Questo protocollo è ideale per la dimostrazione di interazioni dirette di NFAT2 con geni bersaglio. Il suo limite principale è la difficoltà di impiegare ChIP nelle analisi su larga scala, analizzando i geni bersaglio di più fattori di trascrizione negli organismi intatti.

Introduzione

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) rappresenta la leucemia più comune negli adulti nei paesi occidentali, che esibiscono distinto accumulo di CD19, CD23 e CD5 esprimendo maturo B cellule1. Maggior parte dei pazienti mostrano un decorso indolente, che non necessitano di un trattamento specifico per molti anni. Al contrario, alcuni pazienti mostrano progressione rapida che richiedono immediati interventi terapeutici con immunitario-chemioterapia o altre terapie mirate2,3. Fattore nucleare delle cellule di T attivate (NFAT) è una famiglia di fattori di trascrizione che controllano vari inerente allo sviluppo e processi di attivazione in numerose cellule tipi4,5,6. Recentemente abbiamo dimostrato la sovraespressione e attivazione costituzionale di NFAT2 in cellule di CLL da pazienti con malattia indolente7. Qui, regola uno stato non rispondono alla stimolazione del recettore delle cellule B chiamato anergy7. Per dimostrare che NFAT2 si lega al promotore del linfocita specifico proteina tirosina chinasi (LCK) e regola l'espressione di LCK in cellule umane di CLL, un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina specifici (ChIP) è stato sviluppato e impiegato.

ChIP è una delle diverse tecniche per studiare il ruolo dei fattori di trascrizione genica espressione8. Espressione genica è strettamente orchestrato in un modo molto complesso da parecchi regolatori con fattori di trascrizione prendendo una parte insostituibile in questo processo9,10,11,12. Fattori di trascrizione che regolano l'espressione genica in un contesto spaziale e temporale sono state identificate in numerose specie (ad es., per lo sviluppo ed il differenziamento)13,14,15, 16,17,18. Errori nei meccanismi di controllo intricato che coinvolgono fattori di trascrizione possono condurre ad una varietà di processi patologici compreso cancro19,20. Quindi, identificazione dei fattori di trascrizione e i rispettivi obiettivi potrebbe offrire nuove vie terapeutiche21,22. Per studiare questo campo intrigante diversi metodi sono disponibili come ChIP, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA), vari saggi di pull-down di DNA e reporter-saggi8,11,12, 23 , 24.

Per dimostrare che un certo fattore di trascrizione interagisce con regioni specifiche del genoma in vivo ChIP è una tecnica ideale25. Per questo scopo, DNA e proteine associate in cellule viventi sono reticolate mediante irradiazione UV o formaldeide (ChIP con collegamenti incrociati, XChIP). Questo passaggio viene omesso per ottenere migliore DNA e proteina recupero nel cosiddetto nativo ChIP (NChIP)26. I complessi della DNA-proteina sono successivamente tranciati di sonicazione in frammenti di circa 200-500 paia di basi (bp) e immunoprecipitati dai detriti cellulari utilizzando un anticorpo specifico contro il fattore di trascrizione di interesse. I frammenti di DNA associati sono quindi purificati e caratterizzati da PCR, clonazione molecolare e sequenziamento. Tecniche alternative utilizzano microarrays (ChIP-on-Chip) o il sequenziamento di nuova generazione (ChIP-Seq) per analizzare il DNA immunoprecipitato.

ChIP è stato introdotto da Gilmour e Lis nel 1984 quando usati UV luce a legame covalente del DNA cross-link e associato a proteine in vita batteri27. Dopo la lisi cellulare e immunoprecipitazione della RNA polimerasi batterica, sonde specifiche di geni noti sono state usate per mappare la distribuzione in vivo e la densità della RNA polimerasi. Il metodo è stato successivamente utilizzato dai ricercatori stessi per analizzare la distribuzione della polimerasi II del RNA eucariotica su geni di proteina shock termico in Drosophila28. Il dosaggio di XChIP fu ulteriormente perfezionato da Varshavsky e colleghe che usò il formaldeide cross-linking per studiare l'associazione dell'istone H4 con heat shock protein geni29,30. L'approccio di NChIP, che porta il vantaggio di un migliore recupero di DNA e proteine a causa di epitopi naturalmente intatti e, pertanto, una maggiore specificità dell'anticorpo, in primo luogo è stato descritto da Hebbes e colleghi nel 198831.

Il vantaggio del ChIP rispetto ad altre tecniche per analizzare le interazioni della DNA-proteina è, infatti, che l'interazione effettiva di un fattore di trascrizione può essere studiato in vivo e senza sonde o condizioni artificiali create da buffer o gel sono impiegato8,11,12. Combinando il ChIP con sequenziamento di nuova generazione, obiettivi multipli possono essere identificati simultaneamente.

Principali limitazioni di questa tecnica sono sua applicabilità limitata ai saggi su larga scala in organismi intatto25. L'analisi dei pattern di espressione genica differenziale può anche essere impegnativo utilizzando tecniche di ChIP se le rispettive proteine sono espresse solo a livelli bassi o finestra temporale stretto. Un altro fattore potenzialmente limitante è la disponibilità di un anticorpo appropriato adatto per ChIP11.

Il protocollo di ChIP qui presentato possa essere impiegato per l'identificazione in vivo dei geni bersaglio di un fattore di trascrizione mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). In particolare, l'obiettivo era di identificare nuovi target geni di NFAT2 in CLL. ChIP è stato scelto per il suo potenziale per dimostrare direttamente l'associazione di NFAT2 per le regioni promotrici dei geni bersaglio diverse condizioni naturali in cellule umane del paziente di CLL.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti condotti con materiale umano sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Tübingen e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno contribuito campioni a questo studio.

1. isolamento e stimolazione di Jurkat cellule

Nota: Per ottimizzare il protocollo, utilizzare la linea cellulare Jurkat che è noto che esprimono alti livelli di NFAT2. Tutti i passaggi sono eseguiti sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare 50 mL di RPMI 1640, completato con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina da riscaldandola a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Per 1-2 d in un matraccio di cultura cellulare a 37 ° C e 5% di CO2 in 20 mL di RPMI 1640 completati con 10% di FCS e 1% di penicillina/streptomicina ad una densità di circa 2 x 106 cellule/mL della coltura le cellule Jurkat (celle vengono conteggiate con Trypan blu colorazione e un Camera di Neubauer al microscopio) e raccoglierle mediante centrifugazione per 5 min a 200 x g.
  3. Rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI 1640 completati con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina. Successivamente, contare le celle con una colorazione blu di trypan convenzionale e una camera di Neubauer sotto il microscopio.
  4. Centrifugare le cellule dal passaggio 1.3 per 5 min a 200 x g ed eliminare il surnatante tramite aspirazione. Quindi, risospendere le cellule ad una densità di 2 x 107 cellule/mL in RPMI 1640 completati con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina e trasferire 1 mL in un nuovo tubo 5ml convenzionale di pipettaggio.
  5. Stimolano le cellule aggiungendo 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e ionomicina 1 µM. Incubare le cellule per 16 h a 37 ° C e 5% di CO2 con il coperchio del tubo aperto (per evitare la contaminazione, può essere utilizzata una pellicola sigillante permeabile all'aria).

2. isolamento e stimolazione delle cellule CLL primarie da pazienti umani

Nota: I campioni dei pazienti erano acquistati e stimolati come descritto in precedenza7. Tutti i passaggi sono eseguiti sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare l'attrezzatura necessaria per prelevare il sangue dai pazienti ed eseguire una separazione di gradienti di densità: aghi 21G, laccio emostatico, NH4-eparina-sangue siringhe di raccolta (ad es., S-monovettes), 1x PBS e medio gradiente di densità (densità 1,077 g/mL) .
  2. Al momento del prelievo venoso, prelevare il sangue da pazienti affetti da LLC (ca. 40 mL di sangue per paziente) nelle siringhe. Quindi trasferire il sangue in provette coniche da 50 mL. Lavare la siringa con 10 mL di PBS e piscina il sangue-PBS-sospensione nei tubi 50 mL (regolare il numero di tubi per il volume di sangue).
  3. Preparare 15 mL di terreno densità gradiente in un tubo conico di fresca 50 mL. Successivamente, strato 35 mL di sangue-PBS-sospensione attentamente sul supporto di gradienti di densità. A tal fine, tenere il tubo ad angolo piatto e pipettare lentamente il sangue-PBS-sospensione contro la parete di fondo della provetta conica 50 mL. Come più di sangue-PBS-sospensione sta accumulandosi nella provetta conica da 50 mL, aumentare l'angolo del tubo fino a un angolo retto. Ripetere questo passaggio in base al volume di sangue-PBS-sospensione.
  4. Eseguire centrifugazione a 560 x g per 20 min (senza freno), quindi estrarre la fase delle cellule mononucleari che contiene le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs). A tale scopo, raccogliere l'interfase bianco della separazione gradienti di densità con una pipetta sierologica di 5ml e trasferirlo in una nuova provetta conica 50 mL.
  5. Riempire la sospensione cellulare a 50 mL con PBS e centrifugare per 5 min a 360 x g. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Ripetere questo passaggio con centrifugazione per 5 min a 275 x g. Quindi, piscina le cellule di un paziente in 5-10 mL di PBS in una provetta conica da 50 mL.
  6. Contare le celle come descritto al punto 1.3.
    Nota: Dipende la proporzione di cellule CLL nei PBMCs isolato, se le cellule possono essere usate direttamente per questa procedura o un isolamento delle cellule di B deve essere condotta, per esempio, via magnetico cella ordinamento (MACS). L'isolamento delle cellule di B è consigliata ma può essere omesso se la proporzione di cellule CLL è superiore al 95% dei linfociti totali (determinati tramite citometria a flusso). Pazienti di sangue di CLL è fisso e lisate secondo le istruzioni del produttore. Una colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE viene eseguita secondo le istruzioni del produttore, quindi le cellule vengono analizzate tramite flusso cytometry. Un paziente esemplare è illustrato nella Figura 1, in cui la proporzione di cellule CLL è 89.03%. Così, un isolamento delle cellule di B deve essere effettuato in questo paziente. La proporzione di cellule B fisiologiche è trascurabile (3,72% nell'esempio).
  7. Lavare le cellule con 10 mL di pre-riscaldato (37 ° C) RPMI 1640 completati con 10% FCS, 1% di penicillina/streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 100 mM, 1 mM sodio piruvato e 50mm β-mercaptoetanolo per 5 min a 200 x g ed eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  8. Regolare le cellule a 2 x 107 cellule/mL in RPMI 1640 completati con 10% FCS, 1% di penicillina/streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 100 mM, 1 mM sodio piruvato e 50mm β-mercaptoetanolo (37 ° C) e riempimento 1 mL di sospensione cellulare in una provetta da 5 mL.
    Nota: La ß-mercaptoetanolo è impiegato per contrastare lo stress ossidativo.
  9. Stimolano le cellule aggiungendo 32,4 nM PMA e ionomicina 1 µM. Incubare le cellule per 16 h a 37 ° C e 5% di CO2 con il coperchio del tubo aperto (per evitare la contaminazione, può essere utilizzata una pellicola sigillante permeabile all'aria).
    Nota: Per ridurre il livello di stress le cellule possano essere riposate per 1h a 37 ° C e 5% di CO2 nell'incubatrice prima la 16h di stimolazione.

3. fissazione, lisi cellulare e cromatina tosatura

Nota: Campioni dei pazienti e cellule Jurkat sono fissi e lisate con un kit disponibile in commercio ChIP secondo le istruzioni del produttore con le modifiche come descritto in precedenza7. La fissazione avviene sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare una provetta da 1,5 mL con 1 mL di formaldeide al 37%, una provetta da 1,5 mL con 1 mL di 1,25 M glicina, una provetta da 5 mL con 4 mL di 1X PBS e una scatola con ghiaccio per la fissazione delle cellule.
  2. Dopo stimolazione delle cellule per il tempo di incubazione rispettivi nel passaggio 1.5 o 2.9, spin le provette da 5 mL a 200 x g per 5 min e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS nei tubi da 5 mL.
  3. Aggiungere 340 formaldeide µM (13,5 µ l di formaldeide al 37%) per le cellule. Dopo la breve miscelazione pipettando attentamente su e giù Incubare la sospensione per 2,5 min (cellule Jurkat) o a 5 min (campione) a temperatura ambiente.
    Nota: Fissazione prolungata tempo è necessario per cellule primarie assicurare il taglio ottimale.
  4. Aggiungere glicina 125 mM (57 µ l di 1,25 M glicina) per arrestare la fissazione e incubare per un altro 5 minuti mettere le celle su ghiaccio subito dopo e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  5. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ghiacciata a 200 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
    Nota: Dopo la fissazione, il protocollo può essere sospesa. Celle fisse devono essere conservate a-80 ° C. Per verificare, se l'epitopo dell'anticorpo destinato a utilizzare nel seguente protocollo non è mascherato tramite la fissazione, i campioni supplementari possono essere utilizzati per l'analisi tramite l'elettroforesi del gel di SDS-PAGE e Western blot. Questi passaggi vengono eseguiti con 100 µ g di proteina secondo le istruzioni del produttore. Tutti gli anticorpi di αNFAT2 sono utilizzati ad una diluizione di 1: 1000, l'anticorpo GAPDH ad una diluizione di 1: 10000. Un'immagine esemplare di campioni fissati dalle cellule Jurkat con anticorpi opportuno e inopportuno è illustrata nella Figura 2.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi commercialmente disponibile 1 pipettando su e giù. Posizionare i campioni sul ghiaccio in uno shaker, quindi li Incubare per 10 minuti agitando.
    Nota: Prima della lisi, le cellule possono essere disintegrate per 10 s in azoto liquido. Ciò è utile per le cellule Jurkat ma deve essere evitato nei campioni primari. Per la disintegrazione, posizionare le provette da 5 mL per 5 s in 5-10 mL di azoto liquido in un contenitore specifico. Indossare occhiali e guanti di sicurezza adeguati.
  7. Successivamente, centrifugare le provette a 500 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con attenzione di pipettaggio.
  8. Omogeneizzare le cellule in 5 mL di tampone di lisi commercialmente disponibili 2 pipettando su e giù e incubare per 10 minuti in ghiaccio mentre si stringono. Centrifugare le provette a 500 x g per 5 min a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante con attenzione di pipettaggio.
  9. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l (cellule Jurkat) o 140 µ l (campioni) di tosatura tampone 1 contenente 1 x inibitore della proteasi (5 µ l o 1,4 µ l, rispettivamente) ed incubare la miscela per 10 minuti in ghiaccio.
  10. Per la cromatina tosatura, trasportare 140 µ l della sospensione delle cellule dal passaggio 3.9 nelle provette di sonicatore (evitare la produzione di bolle d'aria e ripetere questo passaggio se necessario a causa del volume di campione). Posizionare i tubi in ultra-sonicatore mirato ad una temperatura di 7 ° C e taglio per 10 min (linea cellulare) o 7,5 min (campioni) con una potenza media di incidente di 9,375 W per ottenere frammenti di DNA di 200-500 bp.
  11. Infine, centrifugare a 15700 x g per 10 min a 4 ° C nella piccola centrifuga e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
  12. Per verificare le dimensioni del frammento appropriato, è necessario analizzare 20 µ l della cromatina tranciata tramite elettroforesi in gel di agarosio 1.5% TBE. Un'immagine esemplare della cromatina tranciata da cellule Jurkat di qualità buone e cattive è illustrata nella Figura 3. A questo punto, il protocollo può essere potenzialmente messo in pausa. Tranciate cromatina deve essere conservata a-80 ° C.

4. immunoprecipitazione della cromatina

Nota: L'immunoprecipitazione della cromatina è stato effettuato con un kit disponibile in commercio ChIP secondo le istruzioni del produttore con modifiche7.

  1. Calcolare il numero di immunoprecipitazione (70 µ l (cellule Jurkat) o 15 µ l (campioni) di cromatina tranciata plus un anticorpo) e preparare 20 µ l di proteina A rivestito perline per precipitazione in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle in 40 µ l di 1 x ChIP tampone 1 per precipitazione pipettando su e giù, lasciare le perline riposare in un rack magnetico per 1 min e rimuovere il surnatante pipettando. Eseguire questo passaggio quattro volte in totale. Alla fine, risospendere le perle del volume originale con tampone ChIP 1x 1.
  2. Per immunoprecipitazione in sé, è possibile utilizzare 10 µ g dell'anticorpo αNFAT2 (7A6) per acquisire NFAT2 con relative sequenze di destinazione associata. Utilizzare 2,5 µ g di un anticorpo di IgG di coniglio (DA1E) come un controllo di IgG. Preparare le reazioni in provette fresco 1,5 mL come indicato nella tabella 1.
    Nota: È importante utilizzare un anticorpo monoclonale con alta affinità cui epitopo non è mascherato durante la fissazione per questo protocollo. Gli anticorpi policlonali di introducono un ulteriore livello di variazione che lo rende molto più difficile da interpretare in modo appropriato i risultati ricevuti.
  3. Incubare la miscela dalla fase 4.2 durante la notte a 4 ° C su una ruota rotante a 6 giri/min.
  4. Il prossimo giorno girare le provette per 5 s a 7.000 x g nella piccola centrifuga, li Incubare in un rack magnetico per 1 min ed eliminare il surnatante tramite aspirazione. Lavare le perle una volta con ciascuno dei buffer di lavaggio 1, 2, 3 e 4 consecutivamente.
  5. A tale scopo, risospendere le sfere in 350 µ l di tampone di lavaggio e li Incubare per 5 min a 4 ° C su una ruota rotante a 6 giri/min.
  6. Da allora in poi, girare i tubi per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola. Poi, li posto per 1 min in un rack magnetico, rimuovere il supernatante e aggiungere il tampone di lavaggio successivo.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, eliminare il surnatante pipettando, prendere le perle in 100 µ l di tampone di eluizione 1 e li Incubare 30 min su una ruota rotante a 6 giri/min.
  8. Girare i tubi poco (5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga) e metterli in un rack magnetico per 1 min.
  9. Quindi trasferire il surnatante pipettando in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 4 µ l di tampone di eluizione 2.
  10. Per creare il controllo di input, mescolare 1 µ l della cromatina tranciata con 99 µ l di eluizione buffer 1 e 4 µ l di tampone di eluizione 2 (in questa configurazione, ci sono tre tubi al paziente: un ingresso di controllo, un IgG-Controllo e un campione di αNFAT2).
  11. Incubare i campioni per 4 h a 65 ° C e 1300 giri/min in uno shaker di tubo da 1,5 mL. Aggiungere 100 µ l di 100% isopropanolo, vortice e spin i campioni per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola.
  12. Risospendere le microsfere magnetiche disponibili accuratamente nel Vortex, aggiungere 10 µ l di perline per ogni campione e incubare per 1 h a temperatura ambiente su una rotella di rotazione a 6 giri/min.
  13. Dopo l'incubazione, girare le provette per 5 s a 7000 x g nel piccolo centrifugare e li posto per 1 min in un rack magnetico. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  14. Risospendere le sfere in 100 µ l di tampone di lavaggio 1. Invertire i tubi per miscelare e incubare per 5 min a temperatura ambiente su una rotella di rotazione a 6 giri/min.
  15. Girare i tubi per 5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga, li posto per 1 min in un rack magnetico e rimuovere il surnatante di pipettaggio. Ripetere i passaggi 4.13-4.14 con tampone di lavaggio 2.
  16. Successivamente, rimuovere il tampone di lavaggio dall'aspirazione, risospendere le sfere in 55 µ l di tampone di eluizione e incubare per 15 min a temperatura ambiente sulla ruota rotante a 6 giri per eluire il DNA precipitato. Infine, girare le provette per 5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga, li posto per 1 min in un rack magnetico e trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 mL.
    Nota: Qui il protocollo può essere potenzialmente messo in pausa. Il DNA eluito quindi deve essere conservato a-20 ° C.

5. rilevazione dei geni bersaglio NFAT in cellule di CLL.

  1. Condurre la reazione di qRT-PCR in duplicato per ogni campione come indicato nella tabella 2.
    Nota: Per la rilevazione dei geni target di un Real-Time PCR quantitativa (qRT-PCR) è condotto utilizzando un Mix di commercialmente disponibile qRT-PCR con uno strumento di Real-Time PCR.
  2. Utilizzare bianco 96 pozzetti reazione piastre per le reazioni e lo strumento di RT-PCR. Le condizioni in bicicletta sono come segue: 95 ° C per 30 s, [95 ° C per 5 s, 60 ° C per 30 s] x 40 cicli.
    Nota: Una diluizione seriale dell'input (puro o diluito 01:10, 1: 100 e 1: 1000 in acqua priva di nucleasi) viene utilizzata per calcolare il relativo arricchimento. In cellule Jurkat, IL-2 è stato usato come un controllo positivo32. CD40L, una destinazione ben nota di NFAT2 in cellule di B, è stato utilizzato come controllo positivo nelle cellule CLL e LCK come esempio per un gene di nuovi target di NFAT2 in CLL33,34. I primers per la regione del promotore CD40L, il -2 e LCK sono descritti nella tabella di reagenti specifici e attrezzature.

6. normalizzazione e analisi dei dati

Nota: Relativo arricchimento per le regioni promotrici di interesse (il-2, CD40L o LCK) viene calcolato utilizzando il controllo di IgG per la normalizzazione.

  1. In primo luogo, determinare i valori di Ct (ciclo soglia) per la diluizione seriale input, IL-2, CD40L e regione del promotore LCK tramite il software di valutazione dai dati qRT-PCR.
  2. Definire una curva standard per le concentrazioni tramite la diluizione seriale dell'input. Con questa curva standard calcolare la concentrazione per il IL-2, CD40L e regione del promotore LCK per ogni duplicato di ogni campione.
  3. Successivamente, calcolare la media dei duplicati. Quindi, impostare il campione di immunoprecipitazione di IgG come riferimento. Definire il relativo arricchimento di questo esempio come 1.0 e confronta l'altro campione (dall'immunoprecipitazione di NFAT2) a questo riferimento.
  4. Infine, è possibile calcolare l'arricchimento relativo dividendo la concentrazione dei campioni dalla concentrazione del riferimento IgG.

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Risultati

La figura 1 Mostra un'analisi di citometria a flusso esemplare di un paziente CLL eseguita dopo colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a Mostra il gating dei linfociti, che rappresentano la maggioranza delle cellule nel sangue di pazienti affetti da LLC. Figura 1b Mostra la proporzione del CD19+/CD5+ CLL cellule, che rappresentano 89.03% dei linfociti in questo es...

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Discussione

I passaggi critici di esecuzione di un test di ChIP successo sono la selezione di un anticorpo appropriato e l'ottimizzazione della cromatina tosatura processo25. La selezione dell'anticorpo αNFAT2 ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo durante lo sviluppo del presente protocollo. Mentre ci sono parecchi anticorpi αNFAT2 disponibili in commercio e la maggior parte di questi funziona bene per macchiarsi occidentale e altre applicazioni, clone 7A6 era l'unico anticorpo che potrebbe esse...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal DFG concedere MU 3340/1-1 e la Deutsche Krebshilfe concedere 111134 (sia assegnato a lollo). Ringraziamo Elke Malenke per l'eccellente assistenza tecnica).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 X PBSSigma AldrichD8537
Agitatore per provette da 1,5 mL Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Può essere sostituito con strumenti simili
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldeide p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anticorpo Anti-NFAT2Alexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 AnticorpoCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 Anticorpo ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
grande centrifugaEppendorf5804RPuò essere sostituito con strumenti simili
CD19-FITC topo Anti-umanoBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE topo Anti-umano CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Mezzo gradiente di densità Biocoll (Densità 1.077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1,5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Citometro a flussoBD BiosciencesFACSCaliburPuò essere sostituito con strumenti simili
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Dispositivo di trasferimento su gelThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Pile di trasferimento, nitrocellulosa, dimensioni regolariThermo Scientific
iDeal ChIp-seq kit per istoniDiagenodeC01010059
sale di calcio ionomicinaSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0,5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0,1 mgLI-COR Biosciences925-32210
Sistema di imaging a infrarossi LI-COR OdysseyLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Piastra multipozzetto 96, biancoRoche4729692001Può essere sostituito con altre piastre in diversi strumenti di PCR in tempo reale
Soluzione di lisi OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 Acqua di grado AFACovaris520101
M220 Ultrasuonatore focalizzatoCovaris500295
Rack magnetico, magnete DynaMag-15Thermo Scientific12301DPuò essere sostituito con strumenti simili
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100XThermo Scientific11140050
Microscopio Axiovert 25Zeiss451200Può essere sostituito con strumenti simili
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer camera di conteggio migliorataKarl Hecht GmbH &                       Co KG40442012Può essere sostituito con strumenti simili
NH4 Eparina MonovetteSarstedt02.1064
Acqua priva di nucleasiPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzettiThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Tampone bloccante (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillina/Streptomicina 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L regione promotore in avantiSigma Aldrich5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'
Primer CD40L regione promotore inversaSigma Aldrich5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
Primer IL-2 promotore regione avantiSigma Aldrich5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'
Primer IL-2 regione promotore inversaSigma Aldrich5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
Primer LCK promotore regione avantiSigma Aldrich5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'
Primer LCK regione promotore inversaSigma Aldrich5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
Coniglio mAb IgG XP Controllo dell'isotipoSegnalazione cellulare# 3900SClone DA1E
Strumento di PCR in tempo realeRocheLightCycler 480Può essere sostituito con strumenti simili
Miscelatori a rulliPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Proteina pre-colorata StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Può essere sostituito con strumenti simili
piccoli CentrifugaThermo ScientificHeraeus Fresco 17Può essere sostituito con strumenti simili
Piruvato di sodioThermo Scientific11360070
ß-MercaptoetanoloThermo Scientific21985023
Soluzione salina tamponata Tris (TBS-10X)Segnalazione cellulare#12498
Soluzione blu di tripanoSigma Aldrich93595-50ML
IB23001

Riferimenti

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