Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l'uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.
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Articolo metodologico
Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è caratterizzata dall'espansione di cloni di cellule B maligne e rappresenta la leucemia più comune nei paesi occidentali. La maggior parte dei pazienti affetti da LLC Mostra un corso indolent della malattia così come un fenotipo anergic delle loro cellule di leucemia, riferendosi a un recettore delle cellule B non risponde a stimoli esterni. Abbiamo recentemente dimostrato che il fattore di trascrizione NFAT2 è un regolatore cruciale di anergy in CLL. Una sfida importante nell'analisi del ruolo del fattore di trascrizione in diverse malattie è l'identificazione dei suoi geni bersaglio specifico. Questo è di grande importanza per la delucidazione dei meccanismi patogenetici e gli interventi terapeutici potenziali. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA e può, pertanto, essere utilizzato per identificare i geni bersaglio diretto di fattori di trascrizione nelle cellule dei mammiferi. Qui, ChIP è stata usata per identificare LCK come un gene bersaglio diretto di NFAT2 in cellule CLL umane. DNA e proteine associate sono reticolati con formaldeide e successivamente Tosato di sonicazione in frammenti di DNA di circa 200-500 paia di basi (bp). Reticolato frammenti di DNA associati NFAT2 sono quindi selettivamente immunoprecipitata da detriti cellulari usando un anticorpo di αNFAT2. Dopo la purificazione, frammenti di DNA associati vengono rilevati tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Sequenze di DNA con evidente arricchimento rappresentano regioni del genoma che sono mirate per NFAT2 in vivo. Tosatura appropriato del DNA e la selezione dell'anticorpo richiesto sono particolarmente cruciale per la riuscita applicazione di questo metodo. Questo protocollo è ideale per la dimostrazione di interazioni dirette di NFAT2 con geni bersaglio. Il suo limite principale è la difficoltà di impiegare ChIP nelle analisi su larga scala, analizzando i geni bersaglio di più fattori di trascrizione negli organismi intatti.
Introduzione
Leucemia linfocitaria cronica (CLL) rappresenta la leucemia più comune negli adulti nei paesi occidentali, che esibiscono distinto accumulo di CD19, CD23 e CD5 esprimendo maturo B cellule1. Maggior parte dei pazienti mostrano un decorso indolente, che non necessitano di un trattamento specifico per molti anni. Al contrario, alcuni pazienti mostrano progressione rapida che richiedono immediati interventi terapeutici con immunitario-chemioterapia o altre terapie mirate2,3. Fattore nucleare delle cellule di T attivate (NFAT) è una famiglia di fattori di trascrizione che controllano vari in....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti condotti con materiale umano sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Tübingen e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno contribuito campioni a questo studio.
1. isolamento e stimolazione di Jurkat cellule
Nota: Per ottimizzare il protocollo, utilizzare la linea cellulare Jurkat che è noto che esprimono alti livelli di NFAT2. Tutti i passaggi sono eseguiti sotto cappa a flusso laminare.
- Preparare 50 mL di RPMI 1640, completato con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina da riscaldandola a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Per 1-2 d ....
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Risultati
La figura 1 Mostra un'analisi di citometria a flusso esemplare di un paziente CLL eseguita dopo colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a Mostra il gating dei linfociti, che rappresentano la maggioranza delle cellule nel sangue di pazienti affetti da LLC. Figura 1b Mostra la proporzione del CD19+/CD5+ CLL cellule, che rappresentano 89.03% dei linfociti in questo es.......
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Discussione
I passaggi critici di esecuzione di un test di ChIP successo sono la selezione di un anticorpo appropriato e l'ottimizzazione della cromatina tosatura processo25. La selezione dell'anticorpo αNFAT2 ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo durante lo sviluppo del presente protocollo. Mentre ci sono parecchi anticorpi αNFAT2 disponibili in commercio e la maggior parte di questi funziona bene per macchiarsi occidentale e altre applicazioni, clone 7A6 era l'unico anticorpo che potrebbe esse.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal DFG concedere MU 3340/1-1 e la Deutsche Krebshilfe concedere 111134 (sia assegnato a lollo). Ringraziamo Elke Malenke per l'eccellente assistenza tecnica).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Agitatore per provette da 1,5 mL Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldeide p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anticorpo Anti-NFAT2 | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 Anticorpo | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 Anticorpo ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| grande centrifuga | Eppendorf | 5804R | Può essere sostituito con strumenti simili |
| CD19-FITC topo Anti-umano | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE topo Anti-umano CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Mezzo gradiente di densità Biocoll (Densità 1.077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1,5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | FACSCalibur | Può essere sostituito con strumenti simili |
| Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Dispositivo di trasferimento su gel | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Pile di trasferimento, nitrocellulosa, dimensioni regolari | Thermo Scientific | ||
| iDeal ChIp-seq kit per istoni | Diagenode | C01010059 | |
| sale di calcio ionomicina | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0,5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0,1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| Sistema di imaging a infrarossi LI-COR Odyssey | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Piastra multipozzetto 96, bianco | Roche | 4729692001 | Può essere sostituito con altre piastre in diversi strumenti di PCR in tempo reale |
| Soluzione di lisi OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 Acqua di grado AFA | Covaris | 520101 | |
| M220 Ultrasuonatore focalizzato | Covaris | 500295 | |
| Rack magnetico, magnete DynaMag-15 | Thermo Scientific | 12301D | Può essere sostituito con strumenti simili |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscopio Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer camera di conteggio migliorata | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| NH4 Eparina Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Acqua priva di nucleasi | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzetti | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Tampone bloccante (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillina/Streptomicina 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L regione promotore in avanti | Sigma Aldrich | 5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3' | |
| Primer CD40L regione promotore inversa | Sigma Aldrich | 5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3' | |
| Primer IL-2 promotore regione avanti | Sigma Aldrich | 5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3' | |
| Primer IL-2 regione promotore inversa | Sigma Aldrich | 5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3' | |
| Primer LCK promotore regione avanti | Sigma Aldrich | 5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3' | |
| Primer LCK regione promotore inversa | Sigma Aldrich | 5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3' | |
| Coniglio mAb IgG XP Controllo dell'isotipo | Segnalazione cellulare | # 3900S | Clone DA1E |
| Strumento di PCR in tempo reale | Roche | LightCycler 480 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| Miscelatori a rulli | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Proteina pre-colorata Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| piccoli Centrifuga | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Può essere sostituito con strumenti simili |
| Piruvato di sodio | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoetanolo | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Soluzione salina tamponata Tris (TBS-10X) | Segnalazione cellulare | #12498 | |
| Soluzione blu di tripano | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Riferimenti
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A.
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Ristampe e permessi
