Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Abstract

Le cellule staminali epiteliali limbal corneale (LESCs) sono responsabili per rinnovare continuamente l'epitelio corneale e mantenendo così l'omeostasi cornea e la chiarezza visiva. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-derivata LESCs forniscono una promettente fonte di cellule per terapia sostitutiva delle cellule corneali. Indefinito, xenogeniche cultura e differenziazione condizioni causano variazione nei risultati di ricerca e ostacolano la traslazione clinica terapeutica hPSC-derivato. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per il differenziamento di hPSC-LESC in condizioni senza cellula xeno - e alimentatore. In primo luogo, cultura dello strato monomolecolare di hPSC indifferenziato il ricombinante laminin-521 (LN-521) e definito hPSC medio costituisce la base per la produzione di robusta di alta qualità materiale di partenza per differenziazioni. In secondo luogo, un metodo di differenziazione rapida e semplice hPSC-LESC produce popolazioni LESC in soli 24 giorni. Questo metodo include un'induzione superficie ectodermica di quattro giorni in sospensione con piccole molecole, seguita dalla fase di coltura aderente sulla matrice di combinazione di LN-521/collagene IV nel mezzo di differenziazione epiteliale corneale definiti. Cryostoring e differenziazione estesa ulteriormente purifica la popolazione delle cellule e consente bancari delle cellule in grande quantità per i prodotti di terapia cellulare. La risultante hPSC-LESCs di alta qualità forniscono una potenziale strategia di trattamento novello per la ricostruzione della superficie corneale per il trattamento di mancanza limbal della cellula formativa (LSCD).

Introduction

La cornea trasparente sulla superficie oculare permette alla luce di entrare la retina e fornisce la maggior parte del potere refrattivo dell'occhio. Lo strato più esterno, l'epitelio cornea stratificato, è continuamente rigenerato con le cellule staminali epiteliali limbal (LESCs). Il LESCs risiedono nello strato basale delle nicchie limbal al corneoscleral giunzione^1,2. LESCs mancano marcatori specifici e unici, quindi la loro identificazione richiede un'analisi più ampia di una serie di markers putativi. P63 di fattore di trascrizione epiteliale e soprattutto N-terminalmente troncato trascrizione dell'isofo....

Protocol

Università di Tampere ha l'approvazione dell'autorità nazionale per gli affari medicolegali Finlandia (Dnro 1426/32/300/05) per condurre una ricerca sugli embrioni umani. L'Istituto ha anche dichiarazioni di sostegno del comitato etico del quartiere ospedaliero Pirkanmaa derivare, cultura, e differenziare le linee di hESC (Skottman/R05116) e di utilizzare linee hiPSC nella ricerca oftalmica (Skottman/R14023). Nessun nuove linee di cellule sono state derivate per questo studio.

Nota: Il protocollo descritto si basa su hPSC specifici, disponibili in commercio e media di differenziazione dell'epitelio corneale. Consultare la Tabella de....

Results

Da hPSCs a hPSC-LESCs

L'intero processo dall'induzione della differenziazione di hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs prende circa 3,5 settimane. Descrizione schematica del metodo differenziazione evidenziando i passi chiavi è presentato in Figura 1A. Figura 1B Mostra morfologie tipiche delle popolazioni di cellule in diverse fasi del protocollo. I dati presentati sono ottenu.......

Discussion

Il risultato previsto del presente protocollo è la generazione robusta e di successo di LESCs da una sospensione unicellulare di FF hPSC entro circa 3,5 settimane. Come epitelio corneale si sviluppa dalla superficie ectoderma²⁹, il primo passo del protocollo mira a sterzo hPSCs verso questo lignaggio. Un'induzione di breve 24h con trasformazione di fattore di sviluppo beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF sono utilizzati per indurre la differenziazione ectodermica, seguita da spunto di BMP-4 m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale/Reagente
1x DPBS contenente Ca2+ e Mg2+	Gibco	#14040-091
1x DPBS senza Ca2+ e Mg2+	Lonza	#17-512F/12
Piatto per coltura cellulare da 100 mm	Corning CellBIND	#3296	Formato recipiente per coltura hPSC-LESC aderente piastra di differenziazione
12 pozzetti	Corning CellBIND	#3336	Formato del recipiente di coltura per campioni IF
Piastra a 24 pozzetti	Corning CellBIND	#3337	Formato del recipiente di coltura per campioni IF
2-mercaptoetanolo	Gibco	#31350-010
Piastra a 6 pozzetti, attacco ultrabasso	Corning Costar	#3471	Formato del recipiente di coltura per induzione in sospensione coltura
Alexa Fluor 488 anti-topo Ig	ThermoFisher Scientific	#A-21202	Anticorpo secondario per IF
Alexa Fluor 488 anti-coniglio Ig	ThermoFisher Scientific	#A-21206	Anticorpo secondario per IF
Alexa Fluor 568 anti-capra	Ig ThermoFisher Scientific	#A-11057	Anticorpo secondario per IF
Alexa Fluor 568 anti-topo Ig	ThermoFisher Scientific	#A-10037	Anticorpo secondario per IF
Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF, umano)	PeproTech Inc.	#AF-100-18B	FGF-basico umano ricombinante senza animali (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fix/Permeabilizzazione Solution	BD Biosciences	#554722	Soluzione di fissazione e permeabilizzazione per citometria a flusso
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	#554723	Washing Buffer for flow cytometry
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)	PeproTech Inc.	#120-05A
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	#A8022-100G
Anticorpo citocheratina 12	Santa Cruz Biotechnology	#SC-17099	Anticorpo primario per
l'anticorpo IF Citocheratina 14	R & Sistemi D	#MAB3164	Anticorpo primario per
l'anticorpo IF Citocheratina 15	ThermoFisher Scientific	#MS-1068-P	Anticorpo primario per IF
CnT-30	CELLnTEC Advanced Cell Systems AG	#Cnt-30	Terreno di coltura per la differenziazione aderente hPSC-LESC
Collagene di tipo IV (umano)	Sigma-Aldrich#C5533		Collagene placentare umano di tipo IV
CoolCell LX Contenitore di congelamento	Sigma-Aldrich	#BCS-405
Provette CryoPure	Sarsted	#72.380	1,6 mL criotubo per crioconservazione hPSC-LESC
Inibitore della tripsina definito	Gibco	#R-007-100
Kit Essential 8 Flex Medium	Thermo Fisher Scientific	#A2858501
GlutaMAX	Gibco	#35050061
Laminina 521	Biolamina	#Ln521	Lamina umana ricombinante 521
Δ NP63&alfa; anticorpo	BioCare Medical	#4892	Anticorpo primario per IF
OCT3/4 anticorpo	R& Sistemi D	#AF1759	Anticorpo primario per l'anticorpo IF
p63&alfa;	Tecnologia di segnalazione cellulare	#ACI3066A	Anticorpo primario per IF
p63-&alfa; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)	Tecnologia di segnalazione cellulare	#56687	p63-α Anticorpo coniugato PE per citometria a flusso
Anticorpo PAX6	Sigma-Aldrich	#HPA030775	Anticorpo primario per IF
Penicillina/Streptomicina	Lonza	#17-602E
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich	#158127	Fissativo cellulare per IF
ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI	Thermo Fisher Scientific	#P36931	Mountant DAPI per hard montaggio per
Kit di crioconservazione IF PSC	Thermo Fisher Scientific	#A2644601
TrypLE Select Enzyme	Gibco	#12563-011
KnockOut Dulbecco' s Eagle modificato' s medium	Gibco	#10829018
KnockOut SR XenoFree CTS	Gibco	#10828028
MEM aminoacidi non essenziali	Gibco	#11140050
SB-505124	Sigma-Aldrich	#S4696
Triton X-100	Sigma-Aldrich	#T8787	Agente di permeabilizzazione per IF
VectaShield	Vector Laboratories	#H-1200	Mountant DAPI per montaggio di liquidi per IF
strong>Name	Company	Catalog Number	Comments
>Equipment
Cytocentrifuge, es. CellSpin II	Tharmac
Citometro a flusso, ad es. BD Accuri C6	BD Biosciences
Microscopio a fluorescenza, ad esOlympus IX 51	Olympus