Reometria forza-morsetto per la caratterizzazione di idrogel a base di proteine

Summary

Una nuova tecnica di reometria forza-morsetto è utilizzata per studiare le proprietà meccaniche di campioni di idrogel a base di proteine a basso volume legati tra un motore bobina di voce e un sensore di forza. Un sistema (PID) di proporzionale-integrale-derivato analogico consente il bloccaggio della forza con esperienza per il protocollo desiderato.

Abstract

Qui, descriviamo un metodo di reometria forza-morsetto per caratterizzare le proprietà biomeccaniche di idrogel a base di proteine. Questo metodo utilizza un sistema di (PID) proporzionale-integrale-derivato analogico di applicare protocolli di forza controllata su campioni cilindrici idrogel a base di proteine, che sono legati tra un motore lineare voice-coil e un trasduttore di forza. Durante il funzionamento, il sistema PID regola l'estensione del campione idrogel di seguire un protocollo di forza predefinita riducendo al minimo la differenza tra le forze misurate e set-point. Questo approccio unico a idrogel a base di proteine consente il tethering di idrogel estremamente basso volume campioni (< 5 µ l) con concentrazioni differenti della proteina. In protocolli di forza-rampa, dove la sollecitazione applicata aumenta e diminuisce in modo lineare con il tempo, il sistema consente lo studio dei comportamenti elasticità e isteresi connesso con la piegatura (ONU) di proteine e la misura dell'elastico standard e parametri viscoelastici. Sotto costante-forza, dove l'impulso di forza ha una forma a gradini, la risposta elastica, dovuto al cambio in vigore, è disaccoppiato dalla risposta viscoelastico, che deriva dal dominio della proteina dispiegamento e ripiegamento. Grazie al basso volume campione e versatilità nell'applicazione varie perturbazioni meccaniche, forza-morsetto reometria è ottimizzato per studiare la risposta meccanica delle proteine sotto forza utilizzando un approccio di massa.

Introduction

Oltre ad avere proprietà fisiche uniche, idrogel a base di proteine con la promessa di rivoluzionare la spettroscopia della forza, consentendo la misurazione di diverse miliardi molecole in una 'tirare', consentendo in tal modo lo studio delle proteine in ambienti affollati, simili a quelle incontrate in pelle ed altri tessuti. Domini proteici rimangano piegati all'interno di idrogeli, permettendo lo studio della loro risposta biomeccanica a forza, associazione partner e condizioni chimiche. Inoltre, la risposta biomeccanica di domini proteici all'interno di idrogeli è simile la risposta vista con tecniche di spettroscopia di forza di singola molecola. Ad esempio, denaturanti chimici e agenti ossidanti diminuiscono la stabilità dello stato piegato, a livello macroscopico^4,5 sia la singola proteina dominio livello^{1,2,3 , 6 , 7}. allo stesso modo, osmoliti aumentano la stabilità di singole proteine^8,9, che conduce ad una diminuzione nella risposta viscoelastico di idrogeli, per la stessa forza condizioni^7,10.

Diversi approcci sono stati implementati per sintetizzare idrogel a base di proteine, mediante utilizzo di interazioni fisiche^11,12 o a^4,cross-linking covalente¹³. Covalente reazioni permettono per postazioni fisse di cross-linking e questi idrogeli possono ripristinare lo stato iniziale su una rimozione delle perturbazioni meccaniche o chimiche. Un approccio di successo per cross-linking covalente si basa sulla formazione di legami covalenti carbonio-carbonio tra gli aminoacidi tirosina esposti utilizzando ammonio persolfato (APS) come un ossidante e un sale di rutenio (II) come un iniziatore (Figura 1)¹⁴. Sull'esposizione a luce bianca, una soluzione di proteine concentrate può essere trasformata in un idrogel. Controllando quando la reazione si avvia, il mix di proteine-APS può essere iniettata in qualsiasi forma di colata, come il politetrafluoroetilene (PTFE) tubi (Figura 1B e 1C), consentendo l'utilizzo di una soluzione estremamente piccolo volume¹⁵. Inoltre, l'uso della luce bianca per innescare la reazione di reticolazione si traduce in una decolorazione limitato di proteine fluorescenti e permette la formulazione di idrogeli compositi con marcatori fluorescenti (Figura 1). Altri metodi di formazione di idrogel a base di proteine utilizzano cross-linking basato sul SpyTag-SpyCatcher interazione covalente¹⁶, ammina reticolazione tramite glutaraldeide¹³o biotina-streptavidina interazioni¹⁷.

Analisi dinamico-meccanica (DMA) è attualmente una tecnica ampiamente utilizzata per studiare gli idrogel a base di polimeri^13,18. Mentre DMA possa applicare protocolli di forza costante a biomateriali, richiede moduli di Young sopra 10 kPa e campioni di grandi volumi di più di 200 µ l¹⁹. A causa di queste limitazioni, proteina idrogeli sono generalmente troppo morbidi per essere studiati da questa tecnica. Come derivati dal poliproteine sono più difficili da sintetizzare di polimeri, in quanto richiedono un sistema vivente per produrre, tali volumi elevati sono inefficienti, alle migliori^4,15. Inoltre, la maggior parte dei tessuti biologica sono più morbida di 10 kPa. Diversi approcci sono stati sviluppati per campioni biologici, soprattutto nello studio dell'elasticità muscolare^20,21. Queste tecniche funzionano anche sotto feedback per applicare la forza costante ma sono ottimizzate per campioni di piccolo diametro (nella gamma micron) esposti per forzare per tempi molto brevi (in genere meno di 1 s).

Idrogel a base di proteine con successo sono stati studiati con tecniche modificate reometria. Ad esempio, l'idrogel di colata a forma di anello consente l'utilizzo di reometria estensionale per misurare il cambiamento nella forza di esperti come una funzione di estensione^4,22. Altri approcci per studiare le proprietà reologiche di idrogel a base di proteine utilizzano sollecitazione di taglio controllata reometria. Queste tecniche possono anche raggiungere campione basso volume e tollerare materiali morbidi. Tuttavia, questi metodi mancanza la capacità di imitare il tirando le forze che causa proteina dispiegarsi in vivo, e modulo di Young viene calcolato sulla base delle teorie complesse che richiedono varie ipotesi e correzioni²³.

Recentemente abbiamo segnalato un nuovo approccio che utilizza una piccola quantità di proteine, polimerizzato all'interno di tubi con diametri < 1 mm. Nostra prima implementazione di questa tecnica era operativo in modalità di lunghezza-morsetto, dove il gel è stato esteso in seguito il protocollo desiderato¹⁵. In questo metodo, le proteine sperimentare un cambiamento continuo in vigore ed estensione mentre i domini si dispiegano, rendendo complicato l'interpretazione dei dati. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova tecnica di reometria forza-morsetto, dove un ciclo di feedback può esporre idrogeli di proteine a basso volume ad una forza predefinita protocollo⁷ (Figura 2). Un sistema analogico di PID confronta la forza misurata dal sensore di forza con il set point inviati dal computer e regola l'estensione gel spostando la bobina per ridurre al minimo la differenza tra i due ingressi. Questo bloccaggio della forza consente ora di nuovi tipi di esperimenti per misurare la biomeccanica di idrogeli di proteina.

In modalità di forza-rampa, un idrogel di proteina tethered sperimenta un costante aumento e la diminuzione della forza con il tempo. Il PID compensa eventuali deformazioni viscoelastiche cambiando l'estensione in modo non lineare, a seconda del tipo di formulazione della proteina e idrogel. Il vantaggio principale della rampa di forza è che permette la quantificazione dei parametri standard, come modulo di Young e dissipazione di energia, a causa di un dispiegamento e ripiegamento di domini proteici.

In modalità a forza costante, la forza applicata cambia in una passaggio-come la moda. In questa modalità, il gel si estende e contratti elasticamente quando la forza è aumentata o diminuita, rispettivamente, seguita da una deformazione dipendente dal tempo. Questa deformazione viscoelastica, che si svolgono mentre il gel sperimenta una forza costante, è direttamente correlata al dominio dispiegarsi/ripiegamento. In modo semplificato, questa estensione può essere visto come l'equivalente di numerose tracce di singola molecola miliardi in media insieme e misurato tutto in una volta. Forza costante protocolli utilizzabili per studiare lo scorrimento e il relax di idrogeli di proteine in funzione della forza e tempo. In funzione della forza, per proteina basata su BSA idrogeli, noi abbiamo recentemente dimostrato che esiste una relazione lineare tra l'elastico e viscoelastico estensione e ritrazione con la sforzo applicato⁷.

Qui abbiamo dettagliatamente il funzionamento di un reometro di forza-morsetto utilizzando gel composito composto da una miscela di proteine L (8 domini²⁴, raffigurato come L₈) e un costrutto di proteina L-eGFP (L-eGFP), che rende l'idrogel complessiva fluorescente e facile da dimostrare.

Protocol

1. reagenti soluzione preparazione

1. Preparare una soluzione di proteine avviamento diluendo dissoluzione/la proteina di interesse fino alla concentrazione desiderata, utilizzando un buffer di Tris [20 mM tris (idrossimetil) amminometano e 150 mM NaCl, pH 7.4].
   Nota: La minima concentrazione di proteina per che cross-linking conduce a idrogeli dipende la proteina usata ed è in genere > 1 mM.
2. Preparare scorte di ammonio persolfato (APS) (1 M) e cloruro di tris(bipyridine)ruthenium(II) ([Ru(bpy)₃]^{2 +}) soluzioni (6,67 mM) sciogliendo APS e [Ru(bpy)₃]^{2 +} polveri nel buffer di Tris.

2. a base di proteine di sintesi di idrogel

1. Difficoltà un ago di 23 G su una siringa da 1 mL con uno stantuffo premuto.
2. Tagliare un tubo di politetrafluoroetilene (PTFE) 10 cm (con un diametro interno di 0,022 in e un diametro esterno di 0,044 in) utilizzando una lama di rasoio. Fissare l'ago e la siringa ad una estremità del tubo flessibile in PTFE.
3. Inserire la seconda estremità del tubo in una soluzione di silano e riempire la provetta ritraendo lo stantuffo della siringa. Lasciare il tubo per circa 30 min.
4. Rimuovere la soluzione di silano e asciugare il tubo con aria compressa.
   Nota: Assicurarsi che tutta la soluzione di silano sia asciutto e che non lasci residui nel tubo.
5. Mescolare la soluzione della proteina con APS e [Ru (bpy) 3]^{2 +} in una provetta da 1,5 mL utilizzando un rapporto di volume costante [ad es., 15:1:1 o 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
6. Vortice la soluzione fotoattiva finché non è completamente mescolato.
7. Centrifugare il mix alla massima velocità (ad es., 14.000 x g) per rimuovere tutte le bolle dalla soluzione.
8. Inserire l'estremità aperta del tubo flessibile in PTFE trattato il composto fotoattivo e aspirare la soluzione nella provetta ritraendo lo stantuffo della siringa.
9. Posizionare il tubo caricato ~ 10 cm da una lampada a mercurio 100 W per prevenire il riscaldamento esso e tenerlo lì per fino a 30 min a temperatura ambiente (Figura 1B).
   Nota: In alcuni casi, il tempo di esposizione alla luce può essere più basso 30 s. tempi di gelificazione vengono utilizzati qui per gel fluorescente, per limitare photobleaching.
10. Rimuovere il tubo dall'ago e tagliare i bordi del tubo vicino alle estremità di idrogel con una lama di rasoio.
11. Utilizzare un ago 24 G smussata per estrudere l'idrogel nella soluzione Tris (Figura 1).
    Nota: Blunted aghi sono usati per evitare qualsiasi tacche o danni al campione di idrogel.
12. Ispezionare visivamente i gel per eventuali difetti che potrebbero formare durante l'estrusione o a causa di bolle e scartare i gel con difetti.

3. allegato a base di proteine idrogel e set-up reometro forza-Clamp

1. Avviare il programma di controllo dello strumento. Accendere il motore della bobina. Impostare la posizione della bobina su un valore verso la fine dell'intervallo (ad es., 7,5 mm).
   Nota: La posizione della bobina è consigliabile essere verso la fine dell'intervallo massimo movimento, per massimizzare l'eventuale estensione dell'idrogel.
2. Spostare i ganci nel z-senso e allinearli alla curva in x-direzione (che è la coordinata tira; Vedi Figura 2B). Registrare i valori delle viti micrometriche per la x-direzione.
3. Tagliare 2 suture sterili in fili di uguale lunghezza (2-3 cm; Vedi Figura 3A e B).
4. Un nodo sciolto double overhand in ognuno dei fili e posizionare le 2 asole sul gancio collegato al sensore di forza (Figura 3 e 3D).
5. Riempire la camera sperimentale con tampone Tris e trasferire il campione di idrogel nella camera riempita con pinzette medicale.
6. Posizionare la bobina di voce e forza ganci sensore vicino alla superficie della soluzione e allineare i ganci in tutte le direzioni utilizzando il x/y/z-manipolatori di posizionamento.
7. Utilizzando pinzette medicale, hang entrambi i lati del campione della proteina idrogel sui ganci collegati alla voce bobina e forzare il sensore (Figura 3).
8. Stringere 1 anello di sutura intorno al campione di idrogel al gancio di bobina di voce tenendo entrambe le estremità dell'ansa di sutura con pinzette medicale e li tirando contemporaneamente (Figura 3D).
9. Ripetere il punto 3.8 per il loop collegato al sensore di forza (Figura 3D).
   Nota: Evitare un serraggio estreme delle suture per prevenire eventuali danni strutturali e taglio trasversale del campione idrogel.
10. Serrare i loop di sutura sulle curve di ogni gancio per evitare qualsiasi slittamento; uso queste curve come riferimento punta a trovare la zero separazione tra i ganci al punto 3.2. Tagliare le lunghezze in eccesso delle suture utilizzando forbici mediche (Figura 3D).
11. Spostare l'idrogel allegato utilizzando z-manipolatori lungo l' z-asse verso la camera sperimentale per immergere l'idrogel nella soluzione sperimentale.
12. Allineare il campione di idrogel in y-z utilizzando i manipolatori, tale che il gel non è sotto stress.
13. Zero il sensore di forza e di separare i due ganci utilizzando x-micrometro fasi fino a quando il gel inizia a sperimentare la forza. Una volta che questo accade, ridurre leggermente la vite micrometrica in x-direzione.
14. Registrare la posizione di entrambi manipolatori per il sensore e il motore di bobina di voce e utilizzare la differenza tra questi valori e quelli misurati nel passaggio 3.2 per calcolare l'esatta separazione tra i ganci tethering all'inizio dell'esperimento.
15. Impostare l'intervallo per la curva lenta a ~1.5 - 2 mm e misurare l'allentamento di gel (Figura 4A).
    Nota: Per ogni misurazione slack, cercare di mantenere l'inizio del regime slack vicino alla posizione di bobina di voce iniziale, consentendo un numero ottimale di punti dati per adattare i 2 regimi (Figura 4A). La lunghezza del gel può essere determinata con una risoluzione di micron utilizzando la separazione tra i ganci e l'intersezione tra i 2 regimi la corda della curva (Vedi anche punto 5.1). Come il sensore di forza potrebbe deriva con il tempo a causa di variazioni nelle condizioni sperimentali, la parte della curva lenta dove il gel non è sotto forza rapporti su questa deriva possibile. Il programma di controllo dello strumento compensa automaticamente questa differenza quando si invia il comando set-point al loop PID (inserto diFigura 4A ).

4. a base di proteine idrogel caratterizzazione tramite rampa di forza controllata e misurazioni di forza costante

1. Esperimenti di forza-rampa
   1. Per eseguire un ciclo di forza-rampa aumentando la forza alla velocità di caricamento desiderato (ad es., 0,01 mN/s), input le forze iniziale e finale e la durata del protocollo come una "V" capovolta. Quindi, tenere il gel a 0 mN (o bassa forza) per s > 200 consentire i domini della proteina da ripiegare e l'elasticità del gel per recuperare.
   2. Salvare la traccia.
2. Esperimenti di forza costante
   1. Eseguire un protocollo di forza costante applicando una forza bassa (per esempio, 0.1 mN) per 30 s e quindi aumentare la forza di una forza costante (ad es., 1 mN) per un periodo definito di tempo (ad es., 120 s), seguita da tempra la forza torna allo stesso basso valore (per esempio, 0.1 mN) per s > 300 consentire i domini della proteina da ripiegare e l'elasticità del gel per recuperare.
   2. Seguendo il primo impulso, regolare le impostazioni di PID per massimizzare il tempo di risposta del feedback loop (vedere Figura 2D).
      Nota: Per i gel rigidi e per piccole variazioni della forza, il tempo di risposta del ciclo è limitato l'elettronica del sensore di forza e il tempo di risposta della bobina e può essere basso come 5 ms⁷. Per grandi cambiamenti nella forza e più morbido gel, il tempo di risposta è dettato dall'elasticità di idrogeli (Figura 2D).
   3. Salvare la traccia.

5. analisi dei dati

1. Che utilizzano la separazione misurata tra i ganci e la posizione calcolata bobina, quando il gel inizia a sperimentare la forza (Δx nell'inserto Figura 4A ), calcolare la lunghezza di gel L usando l'equazione:
   L = L₀ + ∆
   Qui, L₀ è la separazione tra i ganci, misurato dalla posizione delle viti micrometriche prima dell'esperimento (passo 3.14).
   Nota: Per gel con concentrazioni di proteina bassa che non si traducono in una completa reticolazione, la lunghezza misurata cambierà da traccia a traccia. Inoltre, per lunghi periodi di tempo, proteine all'interno di idrogeli potrebbero verificarsi effetti di invecchiamento²⁵, che provocano un allungamento complessivo del gel.
2. Normalizzare l'estensione misurata alla lunghezza di gel per ottenere il ceppo.
3. Normalizzare la forza misurata alla superficie trasversale utilizzando il diametro interno del tubo usato per la polimerizzazione.

Results

Figura 1A Mostra lo schema della reazione fotoattivo utilizzato per sintetizzare l'idrogel di₈ L-EGP/L. Figura 1B Mostra la miscela di idrogel in tubo flessibile in PTFE, prima e dopo la fotoattivazione. Figura 1 presenta l'idrogel di₈ L-eGFP-L estruso all'interno di una soluzione di Tris. Il campione di idrogel non ha nessun difetti strutturali come tacche. Idrogel con danni ch...

Discussion

Qui, descriviamo una tecnica di reometria forza-morsetto per studiare la risposta biomeccanica di idrogeli di base di proteine di basso volume. Inoltre, è disponibile un protocollo di sintetizzare un campione di idrogel di proteina di basso volume cilindrico uniforme. Un protocollo è anche presentato che descrive come legare diversi tipi di idrogel a base di proteine con varie elasticità senza causare qualsiasi deformazione meccanica o danni ai campioni di idrogel a base di proteine o slittamento del gel sui ganci. Il si...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SI-KG4A trasduttore di forza	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
motori	bobina mobile lineare	LFA2010
Albumina sierica bovina	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris (bipiridina) rutenio (II) cloruro	Sigma-Aldrich	544981-1G
FORNITURE MEDICHE ESPRESSE 6-0 SUTURA IN NYLON 12/PK	Fisher Scientific NC0395626
Solo siringa da 1 ml, punta Luer-Lok	BD	309628
silano, Sigmacote	Tubo in PTFE Microbore Sigma-Aldrich	SL2-25ML
, 0,022 "ID x 0,042" OD, 100 piedi/rotolo	Cole-Parmer	EW-06417-21
Ago ipodermico, 23 gauge	Healthcare Supply Pro	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Punte per l'erogazione - 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Lampada al mercurio ad arco corto	ALB	USH-103D USHIO
Pinzette
Forbici
Olympus
Il codice informatico e la progettazione CAD delle parti personalizzate possono essere messi a disposizione su richiesta dell'autore corrispondente.