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Articolo metodologico

Potenziamento dell'efficacia dell'anticorpo antitumorale di farmaci antineoplastici: rilevazione dell'anticorpo-farmaco sinergismo usando l'equazione di indice di combinazione

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DOI:

10.3791/58291

⸱

19 gennaio 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come valutare il sinergismo fra un anticorpo antitumorale e farmaci antineoplastici in modelli preclinici utilizzando l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay.

Abstract

Potenziamento di ostili gli anticorpi monoclonali (mAb) dagli agenti chemioterapeutici costituisce una strategia importante per la progettazione di una terapia efficace e più sicura contro il cancro. Qui forniamo un protocollo per identificare una combinazione razionale nella fase preclinica. In primo luogo, descriviamo un test per valutare il sinergismo tra mAb anticancro e farmaci citotossici, che utilizza l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay1cella. Questo include la misurazione della sensibilità del tumore delle cellule farmaco - e anticorpo-usando un'analisi MTT, seguita da un'analisi di computer automatici per calcolare i valori di indice (CI) di combinazione. CI valori di < 1 indicare sinergismo tra testata mAbs e agenti citotossici1. Per corroborare l'in vitro risultati in vivo, ulteriormente Descriviamo un metodo per valutare l'efficacia del regime di combinazione in un modello di xenotrapianto del tumore. In questo modello, il regime combinato ritarda significativamente la crescita del tumore, che si traduce in un significativo di sopravvivenza esteso rispetto ai comandi del singolo-agente. D'importanza, la sperimentazione in vivo rivela che il regime di combinazione è ben tollerato. Questo protocollo permette la valutazione efficace di combinazioni di farmaci anticancro in modelli preclinici e l'identificazione della combinazione razionale per valutare in studi clinici.

Introduzione

L'approccio convenzionale nel trattamento di un gran numero di diversi tipi di cancro si basava sul monotherapy. Anche se è ancora usato in molti casi, questo metodo ha incontrato diversi ostacoli che conduce a optare per terapie combinate2. In particolare, le cellule tumorali sono più suscettibili a sviluppare resistenza quando trattati con un farmaco singolo inducendo sopravvivenza alternativo meccanismi3, con conseguente fallimento terapeutico in pazienti4. Inoltre, in monoterapia, farmaci sono solitamente somministrati a dosi elevate. Questa situazione spesso provoca il verificarsi di forti effetti collaterali dose-dipendente che può essere intollerabile e imporre ai medici di interrompere il trattamento2. Per questi motivi, l'associazione di molecole antitumorali è ora preferito alla monoterapia.

Combinazioni di farmaci ideale sarebbero quelli che agiscono in sinergia contro le cellule del tumore, senza tossicità aumentata contro le cellule normali. Sinergismo si riferisce all'interazione di due o più farmaci che produce un effetto terapeutico maggiore della somma di ogni singola sostanza operano separatamente. Tali interazioni possono provocare una maggiore efficacia terapeutica clinica2. Limita la resistenza al trattamento, aumenta l'efficacia e può anche ridurre la tossicità2. Infatti, il dosaggio di ogni farmaco può essere ridotto per abbassare i loro effetti collaterali mirando alle vie differenti. Inoltre, una delle molecole può anche servire come un agente di sensibilizzazione contro le cellule tumorali. L'effetto del farmaco secondo può essere migliorata sulle cellule sensibilizzate e dosaggi meno possono essere usato5.

Terapia combinata può includere due o più farmaci chemioterapici e/o prodotti biologici, come gli anticorpi monoclonali6. Questi anticorpi monoclonali specificamente le cellule che esprimono un antigene di superficie delle cellule di interesse e sono in grado di uccidere le cellule tumorali attraverso vie immunologiche compreso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC), con il coinvolgimento di cellule immunitarie effettrici 7e citotossicità complemento-dipendente (CDC)6. Essi possono anche agire tramite un meccanismo non immunologico mediato da apoptosi8,9,10,11. In questo caso, l'induzione del processo di morte programmata delle cellule può sensibilizzare le cellule tumorali, indebolire la loro funzione e rendere più efficace il farmaco chemioterapico associato ad un dosaggio più basso. Come tale, proapoptotic mAb sono buoni candidati per la progettazione di regimi di combinazione con farmaci antineoplastici.

Sono stati descritti diversi modelli matematici per valutare il sinergismo della droga; uno di loro si basa sulla combinazione indice metodo1. Questo metodo si basa sul principio di effetto mediano sviluppato da Chou1. L'effetto mediano equazione correla la dose di farmaco e l'effetto della droga come segue.

figure-introduction-1

Qui, D è la dose di droga; DM è la dose mediana-effetto; Fa è la frazione influenzata dalla dose; m è un esponente che indica la forma della dose-effetto trama1. La dose mediana-effetto viene utilizzata per calcolare la dose Dx di un farmaco che inibisce o uccide "x" per cento delle cellule. Il valore CI viene quindi calcolato per valutare l'effetto additivo della combinazione del farmaco, come segue1.

figure-introduction-2

CI il valore 1 indica un effetto additivo e un valore di CI di < 1 indica un effetto sinergico, mentre un valore di CI di > 1 indica antagonismo1. L'applicazione di questo metodo è ulteriormente facilitato dalla disponibilità di un programma per computer, CompuSyn, che determina sinergismo ed antagonismo a tutte le dosi o livelli di effetto simulato automaticamente12.

Il nostro gruppo ha sviluppato la specifica di 8B6 mAb per O-acetile-GD2 ganglioside (OAcGD2) di neuroblastoma antigene13 e ulteriormente dimostrato che questa mAb è in grado di indurre la morte delle cellule con gli attributi di apoptosi11. Per verificare se mAb 8B6 può sensibilizzare le cellule di neuroblastoma per il topotecan agente antineoplastico, abbiamo adattato il suddetto metodo sviluppato da Chou1. In primo luogo, determiniamo i valori (ED50) 50 di dose efficace di mAb 8B6 e topotecan. Successivamente, le cellule di neuroblastoma con rapporti di uguale potenza dei due composti in base ai valori di50 ED esposte per determinare i valori di CI utilizzando il software di simulazione di cui sopra. Questo metodo permette di dimostrare il sinergismo fra mAb 8B6 e topotecan in vitro. Successivamente, descriviamo un protocollo per valutare ulteriormente la potenza e la sicurezza di questa combinazione regime in vivo. Questo protocollo può essere facilmente applicato per selezionare mAb anticancro potente e sicuro e combinazioni dell'agente chemioterapeutico negli studi preclinici. Una rappresentazione schematica di questo studio è fornita nella Figura 1.

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Protocollo

Stabulazione e procedura sperimentale sono stati approvati dal governo francese (accordi #C44-278 e #APAFIS 03479.01). Procedure e cura degli animali sono state condotte sotto la direttiva UE 2010/63/UE e legge francese #2013-118 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. valutazione dell'interazione tra il farmaco mAb 8B6 e Topotecan In Vitro

  1. preparazione del campione di 96 pozzetti
    Attenzione: Consultare il Comitato di salute e sicurezza dell'istituzione e seguire le regole di regolazione locale legate alla sicurezza in laboratorio. Rivedere le informazioni materiale e foglio di dati di sicurezza prima di lavorare con qualsiasi media, linee cellulari o reagenti. Usare una tecnica sterile corretta e lavorare in una cappa a flusso laminare. Tutte le soluzioni/apparecchiature che vengono utilizzate per manipolare le cellule devono essere sterili.
    Nota: Il seguente protocollo è stato progettato per l'utilizzo con celle aderenti. Le modifiche sono tenute ad applicare il metodo alle cellule nonadherent crescono in sospensione; Questo protocollo utilizza quattro esemplari per ogni condizione sperimentale.
    1. Crescere le cellule IMR5 in una boccetta di T75.
    2. Il primo giorno (giorno 0), osservare la cultura delle cellule al microscopio per verificare il confluency di cella. Aspirare il medium delle cellule dalla beuta, lavarlo con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 3 mL di 0.05% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) / soluzione PBS. Restituire il pallone nell'incubatore per 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Esaminare la coltura delle cellule al microscopio per distacco cellulare.
      Nota: Se necessario, è possibile restituire il pallone nell'incubatore per altri 3-5 min, a seconda del tipo di cellula del tumore.
    4. Aggiungere 10 mL di medium cellulare completo al pallone e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile 15 mL. Centrifugare le cellule per 5 min a 300 x g. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
    5. Rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita completa. Regolare il volume medio per ottenere una concentrazione finale di 1 x 105 cellule/mL.
    6. Pozzetti di seme 84 di una piastra 96 pozzetti cultura con 10 celle4 ciascuno, che è di 100 µ l di sospensione cellulare. Seguono la disposizione sperimentale illustrata nella Figura 2.
    7. Incubare le cellule per 18 h nell'incubatrice delle cellule (37 ° C, 5% CO2).
  2. Preparazione soluzione della droga
    Nota: Per gli studi di sensibilizzazione droga/mAb, modificare la tempistica, la lunghezza e il trattamento di concentrazione per soddisfare il particolare droga/mAb in questione. Si noti che la concentrazione iniziale è 3 volte la concentrazione finale.
    1. La mattina successiva (giorno 1), preparare le seguenti soluzioni di droga utilizzando il mezzo di sviluppo completo.
      1. preparazione soluzione mAb
        1. Diluire il mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di anticorpo funzionante con una concentrazione di mAb di 240 µ g/mL.
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
      2. Preparazione soluzione topotecan
        1. Diluito, come sopra, la droga in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di lavoro di droga con una concentrazione finale di 120 nM.
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
      3. Preparazione di soluzione di anticorpo e droga
        1. Diluire le soluzioni farmacologiche e mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione a 120 nM droga e mAb 240 µ g/mL (soluzione di lavoro).
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
    2. Per raggiungere la concentrazione finale, trasferire 50 µ l di ogni soluzione della droga nei pozzetti corrispondenti, come indicato nel layout sperimentale ( Figura 2).
      Nota: Trasferire 50 µ l di terreno di crescita completa nei pozzetti delle cellule non trattate, come indicato nella Figura 2.
    3. Incubare le cellule per 72 h in incubatrice (37 ° C, 5% CO2).
  3. Analisi di MTT
    1. Aggiungere 10 µ l di soluzione di reagente MTT in ciascun pozzetto.
    2. Incubare a 37 ° C per 4 ore.
    3. Aggiungere 100 µ l di soluzione di lisi (10% SDS in 0,01 M HCl) in ciascun pozzetto, usando una pipetta multicanale e mescolare accuratamente pipettando.
    4. Incubare a 37 ° C per 4 ore in una camera umidificata (95% di umidità).
    5. Leggere l'assorbanza a 570 nm (un570) e 620 nm (A620) utilizzando uno spettrofotometro.
      Nota: Mescolare ogni campione ancora pipettando prima di leggere l'assorbanza; assorbanza a 620 nm permette la correzione dei valori di fondo non specifici.
    6. Calcolare l'assorbanza corretta: rettificato assorbanza = un570- A620.
    7. Calcolare l'attuabilità delle cellule come segue: vitalità cellulare = 100 x (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).
    8. Calcolare i valori di frazione-commovente (Fa) utilizzando la seguente equazione: 1 - (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).
  4. Software di simulazione analitica di interazione di droga per il singolo e gli studi di combinazione di droga
    1. Eseguire il software di simulazione per aprire la finestra di avvio.
    2. Fare clic sul pulsante Nuovo esperimento per aprire la finestra principale .
    3. Digitare il nome dell'esperimento nella finestra nome .
      Nota: Può essere aggiunta una data nella finestra della Data .
    4. Fare clic sul pulsante Nuovo farmaco singolo .
    5. Digitare il nome nella finestra del Nome completo .
    6. Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .
    7. Digitare l'unità di concentrazione del farmaco nella finestra unità .
    8. Immettere i dati punto 1 Dose e valore Fa, premere invio.
    9. Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.
    10. Fare clic sul pulsante finito .
    11. Seguire la stessa procedura per inserire punti dati mAb.
      Nota: Utilizzare la stessa unità di concentrazione come viene utilizzato da droga.
    12. Fare clic sul pulsante Nuova droga Combo .
    13. Selezionare il farmaco e mAb.
    14. Selezionare Rapporto costante e fare clic su OK.
    15. Digitare il nome nella finestra del Nome completo .
    16. Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .
    17. Digitare il rapporto droga/mAb nella finestra del rapporto .
    18. Immettere i dati punto 1 Dose e premere invio.
      Nota: È possibile che il programma calcolerà automaticamente le dosi di mAb e Combo.
    19. Immettere il valore di Dati punto 1 Fa e premere invio.
    20. Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.
    21. Fare clic sul pulsante finito e, quindi, fare clic sul pulsante Genera Report .
    22. Selezionare il farmaco e mAb e, quindi, fare clic su OK.
    23. Selezionare Combo e, quindi, fare clic su OK.
    24. Selezionare intestazione, CI tabellae tabella riassuntiva. Quindi, fare clic su OK.
    25. Digitare il nome file del file di analisi e fare clic su Salva per generare il report.
      Nota: Dopo aver cliccato OK, la relazione aprirà automaticamente nel web browser predefinito del computer.
    26. Per stampare il report, scegliere stampa dal menu file del browser web. Il report contiene una sezione di tabella di riepilogo che include titolo, data, nome file, descrizione nota, parametri (m, Dm e r), ED50 per qualsiasi agente usato in monoterapia o in combinazione e la tabella di CI per ogni combinazione a ED50, ED 75, ED90e95di ED.
      Nota: Un valore di CI di < 1 indica sinergismo, CI valore = 1 indica additività e un valore di CI di > 1 indica antagonismo.

2. generazione di xenotrapianti di Neuroblastoma umano nei topi di Scid Gamma NOD diabetici Nonobese (topi NSG)

Nota: Escludere qualsiasi contaminazione della coltura delle cellule. Poiché la matrice della membrana basale forma un gel sopra i 5 ° C, tutti i cultureware o media entrano in contatto con il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere prechilled e ghiaccio-freddo. Tenere la matrice della membrana basale sul ghiaccio durante l'intero processo.

  1. Preparazione della sospensione delle cellule IMR5
    1. Scongelare il reagente di matrice della membrana dello scantinato durante la notte immergendo il flaconcino nel ghiaccio in un frigorifero a 4 ° C prima dell'uso.
    2. Il giorno 0, vendemmia IMR5 cellule coltivate come dettagliato sopra.
    3. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
    4. Scartare il surnatante. Lavare le cellule 2 x con 15 mL di PBS ghiacciata e preparare una sospensione di cellule di 5 x 107 cellule/mL in PBS ghiacciata.
      Nota: Se necessario, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    5. Agitare il flaconcino di matrice della membrana dello scantinato.
      Nota: Il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere scongelato e dispersi.
    6. Aggiungere un volume di reagente di matrice della membrana dello scantinato e mescolare pipettando per ottenere una sospensione di cellule di 2,5 x 107 cellule/ml.
    7. Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.
  2. Preparazione dei topi
    Nota: I topi dovrebbero essere sei o sette settimane.
    1. Mantenere i topi in una condizione da organismi patogeni specifico.
    2. Consentire un periodo di acclimatazione di tre - cinque giorni dopo sono arrivati i topi.
    3. Il giorno dell'inoculazione, radere il fianco dove sarà l'iniezione (vedere il punto 2.3.6).
  3. Preparazione dell'iniezione delle cellule del tumore
    Nota: Tenere la sospensione di cellule di matrice ghiacciata della membrana dello scantinato asettica durante tutta la procedura.
    1. Mescolare le cellule e disegnare accuratamente la sospensione cellulare in una siringa da 1 mL montata con un ago 21G.
    2. Controllare per essere sicuri che non ci sono bolle d'aria nella siringa.
    3. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    4. Premere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita, al sito di iniezione.
    5. Inserire l'ago esattamente la piega di pelle. Non posizionare l'ago profondità nel tessuto per garantire un'iniezione sottocutanea.
    6. Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di sospensione cellulare IMR5 (cioè, 2.5 x 106 cellule) nel fianco destro inferiore dei topi.
    7. Ruotare la siringa per evitare perdite e ritirare l'ago.
  4. Monitoraggio delle variazioni di peso corporeo e la crescita del tumore
    1. Misurare la lunghezza (A) e la larghezza (B) del tumore con una pinza.
    2. Calcolare il volume del tumore usando la formula (A x B2) x 0,5.
    3. Iniziare la terapia quando i tumori hanno raggiunto un volume medio di ~ 50-60 mm3.

3. droga e amministrazione dell'anticorpo in topi

  1. Somministrazione endovenosa di mAb 8B6
    1. Attentamente e riempire una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G con soluzione di mAb.
    2. Posizionare il mouse sotto una lampada di calore per 10 min a dilatare la vena della coda.
    3. Trattenere il mouse in un dispositivo di ritenuta del roditore.
    4. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    5. Inserire l'ago parallelo alla vena della coda, penetrante 2-4 mm nel lumen, mantenendo la smussatura del viso dell'ago verso l'alto (Figura 3A).
    6. Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo per via endovenosa (i.v.).
    7. Quando è terminata l'iniezione, pressione delicatamente il sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.
  2. Somministrazione intraperitoneale di topotecan
    1. Aspirare la soluzione di droga in una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G.
    2. Tenere premuto il mouse in posizione supina, con la sua estremità posteriore leggermente rialzata.
    3. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    4. Individuare la linea mediana del mouse addome e mentalmente divide l'addome in quadranti. Individuare il sito di iniezione nel quadrante inferiore destro o sinistro (Figura 3B).
    5. Inserire l'ago nell'addome (5 mm di profondità) ad angolo di ~ 10°, nel quadrante inferiore destro o sinistro.
    6. Iniettare 100 µ l di soluzione di droga per via intraperitoneale (i.p.).
    7. Disinfettare il sito di inoculazione.

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Risultati

I risultati rappresentativi e le figure sono adattati con il permesso dal precedente lavoro pubblicato14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 migliora sinergico effetti inibitori di Topotecan, sulla crescita linea cellulare di Neuroblastoma:

Per stabilire la droga e le concentrazioni di anticorpi da utilizzare per la valutazione del sinergismo ...

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Discussione

Per prevedere l'effetto di interazione farmacologica, tre metodi possono essere utilizzati: la metodologia di isobologram17, la miscela non lineare modello18e la combinazione di indice1. Analisi dell'indice di combinazione sono il più comunemente usato perché la sua applicazione è semplificata dalla disponibilità di un programma per computer facile da usare. Per questo scopo, abbiamo caratterizzato in primo luogo la risposta dose-effetto di ogni agen...

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Dichiarazioni

S.Fa., J.F. e S.B. sono indicati come inventori di in attesa di brevetti che coprono l'applicazione clinica degli anticorpi terapeutici anti-O-acetil-GD2.

Ringraziamenti

Concedere il sostegno: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e comité de Vendée, une rosa versare S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les I cancri et les leucémies de l'enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. e J.F. sono supportati da La Ligue Contre Le Cancer. Gli autori ringraziano l'UTE-impianto della struttura Fédérative de Recherche François Bonamy. Gli autori ringraziano anche Dr. S. Suzin (Inserm, Parigi) per fornire le cellule IMR5 e Sig. ra H. Estéphan per la sua assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per la proliferazione cellulare (MTT)Roche11-465-007-001
Software CompuSynComboSynCombosyn può essere scaricato gratuitamente all'indirizzo http://www.combosyn.com
Rasoio elettricoBiosebBIO-1556
Siero fetale per vitelloEurobioCVFSVFF00-01Siero fetale per vitello inattivato al 10% in RPMI 1640
Firefox Mozilla CorporationFirefox può essere scaricato gratuitamente all'indirizzo http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lampVerre& Quarzo4003/1R
Linea cellulare di neuroblastoma umano IMR-5Accegen BiotechnologyABC-TC0450IMR-5 è un clone della linea cellulare di neuroblastoma umano IMR32 5459762. Le cellule IMR-5 sono state generosamente fornite dal Dr. Santos Susin (U.872, Parigi, Francia)
L-glutamminaGibco25030-0242 mM in soluzione di lisi RPMI 1640
Roche 11-465-007-001
mAb 8B6Università di NantesN/A
MatrigelCorning354248
Multiskan FCThermofischer Scientific N08625
Ago 21G 1 ½  BD Microlance304432
Ago 25G 1TerumoNN-2525R
NSG topiCharles River Laboratories5557
Nunc MicroWell 96 pozzetti micropiastreThermofisher167008
PBSVWRL182-10
PBS, 0,05% EDTASigma-AldrichE9884
PC che funziona Windows 7MicrosoftWindows 7 può essere acquistato presso http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122100 unità/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina in RPMI 1640
Serbatoio di reagentiThermofischer Scientific8094
Dispositivo di ritenuta per roditoriBiosebTV-150-SM
RPMI 1640Gibco31870-025
Siringa 1 mLHenke Sass Wolf5010.200V0
TopotecanSigma-AldrichT2705

Riferimenti

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