Cellule staminali pluripotenti indotte generazione umana primordiale delle cellule di germe-come delle cellule sulla superficie dei corpi Embryoid da pluripotenza innescato

Cellule germinali primordiali (PGC) sono precursori comuni di tutte le cellule germinali in entrambi i sessi. La maggior parte delle nostre conoscenze sullo sviluppo di PGC in embrioni di mammiferi è stata ottenuta attraverso lo studio di laboratorio topi^1,2. Al giorno embrionale 6.0-6.5 di embrioni di topo, 6 o simile a un piccolo numero di precursori PGC si trova nell'epiblasto e una popolazione di fondatore di ~ 40 che PGC sono indotte da loro in un modo dipenda delle bone morphogenetic proteins Bmp2 e Bmp4 secernuto da adiacente cellule. I primi PGC umano finora identificati negli embrioni erano sulla parete endodermica del sacco vitellino alle intorno alla fine della terza settimana di gestazione³. Perché questo è lo stesso posto come PGC migrazione sono stati osservati in embrioni di topo, è probabile che il PGC umani osservati erano nel percorso della migrazione, ma non la popolazione fondatore. Tuttavia, gli studi di ripercorrere le fasi precedenti di PGC o PGC precursori in embrioni umani sono scomparsi.

Accesso al PGC embrionale umano è difficile a causa di ostacoli sia tecnici che etici. Per superare questi ostacoli, modelli di coltura cellulare di PGC-come sono stati recentemente generati da cellule staminali pluripotenti umane (PSC). Pluripotenza è la capacità cellulare di differenziare nella linea germinale e tre strati germinativi embrionali⁴. Considerando che il PSC umano mantenuti nel medio mTeSR1 (un mezzo ready-to-use, commercialmente disponibile formulato per la manutenzione degli sportelli unici umani nello stato innescato pluripotenza) su piatti rivestiti con la proteina della matrice extracellulare hanno innescato-stato pluripotenza ⁴, nel 2013 il laboratorio di Jacob Hanna ha mostrato che le cellule di pluripotenza innescata possono essere convertite in uno stato di pluripotenza ingenuo esponendo al medium di cellule staminali umane ingenuo (NHSM) contenente inibitori chimici di protein chinasi ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, e p38 MAPK, nonché fattori di crescita LIF, TGF, bFGF⁵. Da sportelli unici umano ingenuo-pluripotenza, nel 2015 un gruppo di ricerca guidato da Hanna e Azim Surani compiuta la prima produzione robusta delle cellule umane PGC-Like (hPGCLCs) da sportelli unici⁶. Diversi altri laboratori, compreso il nostro, riferì più tardi, generazione di hPGCLCs da sportelli unici utilizzando protocolli leggermente diverso^7,8,9,10. Il nostro studio ha fornito prova che hPGCLCs generato utilizzando protocolli diversi (che sono riassunti nella tabella S1 del nostro studio precedentemente pubblicato¹⁰) sono transcriptomally simili a vicenda¹⁰. Disponibile prova sostiene la somiglianza di PGCLCs umana alla fase iniziale PGC embrionale umano prima della cancellazione epigenetici globale⁷ e/o migrazione chemiotattica¹⁰.

Studi di mouse PGC embrionali del mouse PGCLCs e PGCLCs umano (ma solo con un accesso molto limitato a umano PGC) hanno rivelato che meccanismi molecolari della specifica di PGC differiscono significativamente tra mouse e umano^{1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17}. Ad esempio, Prdm14 gioca ruoli critici nella specifica di PGC in embrioni di topo, ma proprio ruolo nella specifica di PGC umana sembra limitato^1,15. Al contrario, induzione di SOX17 di EOMESODERMIN è essenziale per PGC specifica^6,11,14, considerando che questi fattori di trascrizione sembrano superflui per mouse PGC specifica¹⁵. Questi risultati iniziali degli studi usando hPGCLCs fortemente sostengono l'importanza di questo modello della coltura cellulare come un surrogato di PGC embrionale umano.

Studi recentemente pubblicati, che coinvolgono valutazione sequenziamento profondo del nostro laboratorio di analisi numero genomic del DNA copia, hanno dimostrato che il mantenimento prolungato degli sportelli unici nello stato di pluripotenza ingenuo aumenta significativamente il rischio di instabilità cromosomica e anomalie strutturali. Questo fenomeno è stato osservato sia con mouse¹⁸ umana¹⁹ sportelli unici. Il protocollo originale di produzione hPGCLC segnalato da Hanna/Surani è stato sviluppato per sportelli unici umani mantenuti nel mezzo di pluripotenza 4i ingenuo per almeno 2 settimane⁶. Per preservare il cariotipo diploide normale umano sportelli unici e PGCLCs, abbiamo sviluppato un protocollo modificato in cui sportelli unici umani sono esposte al mezzo di 4i per solo 72 ore¹⁰, che viene presentato in questo articolo. IPSCs umane (hiPSCs) sono mantenuti sotto lo stato di pluripotenza innescata. Immediatamente prima della formazione di EB, le cellule vengono incubate a 4i naïve riprogrammante medio (un mezzo NHSM modificato) per 48 ore. Cellule sono poi dissociate e confezionate nei micropozzetti a modulo EBs per altre 24 ore nel medium 4i. EBs sono mantenute in medium di induzione di hPGCLC contenente un'alta concentrazione di BMP4 umana ricombinante in una condizione di dondolo per cultura no-collegamento per fino a 8 giorni per ottenere la massima resa di hPGCLCs. Dopo coltura EB 8 giorni, hPGCLCs può essere isolato dalle cellule dissociate di EB da FACS come cellule CD38 + con ~ 40% di resa in FACS-ordinabile sospensione unicellulare. Considerando che altro pubblicato metodi^7,8,9, compreso il protocollo originale prima di nostre modifiche⁶, generare in genere hPGCLCs in aggregati cellulari spontaneamente formate senza specifica localizzazione, hPGCLC prodotta dal nostro protocollo si osservano sulla superficie dei corpi embryoid (EBs).

1. cella cultura di hiPSCs nello stato di pluripotenza Primed

1. Preparazione di piatti rivestite con proteine della matrice extracellulare
   1. Scongelare il Matrigel (proteina della matrice extracellulare) sul ghiaccio in un frigorifero o una stanza fredda durante la notte (non scongelare a temperatura ambiente o usando un bagno di acqua calda). Proteina della matrice aliquota (~ 200 μL; il volume di una parte aliquota è determinato dal produttore per ogni batch e indicato sull'etichetta del flaconcino) in provette sterili basso-bind o tubi di crioconservazione delle cellule sul ghiaccio. È importante mantenere la proteina della matrice extracellulare ghiacciata durante l'erogazione per evitare la solidificazione. Conservare le aliquote a-80 ° C.
   2. Per ricoprire i piatti di plastica cultura cellulare con la proteina della matrice extracellulare, diluire una aliquota con 25ml ghiacciata DMEM/F12 e diffusione a tre piatti di 10 cm (~ 8 mL/piatto). Incubare piatti a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Dopo il rivestimento, piatti possono essere sigillati con Parafilm e conservato a temperatura ambiente fino a una settimana.
   3. Aspirare il mezzo da piatti immediatamente prima dell'inoculazione di pluripotenza innescato hiPSCs. Non è necessario lavare i piatti rivestiti con medie o privo di calcio e magnesio tampone fosfato salino [PBS(-)].
2. Iniziazione di hiPSC cultura dello stato di pluripotenza innescato
   1. Aggiungere 10 mL di terreno di mTeSR1 in una provetta da centrifuga 15 mL 2 µ l di 50mm Y27632 [inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK)]. Preparare due provette di inibitore-completato 10 mL liquido di ROCK per avviare la coltura delle cellule in un piatto di 10 cm da 1 mL congelati cellula stock. Utilizzare medium Y27632-completato il giorno stesso. Preriscaldare la medium Y27632-completato in bagnomaria a 37 ° C per 5 min.
      Nota: Questo protocollo funziona bene con hiPSCs mantenuto in mTeSR1. Quando hiPSCs sono mantenuti in altri media sostenendo la crescita umana di PSC con diversi gradi di innescato o ingenuo pluripotenza, resa di hPGCLCs significativamente può variare.
      Nota: La shelf life del mTeSR1 completo è 2 settimane a 4 ° C e 6 mesi a-20 ° C, ma ri-congelamento cause scarse prestazioni. Congeliamo le aliquote di 40 mL di mTeSR1 a-20 ° C fino all'utilizzo.
   2. Scongelare una fiala di pluripotenza innescato hiPSC congelati stock (1.0-3.0 x 10⁶ cellule in 1 mL di terreno di crioconservazione) usando un bagno di acqua di 37 ° C. Subito dopo completamento di scongelamento, trasferire l'intero contenuto di una fiala in una provetta (10 mL) di preriscaldati medium Y27632-completato.
   3. Sospensione cellulare centrifuga a temperatura ambiente, 300 x g per 8 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 10 mL preriscaldata Y27632-completati dall'altro tubo.
   4. Distribuire uniformemente sospensione cellulare in un piatto di 10 cm rivestite con proteine della matrice extracellulare. Mettere il piatto in un incubatore a CO₂ tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Mantenere la cultura hiPSC sotto una pressione di ossigeno basso.
   5. Mezzo di cambiamento (mTeSR1 senza Y27632) ogni giorno. L'inibitore di roccia (Y27632) è critico per la sopravvivenza di hiPSC subito dopo dissociazione di singole cellule. Una volta che hiPSCs aderire sulla superficie rivestita con proteine della matrice extracellulare come uniformemente distribuiti piccoli aggregati con > confluency di 10% (che viene normalmente completato entro 16 ore dopo l'inoculazione), Y27632 è superflua. Cambiamento medio troppo presto dopo l'inoculazione di dissociata hiPSCs senza Y27632 può causare la morte delle cellule quasi completa.
3. Passaging innescato pluripotenza hiPSCs
   Nota: Passaggio innescato pluripotenza hiPSCs quando colonie occupano ~ 80% della superficie effettiva crescita. Densità e corrette procedure di passaggio è importante per la riproducibilità sperimentale. Abbiamo visto che l'efficienza dell'induzione di hPGCLC non è significativamente differente tra culture hiPSC 6 giorni dopo l'inizio da uno stock congelato (che coinvolgono uno o due passaggi) o un mese (che coinvolgono > 10 passaggi). Induzione di hPGCLC è stato effettuato con successo da hiPSCs mantenuto per oltre due mesi, anche se l'efficienza non è stato valutato quantitativamente.
   1. Prendere 4 mL di miscela di enzimi di dissociazione delle cellule in una provetta da 15 mL centrifuga ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Preriscaldare la mL 10 PBS(-) in una centrifuga 15 mL tubo per > 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
   3. Aggiungere 2 µ l di 50 mM Y27632 (inibitore di roccia) per mezzo di mTeSR1 da 10 mL in una provetta da centrifuga 15 mL. Preparare due provette del mezzo ROCK inibitore-completato 10 mL e utilizzare nello stesso giorno. In un'altra provetta per centrifuga 15 mL, prendere 5 mL mTeSR1 senza aggiunta di Y27632. Preriscaldare la media + /-Y27632 in bagnomaria a 37 ° C per 5 min.
      Nota: Tutte le aliquote medie preparate al punto 1.3.3 possono contenere Y27632.
   4. Aspirare il vecchio mezzo da un cellule di 10 cm piatto e sciacquare una volta con preriscaldati 10 mL PBS(-). Eliminare PBS(-) e aggiungere 4 mL di enzima di dissociazione al piatto. Mettere il recipiente in un incubatore a CO₂ (incubatore tri-gas funziona, ma non necessario) per ~ 4 min fino a staccano le cellule dal fondo. Cellule di dispensare delicatamente su e giù per rendere sospensione unicellulare.
   5. Trasferire hiPSC cella singola sospensione nella provetta preriscaldata contenente 5 mL di terreno senza Y27632 (volume totale in un tubo di 15 mL è di circa 9 mL). Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente, 300 x g per 8 min.
   6. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 10 mL di terreno medio preriscaldato contenente Y27632.
   7. Rimuovere aggregati cellulari utilizzando un colino di cella da 40 µm e determinare la densità delle cellule usando un contatore Coulter.
   8. Diluire la sospensione cellulare con preriscaldati medium Y27632-completato per raggiungere 3.0 x 10⁶ cellule in 10 mL per inoculare un piatto di 10 cm rivestite con proteine della matrice extracellulare. Posizionare la piastra inoculata in un incubatore a CO₂ tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
   9. Mezzo di cambiamento (mTeSR1 senza Y27632) ogni giorno.

2. generazione di hPGCLCs

Nota: Avviare la seguente procedura quando hiPSC cellule in un piatto di 10 cm (mTeSR1 medio, rivestite con proteine della matrice extracellulare) raggiunge al confluency di ~ 80% (circa 10⁷ cellule).

1. Preparazione di piatti rivestite con proteine della matrice extracellulare (giorno 1)
   1. Scongelare un'aliquota delle proteine della matrice extracellulare sul ghiaccio e diluire in 25 mL di gelida DMEM/F12.
   2. Dispensare la proteina della matrice extracellulare diluito per piastre da 6 pozzetti (1 mL/pozzetto). Un'aliquota è sufficiente per rivestire 24 pozzetti (4 piatti). Incubare le piastre a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Non utilizzate piastre possono essere sigillati e conservati a temperatura ambiente fino a una settimana.
   3. Aspirare il mezzo da piastre immediatamente prima dell'inoculazione di pluripotenza innescato hiPSCs. Non è necessario lavare i piatti rivestiti con il mezzo o PBS(-).
2. Inoculazione di pluripotenza innescato hiPSCs in piastre rivestite con proteine della matrice extracellulare (giorno 1)
   1. Prendere 4 mL di enzima di dissociazione delle cellule in una provetta da 15 mL centrifuga ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Preriscaldare la mL 10 PBS(-) in una centrifuga 15 mL tubo per > 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
   3. Aggiungere 7 µ l di 50 mM Y27632 (inibitore di roccia) per mezzo di mTeSR1 35 mL in una provetta da centrifuga da 50 mL. Utilizzare medium Y27632-completato nello stesso giorno. Fare due tubi per totale 70 mL medium Y27632-completato e preriscaldare il mezzo in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
   4. Aspirare il vecchio mezzo da un cellule di 10 cm piatto e sciacquare una volta con preriscaldati 10 mL PBS(-). Eliminare PBS(-) e aggiungere 4 mL di enzima di dissociazione della cellula al piatto. Mettere il recipiente in un incubatore a CO₂ (incubatore tri-gas funziona, ma non necessario) per ~ 4 min fino a staccano le cellule dal fondo. Cellule di dispensare delicatamente su e giù per rendere sospensione unicellulare.
   5. Trasferire hiPSC cella singola sospensione nella provetta preriscaldata contenente 10 mL di terreno di Y27632-completati. Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente, 300 x g per 8 min.
   6. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 10 mL di terreno di Y27632-completati preriscaldati.
   7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella (dimensione dei pori di 40 µm) per rimuovere aggregati cellulari e contare le celle utilizzando un contatore Coulter.
   8. Diluire hiPSC sospensione unicellulare a 5.0 x 10⁶ cellule in medium Y27632-completato preriscaldata in 50 mL.
   9. Inoculare sospensione cellulare 2 mL (2.0 x 10⁵ celle) in tutti i pozzetti delle piastre rivestite con 6 pozzetti (4 piastre, 24 pozzetti). Assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente in ogni pozzetto. Posizionare le piastre per colture cellulari in un incubatore a CO₂ tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
      Nota: La densità di inoculo delle cellule e la distribuzione uniforme in ogni bene è fondamentale. Perché l'inoculazione di hiPSCs nei piatti 10 cm può causare la densità delle cellule significativamente più alto rispetto ad altre zone. Anche la densità delle cellule di singole cellule hiPSCs possa essere più facilmente raggiunti con piastre da 6 pozzetti.
   10. Sostituire il terreno con 2 mL/pozzetto mTeSR1 (senza Y27632) a 24 ore dopo l'inoculazione.
3. Conversione della hiPSCs di stato di pluripotenza innescato per le cellule pluripotenti 4i-ingenuo (ERK-indipendente) (giorno 3 e giorno 4)
   1. Preparare 4i completo ingenuo pluripotenza medio in una provetta da centrifuga da 50 mL come segue (giorno 3 e giorno 4): 50 mL di sostanza basale 4i, 5 µ l di 30 mM CHIR99021, 5 µ l di 10 mM PD0325901, 5 µ l di 20 mM BIRB796, 5 µ l di 50mm SP600125 e 5 µ l di 50 mM Y27632.
      Nota: Conservare 4i medio basale a-80 ° C e scongelare in frigorifero durante la notte. Preparare il supporto completo di fresco 4i immediatamente prima dell'uso. Evitare l'esposizione dei prodotti chimici 4i (CHIR, PD, BIRB e SP) a luce forte. Non conservare 4i completo medio a 4 ° C o ghiacciato durante la notte o più a lungo.
   2. Terreno completo di 4i caldo 50 mL in un batch di acqua di 37 ° C per mezzo di cambiamento di 15 min. con preriscaldato 4i completo medio (2 mL/pozzetto) a 48 e 72 ore dopo l'inoculazione. Momento esatto del cambiamento medio è importante raggiungere hPGCLC ad alta resa e riproducibilità sperimentale.
      Nota: Densità della cultura hiPSC 4i è alto in questa condizione e diventare confluenti in 48-72 ore dopo l'inoculazione, ma questo è normale.
4. Formazione di EB utilizzando piastre microtiter (giorno 5)
   1. Preparare 50 mL di terreno completo di 4i in una provetta da centrifuga da 50 mL e preriscaldare esso in bagnomaria a 37 ° C per circa 15 min prima dell'uso.
   2. Preriscaldare la mL 35 DMEM/F12 in una provetta da centrifuga da 50 mL in bagnomaria a 37 ° C per circa 15 min prima dell'uso.
   3. Preparare una piastra microtiter
      1. Aggiungere 5% (p/v) filtro sterilizzato Pluronic F-127 detergente in attivi 8 pozzetti di una piastra microtiter (Vedi Tabella materiali; 0,5 mL/pozzetto).
      2. Centrifugare la micropiastra a temperatura ambiente, 1.000 x g per 5 min. Inspect micropozzetti con un microscopio invertito per assicurare l'assenza di bolle d'aria. Lasciare la piastra microtiter per 30 min a temperatura ambiente per rivestire i micropozzetti con detersivo.
      3. Scartare la soluzione detergente da pozzetti della piastra microtiter di pipettaggio e risciacquo wells con preriscaldati DMEM/F12 (2 mL/pozzetto).
      4. Centrifugare la micropiastra a temperatura ambiente, 1.000 x g per 5 min. Inspect micropozzetti con un microscopio invertito per assicurare l'assenza di bolle d'aria.
         Nota: Quando bolle d'aria sono ancora osservate in micropozzetti, esaminare se il foglio di micropozzetti è ancora saldamente incollato al fondo del pozzo.
      5. Scartare DMEM/F12 da pozzetti della piastra microtiter di pipettaggio e risciacquo wells con preriscaldati DMEM/F12 (2 mL/pozzetto).
      6. Ripetere i passaggi 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Aggiungere terreno completo 4i nei pozzetti della piastra microtiter (1 mL/pozzetto) sciacquati. Tenete il restante supporto completo di 4i in bagnomaria a 37 ° C.
      8. Centrifugare la micropiastra a temperatura ambiente, 1.000 x g per 5 min. Inspect micropozzetti con un microscopio invertito per assicurare l'assenza di bolle d'aria.
      9. Posizionare la piastra microtiter in un'incubatrice di tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) fino a inoculazione di 4i hiPSCs.
   4. Inoculazione di 4i iPSCs in una piastra microtiter
      1. Prendere 13 mL di enzima di dissociazione delle cellule in una provetta da 15 mL centrifuga ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min.
      2. Preriscaldare la 50ml PBS(-) in una centrifuga da 50 mL tubo per > 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
      3. Aspirare il vecchio mezzo da 24 pozzetti di ingenuo hiPSC cultura e risciacquo cellule tumorali una volta con preriscaldati 2ml/bene PBS(-). Eliminare PBS(-) e aggiungere 0,5 mL/pozzetto dissociazione enzima. Posizionare piastre per colture cellulari in incubatore a CO₂ (37 ° C) per ~ 4 min fino a staccano le cellule dal fondo. Cellule di dispensare delicatamente su e giù per rendere sospensione unicellulare.
      4. Trasferire sospensione unicellulare hiPSC preriscaldati 20 mL di terreno completo di 4i. Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente, 300 x g per 8 min.
      5. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di terreno completo di 4i preriscaldati.
      6. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella (dimensione dei pori di 40 µm) per rimuovere aggregati cellulari. Lavare il filtro cella 3 volte con 1 mL di terreno completo di 4i preriscaldati. Contare le celle utilizzando un contatore Coulter.
      7. Diluire la sospensione unicellulare di 4i ingenuo hiPSCs a 27.0-32,4 x 10⁶ cellule in 9 mL di terreno completo di 4i preriscaldati. Nota che tale supporto completo 4i contiene già Y27632.
      8. Prendere la piastra microtiter contenente 1 mL di 4i completo medie 8 bene da un incubatore di tri-gas (2.4.3.9). Inoculare 1 mL 4i ingenuo hiPSC sospensione (3.0-3.6 x 10⁶ cellule/pozzetto) in ciascun pozzetto. La densità delle cellule è critica. Assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente in ogni pozzetto pipettando delicatamente.
      9. Centrifugare la micropiastra a temperatura ambiente, 100 x g per 3 min.
      10. Posizionare la piastra microtiter in un incubatore a CO₂ tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Non disturbare le cellule pellettate in micropozzetti. Incubare le cellule per 24-30 ore. Un'incubazione overnight (~ 16 ore) non è in genere sufficiente per formazione di EBs stretto.
5. Trasferimento di EBs per piastre di ancoraggio basso per dondolo cultura (giorno 6)
   1. Preparare il supporto completo di hPGCLC in una provetta da centrifuga 50 mL come segue (6 ° giorno - giorno 13):
      20 mL hPGCLC basale medio, 4 μL di 500 mM 2-mercaptoetanolo, 50 μL di 20 mg/mL acido L-ascorbico, 4 μL di 50mm Y27632, 50 μL di 100 μg/mL ricombinante umano BMP4, 4 μL di 500 μg/mL umano SCF, 4 μL di EGF umano di 250 μg/mL e 8 μL di 250 μg/mL umano LIF.
      Nota: Preparare il supporto completo di hPGCLC fresco immediatamente prima dell'uso ed evitare l'esposizione alla luce. Non conservare hPGCLC completa medio a 4 ° C o ghiacciato durante la notte o più a lungo.
      Nota: La concentrazione di BMP4 è molto alta. La concentrazione ottimale di BMP4 può differire tra i lotti di BMP4. La differenza di lotto--lotto di BMP4 influenzano fortemente la produzione di hPGCLC. In assenza di BMP4 nel medio hPGCLC completa, resa di hPGCLCs è molto basso⁶. L'importanza di altre citochine nel medio hPGCLC completo è stato descritto da Hanna/Surani⁶.
      Nota: In questo protocollo, la concentrazione finale di LIF umana nel medio hPGCLC completo è di 100 ng/mL^6,10. La concentrazione finale di LIF utilizzata negli studi precedentemente pubblicati, compreso il nostro, era di 1 μg/mL. Quando l'attività specifica di umano reagente LIF è > 10.000 unità/μg (ED₅₀ < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF è sufficiente per supportare la generazione di hPGCLC da EBs.
   2. Trasferimento di EBs
      1. Preriscaldare la sostanza basale di hPGCLC 5 mL e 20 mL di terreno completo di hPGCLC per > 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
      2. Posizionare un filtro cella capovolta in cima ad un tubo conico in polipropilene da 50 mL.
      3. Pipetta da ciascun pozzetto della micropiastra piatto molto delicatamente per staccare EBs dai micropozzetti. Filtrare tutto il contenuto di ogni pozzetto con il colino di cella per rimuovere le cellule non incorporate in EBs.
      4. Lavare EBs mantenuto sul filtro cella con 1 mL di sostanza basale hPGCLC preriscaldati. Delicatamente ripetere il lavaggio 5 volte.
      5. EBs lavati vengono ora mantenute sulla membrana di un colino, che è su una provetta fondo conico da 50 mL a testa in giù. Inserire una nuova provetta conica da 50 mL sul filtro cella in modo che il filtro cella viene normalmente posizionato nel nuovo tubo. Poi rapidamente invertire il filtro cella con il nuovo tubo. Il filtro di cella e il tubo sono ora nelle posizioni normali, ed EBs sono sotto la membrana del filtro cella.
      6. Raccogliere EBs in tubo conico aggiungendo 18 mL di terreno completo di preriscaldati hPGCLC da sopra la membrana del filtro cella. Così, mezzo andrà attraverso la membrana e raccogliere EBs attaccato sul lato inferiore della membrana fino al fondo della provetta centrifugo.
      7. Sospensione di piastra di EBs nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti basso-allegato (3 mL/pozzetto).
      8. Posizionare la piastra di basso-allegato su un altalena-mossa rocker in un'incubatrice di tri-gas (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Impostare la velocità a dondolo a ~ 20 giri / min.
         Nota: Non applicare vorticoso movimento perché aggregato di EBs presso il centro di pozzi e fusibile. Regolare attentamente la velocità a dondolo affinché non si aggregano EBs. A dondolo troppo vigorosa danneggia fisicamente EBs.
         Nota: Pressione bassa dell'ossigeno è fortemente raccomandato per la cultura EB.
6. Generazione di hPGCLCs sulla superficie della EBs (giorno 7 - giorno 13)
7. Appena preparare 20ml hPGCLC supporto completo ogni giorno. Senza dondolo, EBs affonderà sul fondo dei pozzi di ~ 1 min. Remove vecchio mezzo senza asciugatura EBs (~0.2 mL/pozzetto vecchio mezzo può rimanere) e aggiungere il terreno completo hPGCLC fresco ogni giorno (3 mL/pozzetto).

3. la macchiatura di Immunohistochemical di EBs (giorno 10 – giorno 13)

1. Incorporamento di EBs in blocchi di proteine della matrice extracellulare per formaldeide-fisso, paraffina (FFPE) immunostaining
   1. Per identificare hPGCLCs come OCT4⁺ cellule, raccolto EBs in un tubo di basso-bind microcentrifuga da 1,5 mL. Lasciate che EBs sul fondo o brevemente centrifugare (2 secondi) a temperatura ambiente ed eliminare di terreno. Sciacquare EBs con PBS(-) ghiacciata.
   2. Rimuovere PBS(-) e incubare EBs in 1 mL di 1%(w/v) ghiacciata sodio azide in PBS(-) per 5 min sul ghiaccio. Lasciate che EBs sul fondo o centrifugare brevemente (2 secondi) a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare EBs con PBS(-) ghiacciata.
      Nota: Aggiunta di sodio azide rallenta il degrado delle proteine intracellulari e trascrizioni del RNA.
   3. Scongelare 200 µ l di proteina della matrice extracellulare su ghiaccio e aggiungere al tubo del microcentrifuge contenente EBs. Lasciare il tubo a temperatura ambiente per circa 10 min fino a quando il gel è solidificato.
   4. Aggiungere 1 mL di formaldeide al 4% in PBS(-) e incubare a temperatura ambiente per 15 min con dolce dondolio.
      Nota: Entrambi EBs e proteine della matrice extracellulare sono fisse durante questo passaggio. Senza fissazione, i blocchi di gel possono decomporsi durante il processo di disidratazione. Se pre-fisso EBs sono incorporati nel blocco di gel, EBs sono fissate nuovamente con il blocco di gel e può essere sovra-fisso.
   5. Eliminare la formaldeide e sciacquare EBs una volta con PBS(-) ghiacciata. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70%. Gel-embedded EBs possono essere memorizzati in etanolo al 70% a 4 ° C per una settimana.
   6. Processo l'EBs gel incorporato con un protocollo standard di FFPE. Preparare 5 μm di spessore FFPE vetrini. Lasciate che scivoli asciugare durante la notte e conservarle a temperatura ambiente fino a che immunostaining.
      Nota: Il nostro protocollo FFPE routine è la seguente: etanolo al 70%, due cambi, 1 ora ciascuno; 80% di etanolo, un cambiamento, 1 ora; etanolo al 95%, un cambio, 1 ora; 100% etanolo, tre cambiamenti, 1,5 ore ciascuna; xilene, tre cambiamenti, 1,5 ore ciascuna; cera di paraffina (58-60 ° C), due modifiche, 2 ore ciascuno. I tessuti disidratati sono incorporati in blocchi di paraffina e tagliati a 3-10 μm (in genere 5 μm).
   7. Per la colorazione, completamente a secco di diapositive nel forno di 56 ° C per almeno 30 min Deparaffinize e idratare diapositive con xilene e alcol graduata serie. Quindi lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
   8. Per inattivare le perossidasi endogene, incubare i vetrini reidratati con soluzione di blocco BLOXALL a temperatura ambiente per 10 min. Quindi lavare i vetrini con PBS per 5 min.
   9. Blocco di diapositive con siero equino normale (o sieri normali di altri anticorpi secondari specie generate) a temperatura ambiente per 20 min.
   10. Incubare i vetrini con un anticorpo primario anti-OCT-3/4 capra diluito con 0,1% BSA in PBS(-) a 4 ° C durante la notte (ottimizzare le condizioni di diluizione e l'incubazione per ogni anticorpo primario). Quindi lavare i vetrini con PBS(-) tre volte a temperatura ambiente, 5 minuti ciascuno.
   11. Incubare i vetrini con la anti-capra IgG (anticorpo secondario coniugati alla perossidasi di rafano generati da cavallo; Vedi Tabella materiali) a temperatura ambiente per 30 min. Quindi lavare i vetrini con PBS(-) tre volte a temperatura ambiente, 5 minuti ciascuno.
   12. Mescolare la quantità necessaria DAB macchiatura substrati (Vedi Tabella materiali) immediatamente prima dell'uso e incubare i vetrini in DAB completa soluzione a temperatura ambiente per 5 min. Monitor DAB che macchia usando un microscopio invertito la macchiatura e interrompere la reazione Quando OCT4⁺ cellule sono visualizzate risciacquando rapidamente scivoli in acqua di rubinetto che scorre.
   13. Disidratare i vetrini con serie graduata di alcool e xileni. I vetrini sono pronti per il laser capture microdissection. Preparare vetrini FFPE permanente utilizzando il mezzo di montaggio (Vedi Tabella materiali) per osservazioni al microscopio ad alta risoluzione.

4. arricchimento di FACS di hPGCLCs da EBs (giorno 10 – giorno 13)

1. Preparare il mix di enzima di Embryoid Body Kit di dissociazione
   1. Preparare enzima Mix 1 aggiungendo 50 µ l di enzima P a 1.900 µ l di tampone X e vortice. Preriscaldare la enzima Mix 1 in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
   2. Preparare enzima Mix 2 aggiungendo 10 µ l di enzima A 20 µ l tampone Y.
   3. Mescolare enzima Mix 1 e 2 per preparare Mix di enzima completo EB dissociazione.
2. Dissociando EBs
   1. EBs raccolto da piastre di ancoraggio basso e centrifugare a temperatura ambiente in una provetta da centrifuga 15 mL, 300 x g per 2 min. eliminare il surnatante e risospendere EBs con 10 mL PBS(-). Centrifugare nuovamente.
   2. Eliminare il surnatante e risospendere EBs con Mix di completo EB dissociazione degli enzimi (4.1.3). Incubi, sospensione EB in bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min fino a EBs sono dissociati. Durante l'incubazione, delicatamente dispensare EBs presso ogni 3-5 minuti per facilitare la dissociazione. In alternativa, è possibile utilizzare un dissociatore automatizzato con programma di dissociazione di Embryoid Body.
   3. Aggiungere mL 8 ghiacciata PBS(-) alla sospensione di cellule dissociate EB. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella da 40 µm. Colino di cella lavare con 1 mL ghiacciata PBS(-) tre volte.
   4. Contare le celle in sospensione cellulare filtrati utilizzando un contatore Coulter.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare alle ore a 4 ° C, 300 x g per 8 min ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con gelida 10 mL PBS(-).
   6. Dividere sospensione cellulare in due tubi, uno per il no-macchiatura controllo (cellule di⁵ ~ 10) e l'altro per anti-CD38 macchiatura (tutte le restanti celle).
   7. Centrifugare le due provette a 4 ° C, 300 x g per 8 min.
3. Anti-CD38 macchiatura e FACS arricchimento di hPGCLCs
   1. Risospendere il pellet cellulare per controllo no-macchiatura con 200 µ l ghiacciata 3% (p/v) BSA e sodio azide 1% (p/v) in PBS(-). Mettere sul ghiaccio fino al flusso cytometry.
      Nota: Aggiunta di sodio azide rallenta interiorizzazione di CD38 dalla superficie cellulare.
   2. Risospendere le cellule per anti-CD38 colorazione con ghiacciato 3% (p/v) BSA e 1% (p/v) in PBS(-) a 1 x 10⁶ cellule per 100 µ l di sodio azide.
   3. Aggiungere 10 µ l per 1 x 10⁶ cellule di FACS-grado, APC-coniugato anti-CD38 anticorpo. Coprire il tubo con carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce. Incubare a 4 ° C per 45 min con dolce dondolio.
   4. Aggiungere 5 mL ghiacciata PBS(-) e centrifugare a 4 ° C, 300 x g per 8 min. Discard surnatante e risospendere le cellule a pellet con 5 mL PBS(-) ghiacciata. Ripetere il lavaggio con PBS(-) tre volte in totale.
   5. Risospendere il pellet di cellulare con 500 μL ghiacciato 3% (p/v) BSA e 1% (p/v) di sodio azide in PBS(-) ad una densità di cella adeguata per FACS.
   6. Arricchire la hPGCLCs come CD38⁺ cellule, che in genere formano la popolazione cellulare chiaramente distinti. Utilizzare il controllo no-macchiatura per garantire l'identificazione di CD38⁺ cellule. Rendimento tipico di hPGCLCs sono 1-5% di tutte le celluli CPE da giorno 10 EBs e 20-40% dal giorno 13 EBs.

La piastra microtiter usata qui è in formato 24 pozzetti e ha 8 pozzetti che tiene i fogli microtiter, ognuno dei quali supporta la formazione di fino a 1.200 EBs. Da circa 24 milioni di cellule di pluripotenza 4i naïve, questa piastra microtiter genera tipicamente ~ 8.000 EBs che consiste di cellule ~ 3.000 per EB. Durante la coltura non aderente di EBs con dondolo costante, il numero di EBs intatto gradualmente diminuisce a causa di auto-demolizione spontanea e ~ 3.000 EBs sopravvivere fino al giorno 13 del protocollo. La maggior parte di questi sopravvissuti EBs hanno 50-200 hPGCLCs sulla loro superficie (stimato tramite rilevazione immunohistochemical di OCT4 + celle nelle sezioni seriali di EBs; vedere la Figura 8), producendo ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs in totale. Digestione enzimatica di EBs in singole celle è un processo relativamente inefficiente, riducendo la resa di FACS-arricchita CD38 + hPGCLCs a 9.000-47.000 celle. Nelle nostre mani, una media di sei lotti indipendenti ma consecutivi di esperimenti è stata 14.038 ± 5.731 (media ± SEM). Perché delle cellule CD38-negativi EB express OCT4 mRNA (qPCR) o proteine (immunoistochimica) solo molto debolmente, se non completamente assente, tutte le celle EB fortemente che esprimono la proteina OCT4 sono praticamente equivalente a tutta la popolazione del CD38 + hPGCLCs.

Il parametro critico di questo protocollo comprende la densità delle cellule. Quando 2.0 x 105 umano iPSCs vengono inoculati in una tabella extracellulare bene di piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti (area di crescita di2 cm 9,60 per pozzetto) con 2 mL di terreno di Y27632-completati (2.2.9) rivestite con proteine, cellule raggiungerà a circa 20-30% confluenza alle 24 ore dopo l'inoculazione (Figura 1). Dopo un'ulteriore 24 ore cultura nel medio mTeSR1 in assenza di Y7632, aggregati di cellule e formano colonie, che occupa circa il 30% della zona di crescita (Figura 2). Le cellule sono poi coltivate nel mezzo di riprogrammazione 4i (2.3.2). Dopo 24 ore di cultura in confluent cellule diventano medi, 4i (Figura 3). Una cultura di 24 ore aggiuntiva nel medium 4i rende le cellule densamente imballato (Figura 4). L'esatta tempistica di cambiamento medio (ogni 24 ore + /-4 ore) e la densità delle cellule sono fondamentali per la formazione di successo di EBs e hPGCLCs.

Dopo 48 ore cultura nel medium 4i, cellule sono dissociate e inoculate alla piastra microtiter, che ha 400 µm pozzi in dimensione (2,4). Anche se questa piastra microtiter commercialmente disponibile è rivestita per superficie a bassa aderenza dal produttore, fresco ricoprirli con detergente (2.4.3) è consigliato per ridurre il rischio di adesione delle cellule indesiderate. 800 µm micropozzetti provocato dalla resa del hPGCLCs, suggerendo l'importanza della dimensione EB per differenziazione correttamente diretto. Cellule inoculate nel medium 4i formerà EBs in micropozzetti a 24-30 ore, che può essere osservate utilizzando un standard, invertito microscopio di contrasto fase (Figura 5). Il contorno circolare di EBs diventano chiaramente visibili e dopo 24 ore di incubazione. EBs la raccolta in un momento precedente (es. 16 ore dopo l'inoculazione) prima di loro contorno circolare è chiaramente visibile non è raccomandato perché tale EBs sono molto vulnerabili a danni meccanicistici e smontare facilmente. Si noti che una quantità significativa di hiPSCs ingenuo non è incorporata in EBs, che è normale. Queste cellule non incorporate saranno lavate via prima dell'inizio del dondolo cultura di EBs sulla superficie di basso-aderente (2.5.2). Si noti inoltre che, nel nostro protocollo, EBs si formano nel mezzo di pluripotenza 4i ingenuo - non nel mezzo di hPGCLC. Pre-formazione di EBs solido nel medium 4i prima dell'esposizione al medium hPGCLC è importante per la distribuzione di hPGCLCs sulla superficie di EBs.

EBs mantenuto nel medio hPGCLC sotto un dondolo, condizione di cultura non aderenti manterranno la loro forma sferica senza aggregazione o fusion (Figura 6 e Figura 7). Troppo debole a dondolo condizione causerà EB aggregazione e fusione, ma troppo dura condizione sarà smontare EBs. PGCLCs umana emerge come OCT4-esprimendo le cellule sulla superficie della EBs dopo più presto la cultura di 5 giorni nel mezzo di hPGCLC e il loro numero aumenta fino a quando la cultura di 8 giorni (Figura 8). Ulteriore incubazione di EBs può causare lo smantellamento di EBs e perdita di hPGCLCs. PGCLCs umana potrà essere arricchito dalle cellule EB enzimaticamente dissociate dopo 5-8 giorni di cultura in medium hPGCLC da FACS come cellule CD38 + (Figura 9).

Figura 1: coltura delle cellule umane iPSC in medium Y27632-completato 24 ore dopo l'inoculazione. Densità delle cellule è di circa 20-30% confluenti. In presenza di inibitore di roccia Y27632, le cellule tendono a diffondersi bene con allungamento lungo, spike-come. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: coltura delle cellule umane iPSC 48 ore dopo l'inoculazione. Aggregazione di formare le colonie, che occupa circa il 30% dell'area di crescita di cellule. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: coltura delle cellule umane iPSC incubate nel mezzo di riprogrammazione 4i per 24 ore. Le cellule di raggiungere alla confluenza. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: coltura delle cellule umane iPSC incubate nel mezzo di riprogrammazione 4i per 48 ore. Cellule confluenti sono densamente imballate. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: iPSC umano EBs formato in micropozzetti dopo incubazione di 24 ore nel 4i riprogrammazione medio. Il contorno circolare di EBs diventano visibili a 24-30 ore dopo l'inoculazione. Quando il contorno è confermato sotto un microscopio a contrasto di fase, EBs sono pronti per il trasferimento ad una condizione di cultura a dondolo. Barra della scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: iPSC umano EBs incubati per 24 ore nel medio hPGCLC. EBs in gran parte mantengono la loro forma sferica. Barra della scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: iPSC umano EBs incubati per 192 ore nel medio hPGCLC. EBs sono allargata rispetto alla loro apparizione presso 24 ore cultura, ma mantengono ancora in gran parte forme sferiche con nessuna aggregazione o fusion. Barra della scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: PGCLCs umana esprimendo OCT4 sono localizzati sulla superficie del hiPSC EBs incubati per 192 ore nel medio hPGCLC. EBs sono stati incorporati nella proteina della matrice extracellulare e trattati per FFPE diapositiva macchiatura immunohistochemical di OCT4 (substrato DAB). Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: PGCLCs umano sono arricchite dalle cellule di EB enzimaticamente dissociate da FACS come CD38+ cellule. Dopo l'incubazione nel mezzo hPGCLC per 5-8 giorni, EBs può essere dissociato dalla digestione enzimatica per preparare la sospensione unicellulare. hPGCLCs può essere arricchito come CD38+ cellule di FACS (punti rossi). Cellule EB che non esprimono CD38 (puntini blu) devono essere raccolti anche come controllo negativo. Cancelli di FACS delle cellule CD38-positive e CD38-negativi devono essere separati con un ampio margine (punti verdi) per evitare la contaminazione di ogni tipo di cellule. I pannelli superiori e inferiori mostrano profili di FACS senza o con l'anticorpo anti-CD38 macchiatura, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.