Articolo metodologico

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

DOI:

10.3791/58298

⸱

23 gennaio 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

Abstract

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Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell'espressione genica. Dal momento che la modifica dell'istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l'avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l'epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L'obiettivo del presente protocollo è l'introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.

Introduzione

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Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina - modifica del DNA di metilazione e istone - sono alla base della specificità di cellula-tipo dell'espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.

Per studiare l'epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)1. In tChIP, proteina di nucleo epitopo-etichetta dell'istone H2B è espresso da un promotore di cellula-tipo-specifico. Questa funzione permette l'isolamento di cromatine dalle celle di interesse, anche se il materiale viene avviato da una miscela di vari tipi cellulari. Seguenti ChIP-Seq — purificazione della cromatina attraverso un contrassegno dell'istone per volta e generazione sequenziamento profondo del DNA isolato — possiamo monitorare lo stato epigenetico del tipo cellulare mirati in maniera genoma.

Usando questa tecnica, abbiamo recentemente studiato trimethylation di neurone-specific dell'istone H3 proteina a lisina 4 (H3K4me3) marchi. In quello studio, abbiamo sviluppato un topo knock-nel quale C-terminale Bandierina-etichettate H2B proteina è stata espressa su ricombinazione Cre-mediata (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bandiera). Dall'incrocio con un mouse che possiedono il gene Cre-reticolo endoplasmatico endoplasmatico (ER) sotto il controllo del promotore CamK2a, la linea di topo ottenuti indotta H2B-bandiera in neuroni attivi su tamoxifen iniezione (Camk2aH2B-bandiera)1. A partire dal cervello della riga del mouse stabilito, abbiamo effettuato tChIP-Seq con anticorpo anti-H3K4me3. Poiché H3K4me3 marchi corrispondono spesso a regioni promotrici, potremmo scoprire centinaia di mRNAs specificamente espressi nei neuroni1.

Qui, descriviamo un metodo tipico tChIP-Seq che copre le misure da dissezione del tessuto per la costruzione della libreria (Figura 1). L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di condividere le nostre best practice per le prestazioni di tChIP-Seq e la futura applicazione di questo metodo ad altri tipi di cellule e modificazioni istoniche.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dalla divisione sicurezza di RIKEN (H27-EP071) e condotti con regolamenti e linee guida pertinenti.

1. dissezione del tessuto

  1. Sezionare i tessuti di interesse in piccoli pezzi (circa < 3 mm2) usando le forbici di primavera.
    Nota: Frammenti di tessuto più grandi richiedono più tempo per congelare, e pezzi più piccoli verranno riporto più grandi volumi di tampone, entrambi i quali possono alterare i risultati.
  2. Aggiungere i frammenti di tessuto dissecato in un contenitore pulito riempito con azoto liquido e raccoglierli in provette da 2 mL (1 parte per tubo) riempito con azoto liquido.
    Nota: I tubi con una superficie idrofila sono consigliati per questo passaggio.
  3. Disporre le provette a-80 ° C per > 5 min con il tappo aperto per far evaporare l'azoto liquido rimanente.
    Nota: Dopo aver chiuso il tappo, frammenti di tessuto possono essere conservati a-80 ° C per un mese prima dell'uso.

2. fissazione delle cellule

Nota: Abbiamo usato una smerigliatrice criogenica utile per questo passaggio. Un apparecchio alternativo può essere utilizzato.

  1. Posto i 2 mL-basso legame provette contenenti i campioni di tessuto su un rack di ghiaccio metallo raffreddato in azoto liquido.
  2. Inserire un punto metallico in un 1,5 mL-tubo e chill con azoto liquido. Posizionarlo sul cestello ghiaccio in metallo.
  3. Aprire il 2 mL-tubo e inserire il proiettile di metallo prechilled nella provetta. Chiudere il tappo, impostare i 2 mL-tubi in supporto del tubo di una smerigliatrice criogenico utile e immergere immediatamente il supporto tubo assemblato in azoto liquido per 1 min.
  4. Inserire il supporto di tubo congelato la cassetta esterna del macinino criogenico utile ed agitare vigorosamente 60 volte per 30 s.
  5. Smontare il supporto tubo, rimuovere il proiettile in metallo e posto i 2 mL-tubo su un raffreddatore di campioni prechilled a-20 ° C.
  6. Il campione viene posto più fresco a-20 ° C per 15 min evitare il congelamento di fissativo nel passaggio successivo.
  7. Portare il campione più fresco al banco, aprire il coperchio del tubo e immediatamente gocciolare 900 µ l di 1% di formaldeide in esso. Dopo parecchie volte il pipettaggio, trasferire la sospensione nel nuovo 2 mL-tubo contenente 900 µ l di 1% di formaldeide e correzione per 10 min con delicata rotazione in un incubatore a 23 ° C.
    Attenzione: La formaldeide è tossica e nociva.
  8. Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 µ l di glicina di 2,5 M per ogni provetta e centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  9. Aggiungere 1 mL di gelida tampone fosfato salino (PBS), centrifuga per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte (3 lavaggi in totale).
    Nota: Campioni fissi possono essere congelati a flash di azoto liquido e conservato a-80 ° C.
  10. Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerolo, 0,5% w/v NP-40, inibitore della proteasi di 0.25% w/v Triton x X-100 e 0.1 cocktail) per il pellet, dispensare diverse volte e ruotare per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Il Buffer di lisi 1 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.
  11. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
  12. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x cocktail dell'inibitore di proteasi) per il pellet, vortice e ruotare per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Il Buffer di lisi 2 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.
  13. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
  14. Aggiungere 800 µ l di tampone di dosaggio (RIPA) di radioimmunoprecipitation con inibitore di proteasi 1x cocktail al pellet e risospendere il pellet di pipettaggio.
  15. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
  16. Aggiungere 500 µ l di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail.
  17. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
  18. Aggiungere 1 mL di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail. Procedere immediatamente alla fase successiva.

3. cromatina tosatura

  1. Trasferire il lisato in una provetta di sonicatore e quindi posizionare il tubo su un ultrasonicatore.
  2. La cromatina di taglio con le seguenti impostazioni: temperatura: 4 ° C; picco di potenza incidente: 175 W; fattore di utilizzo: 10%; cicli/scatti in sequenza: 200; e tempo: 2.400 s.
  3. Trasferire il campione per un 1,5 mL-proteina obbligatoria bassa provetta e centrifugare per 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.
  4. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo basso legame proteico.
    Nota: Il campione può essere flash-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C.

4. qualità del controllo dei DNA (Reverse reticolazione)

  1. Mix 20 µ l del lisato e 180 µ l di tampone di eluizione di ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v sodio dodecil solfato (SDS)) in una provetta di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Incubare il campione a 65 ° C in un termociclatore per 6 ore con il coperchio del termociclatore aperto. Tenere il coperchio del termociclatore aperto per evitare eccessiva denaturazione.
    Nota: Il tampone di eluizione di ChIP dovrebbe essere filtrato e conservato a temperatura ambiente prima dell'uso. Al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
  2. Aggiungere 1 µ l di 10 mg/mL RNasi A, vortex e incubare a 37 ° C per 30 min.
  3. µ L 6,5 di 15 mg/mL proteinasi K, vortice e incubare a 55 ° C per 60 min.
  4. Trasferire la reazione ad un tubo basso legame al DNA, aggiungere 4 µ l di glicogeno 5 mg/mL e vortice. Quindi, aggiungere 200 µ l di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1) e centrifugare per 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.
  5. Trasferire il surnatante in una provetta di basso associazione DNA nuova. Aggiungere 200 µ l di tampone Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) per la soluzione di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico rimanente e centrifugare per 5 min a 18.000 x g e a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e mescolare con il surnatante primo.
  6. Aggiungere 900 µ l di etanolo ghiacciata e incubare per 1 h a-20 ° C.
    Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso a 4 - 6 h.
  7. Centrifuga per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
  8. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di etanolo di 75% ghiacciata per il pellet e centrifugare per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
  9. Scartare il surnatante accuratamente e asciugare all'aria per 1 min a temperatura ambiente.
  10. Aggiungere 50 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e sciogliere il DNA mediante incubazione a temperatura ambiente per 30 min o a 4 ° C durante la notte. Evitare nel Vortex o pipettaggio. Mantenere questo DNA come "input" e utilizzarlo per la preparazione di libreria se necessario.
  11. Misurare la concentrazione di DNA con un fluorometro seguendo le istruzioni del produttore (Vedi tabella dei materiali) e controllare la distribuzione delle dimensioni con una macchina di elettroforesi di microfluidica (Vedi dati rappresentativi, mostrati in figura 2a). uso 10 ng o meno DNA per questo test.
    Nota: Frammenti di 100 – 500 paia di basi (bp) dovrebbero fare 50% o più del DNA.

5. purificazione di affinità dall'anticorpo anti-FLAG

Nota: Per neurone tChIP-Seq, tessuti cerebrali da 8 topi sono in genere utilizzati per un campione di tChIP-Seq per preparare 2 ng di DNA purificato da tandem immunitario-purificazione (Vedi punto 7.1). Nelle nostre mani, 0,1 ng di DNA ancora fornite librerie del DNA di alta qualità per ChIP-Seq (Kadota, inedito). Quindi, in teoria, un unico mouse può essere sufficiente effettuare neurone tChIP-segg. L'importo richiesto deve essere ottimizzato per il tipo di tessuti e cellule di interesse. Per il controllo negativo dell'esperimento imumuno-purificazione, tessuto cerebrale lisato dai topi senza qualsiasi espressione di H2B-bandiera dovrebbe essere preparato e utilizzato.

  1. Dispensare 200 µ l di biglie magnetiche coniugato di immunoglobuline anti-topo di pecora G (IgG) in una provetta di basso legame proteico.
  2. Posizionare il tubo su un supporto magnetico e attendere per 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e vortexare. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
  3. Aggiungere 20 µ l di 1 mg/mL di un anticorpo anti-FLAG e ruotare per 5 ore a 4 ° C.
    Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
  4. Lavare le perline seguendo passo 5.2. Posizionare le perline in una provetta da 15 mL.
  5. Risospendere le sfere in 1110 µ l di tampone RIPA e poi 900 µ l di 10 x blocco reagente, 180 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 10 µ l di 100 x cocktail dell'inibitore di proteasi e 6,8 mL del lisato preparato nel passaggio 3. Dividere questa miscela in 5 tubi di proteina obbligatoria bassa. Ruotare per 6 h a 4 ° C.
    Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
  6. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio 5 volte (6 lavaggi in totale). Piscina tutte le perline in un tubo di singola proteina obbligatoria bassa.
  7. Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2B e C). Procedere immediatamente alla fase successiva.

6. affinità purificazione dall'anticorpo Anti-H3K4me3 e reticolazione inversa

Nota: La seguente perlina preparazione che passaggi (6.1-6.4) devono essere eseguiti prima di passaggio 5.7.

  1. Dispensare 40 µ l di biglie magnetiche coniugato di IgG di anti-topo pecore in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.
  2. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
  3. Aggiungere 4 µ l di anticorpo anti-H3K4me3 1 mg/mL e ruotare per 6 h a 4 ° C.
  4. Lavare le perline seguendo passo 6.2. Posizionare le perline in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.
  5. Risospendere le sfere in 1558 µ l di tampone RIPA e quindi aggiungere 200 µ l di 10 x blocco reagente, 40 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 2 µ l di 100 x inibitore della proteasi cocktail e 200 µ l di eluato preparato nel passaggio 5.7. Ruotare durante la notte a 4 ° C.
    Nota: La SDS nel buffer di eluizione di ChIP è stata diluita più di 10 volte in questa incubazione.
  6. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questa operazione 4 volte (5 lavaggi in totale). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in una provetta di associazione basso di DNA e scartare il surnatante.
  7. Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire l'eluato un nuovo DNA basso bindingTube.
    Nota: L'eluato possa essere conservato a-80 ° C.
  8. Seguire il passaggio 4 per decrosslinking del DNA. Risospendere il DNA purificato in 20 µ l di buffer di TE.
  9. Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2D). (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento mediante PCR quantitativa come descritto in precedenza2. Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.

7. libreria costruzione

  1. Per ogni input e il campione di DNA ChIP, calcolare la percentuale di DNA nella regione 100 – 500-bp utilizzando la funzione di analisi di striscio del software per la macchina di elettroforesi di microfluidica. Stimare il volume di campione richiesto per ottenere 2 ng di 100 – 500 bp DNA. Utilizzare 20 ng DNA nell'intervallo 100-500-bp come l'esempio di "input".
  2. Pipettare campioni di DNA in provette per PCR 8-striscia e H2O per portare il volume totale a 10 µ l. (opzionale) se il volume del DNA supera 10 µ l, proporzionalmente la scalabilità di aggiungere la seguente reazione di fine-riparazione e la selezione della dimensione.
  3. Preparare il mix master fine-riparazione (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 4 µ l di master mix fine-riparazione del DNA ed incubare per 30 min a 20 ° C.
  4. 36 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 e 0,6 x volume (30 µ l) di solido fase biglie magnetiche reversibili immobilizzazione (SPRI) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
  6. Trasferire il surnatante in una provetta nuova, aggiungere 1,2 x volumi (60 µ l) di biglie magnetiche SPRI e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
  8. Lavare le perle due volte con 200 µ l di 80% EtOH, che tiene il tubo ancora sul magnete.
  9. Centrifugare brevemente la provetta per raccogliere il residuo EtOH nella parte inferiore e reimmetterlo sul magnete. Rimuovere accuratamente l'EtOH residua.
  10. Lasciare il coperchio tubo aperto per 1-2 min consentire l'EtOH ad evaporare.
  11. Chiudere il coperchio e tenere il tubo sul ghiaccio.
    Nota: Ora avete ottenuto dimensione selezionata del DNA di 100 – 500 bp le perline. Ulteriori dettagli sulla selezione di dimensione doppia possono essere trovati sul sito Web del produttore (www.beckman.com).
  12. Preparare A-tailing master mix (Vedi Tabella materiali).
  13. Risospendere le perline (da passo 7.10) con 10 µ l di mix master A-tailing e incubare per 30 min a 30 ° C.
  14. Aggiungere 1,8 x volume (18 µ l) di polietilenglicole (PEG) / soluzione di NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  15. Procedura: 7,7-7.11 per purificare il DNA.
  16. Preparare la miscela di buffer di legatura (Vedi Tabella materiali).
  17. 8 µ l di miscela tampone legatura sulle perle (da passo 7,14), aggiungere 1 µ l di 1 adattatore µM e risospendere le perline. Utilizzare 1 µ l di 5 adattatore di µM per l'esempio di input. Considerare l'utilizzo di schede diverse per ogni campione per multiplexing.
  18. Aggiungere 1 µ l di DNA ligasi e incubare per 15 minuti a 20 ° C.
  19. Aggiungere 1,0 x volume (10 µ l) di soluzione di PEG/NaCl, risospendere le perline e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  20. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
  21. Pipettare 25 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
  22. Aggiungere 1,0 x volume (25 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  23. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
  24. 11 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
  25. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
  26. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta PCR 8-strip.
  27. Preparare in tempo reale PCR master mix (Vedi materiali per dettagli).
  28. Pipettare 8,5 µ l di mix master in tempo reale di PCR in una piastra 384 pozzetti quantitativa di PCR (qPCR) e aggiungere 1,5 µ l della scheda di legato del DNA (da passo 7,26).
  29. Pipettare 10 µ l di ogni standard fluorescente a vuoto wells.
  30. Eseguire PCR in tempo reale con il seguente programma: (98 ° C per 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C per 15 s, 60 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s) x 20 cicli, e (72 ° C per 60 s) x 1 ciclo.
  31. Determinare il numero di cicli PCR necessari a raggiungere l'intensità di fluorescenza del fluorescente Standard 2.
  32. Preparare il PCR master mix (Vedi Tabella materiali).
  33. Pipettare 11,5 µ l della miscela PCR padrone nel restante DNA adattatore-legati (da passo 7,26) ed eseguire la PCR come indicato nel passo 7.30 con i cicli PCR determinati nel passaggio 7,31.
  34. Aggiungere 1,0 x volume (20 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  35. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
  36. Pipettare 20 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
  37. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
  38. Raccogliere il surnatante in una provetta da 1,5 mL-DNA basso legante nuovo.
  39. Controllare la qualità della libreria come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2E e F). Utilizzare 1 µ l di campione di DNA di biblioteca. (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento di qPCR come descritto in precedenza 2. Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.

8. sequenziamento

  1. Le librerie in un sequencer di prossima generazione di sequenza (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 3).
    Nota: La sequenza profondità sufficiente per l'analisi dei dati varia a seconda delle dimensioni del genoma dell' organismo3. Per uso umano e mouse, si consiglia di ottenere letture almeno 20 milioni di single-end. Secondo la resa di letture, multiplexing potrebbe essere redditizio.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo la dissezione del tessuto, fissazione, lisi cellulare, purificazione tandem della cromatina e preparazione libreria DNA Sequencer di prossima generazione. Durante le procedure, si può testare la qualità del DNA, che è la chiave del successo sequenziamento, a più passaggi (Figura 2). Poiché un singolo nucleosoma è in genere circondato da 147 bp DNA 4, tranciata DNA non dovrebbe essere più breve di quella dimensione. Sub...

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Discussione

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Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l'espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l'iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l'ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.

Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo è i...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Iwasaki per lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (n. 26113005 S.N. e JP17H05679 alla S.C.); una sovvenzione per giovani scienziati (A) (JP17H04998 per S.C.) dal Ministero della pubblica istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone (MEXT); e la pionieristica progetti "Cellular Evolution" e tutte le RIKEN progetto "Malattia ed epigenoma" RIKEN (a S.N. e S.C.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta Protein LoBind, 2 mLEppendorfNo. 0030108132Per lisi cellulare
Provetta Protein LoBind, 1,5 mLEppendorfNo. 0030108116Per ChIP e preparazione di librerie
Provetta DNA LoBind, 1,5 mLEppendorfNo. 0030108051Per ChIP e preparazione di librerie
Provetta per PCR a 8 strisceBIO-BIK3247-00Per ChIP e preparazione di librerie
SK MillTOKKENSK-200Pratico macinatore criogenico per produrre polvere cellulare per il fissaggio Proiettile
metallicoTOKKENSK-100-DLC10Accessorio di SK Mill
Provetta in acciaio inossidabile da 2 mLTOKKENTK-AM5-SUSUn'opzione per la cella supporto per provette
acciaio inox da 2 mLTOKKENSK-100-TLUn'opzione per la lisi cellulare
16% formaldeide (p/v), senza metanoloPierce28906Per fissare le cellule. Preparare una soluzione all'1% prima dell'uso.
GlycineNacalai Tesque17109-35Preparare 2,5 M stock
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Per il lavaggio di lisato e DNA purificato
HEPESNacalai Tesque02443-05Per tampone di lisi 1. Preparare 1 M, pH 7,5 brodo.
5 M NaCl, grado di biologia molecolareNacalai Tesque06900-14Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grado di biologia molecolareWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl
gliceroloWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Per tampone di lisi 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Per tampone di lisi 1
Triton X-100, grado di biologia molecolareNacalai Tesque12967-32Per tampone di lisi 1
TrisNacalai Tesque35406-91Per tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl. Preparare 1 brodo M, pH 8.0.
0,1 M EGTA pH neutroNacalai Tesque08947-35Per tampone di lisi 2
Cocktail di inibitori della proteasi (100x)Nacalai Tesque25955-24Per bloccare la degradazione del
tampone RIPAThermo Fisher Scientific89900Per la lisi cellulare e il lavaggio
milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Provetta sonicatrice. Accessorio dell'ultrasuonatore focalizzato
Ultrasuoni focalizzatiCovarisS220 o E220Per digerire il DNA in dimensioni adeguate per ChIP-Seq
UltraPure 10%SDS Thermo Fisher Scientific15553-027Per ChIP Tampone di eluizione
RNasi ANacalai Tesque30141-14Per purificare il DNA dalla proteinasi K del lisato
, ricombinante, grado PCRSigma-Aldrich3115887001Per purificare il DNA dal lisato
EtanoloWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Prepara una soluzione al 70%
Anticorpo monoclonale anti-FLAG M2 prodotto nel topoSigma-AldrichF1804Per purificare la cromatina espressa nelle cellule di interesse
Dynabead M-280 Pecora Anti-Topo IgGThermo Fisher Scientific11201DQuesto può essere utilizzato per anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metil istone H3 (K4), anticorpo monoclonale di topoWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Qualsiasi altro anticorpo che funziona per l'analisi ChIP funzionerà
10x Reagente bloccanteSigma-Aldrich11096176001Per il blocco durante la purificazione di affinità
Denhardt' s soluzioneNacalai Tesque10727-74Per il blocco durante la purificazione di affinità
Glicogeno (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Per purificare il DNA dal lisato
Qubit 2.0 FluorimetroThermo Fisher ScientificQ32866Per la quantificazione del DNA isolato
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Per la quantificazione del DNA isolato
Provetta da 0,5 mLAxygen10011-830Per la quantificazione mediante Qubit
Fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Per purificare il DNA dal lisato
Perline AMPure XPBeckman CoulterA63881Perline magnetiche SPRI per la preparazione della libreria
Portaghiaccio in metalloFunakoshiIR-1Per mantenere congelato
il lisato cellulareRaffreddatore di campioniNew England BiolabsT7771SAiuta a fissare le cellule con danni minimi
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAPer controllare la qualità dei frammenti di DNA isolati. È possibile utilizzare un altro analizzatore di frammenti.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAFornito con il Bioanalyzer
Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-4626Per verificare la qualità dei frammenti di DNA isolati Kit di
preparazione della libreria KAPA LTPRoche07961898001Fornito con 10 tamponi per la riparazione dell'estremità KAPA, la miscela di enzimi per la riparazione dell'estremità KAPA, il tampone per la coda A KAPA, l'enzima per la coda A KAPA, il tampone per la legatura KAPA, la DNA ligasi KAPA e la soluzione PEG/NaCl
Codici a barre per DNA NEXTflexAdattatore BIOO ScientificNOVA-514101per la preparazione della libreria. Fornito con adattatori per codici a barre DNA e miscela di primer.
Kit di amplificazione per librerie in tempo reale KAPARoche07959028001Fornito con 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix e standard fluorescenti 2x
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602Per la preparazione della libreria. Inoltre, questo enzima può essere necessario per il kit di amplificazione della libreria in tempo reale KAPA
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 per l'eluizione del DNA
Piastra qPCR a 386 pozzettiThermo Fisher Scientific4309849Per la PCR in tempo reale
Sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 7 FlexThermo Fisher Scientific4485701Per quantificare la
pellicola adesiva ottica DNA MicroAmpThermo Fisher Scientific4311971Per PCR in tempo reale
Pellicola adesiva trasparente MicroAmpThermo Fisher Scientific4306311Per la sigillatura di piastre
Master mixCombina 1,4 &; L di 10x KAPA Tampone di riparazione fine, 1 & micro; L di KAPA End Repair Enzyme Mix, e 1,6 µ L di H2O
A-taling master mixCombine 1 µ L di tampone KAPA A-Tailing, 0,6 & micro; L dell'enzima KAPA A-Tailing e 8,4 µ L di H2O
tampone di legaturaCombine 2 µ L del tampone di legatura KAPA e 6 µ L di H2O
master PCR in tempo realeCombina 5 &; micro; L di 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix in tempo reale, 0,35 &; L di PCR Primer Mix (10 µ M ciascuno di primer diretto AATGATACGGCGACCACCGAG e primer inverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), e 3.15 µ L di H2O
PCR master mixCombine 10 &; micro; L di 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 µ L di PCR Primer Mix e 0,6 µ L di H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88Browser del genoma per visualizzare i dati di sequenziamento
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsUn primer per amplificare la regione del promotore dell'olgionucleotide del DNA GAPDH
: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsUn primer per amplificare la regione del promotore di GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LPer quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH
Thermal Cycler DiceTakaraTP870Per quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH
in proteico di riparazione finale Miscela Miscela

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

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