TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Summary

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

Abstract

Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell'espressione genica. Dal momento che la modifica dell'istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l'avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l'epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L'obiettivo del presente protocollo è l'introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.

Introduction

Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina - modifica del DNA di metilazione e istone - sono alla base della specificità di cellula-tipo dell'espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.

Per studiare l'epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)¹

Protocol

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dalla divisione sicurezza di RIKEN (H27-EP071) e condotti con regolamenti e linee guida pertinenti.

1. dissezione del tessuto

1. Sezionare i tessuti di interesse in piccoli pezzi (circa < 3 mm²) usando le forbici di primavera.
   Nota: Frammenti di tessuto più grandi richiedono più tempo per congelare, e pezzi più piccoli verranno riporto più grandi volumi di tampone, entrambi i quali possono alterare i risultati.
2. Aggiungere i frammenti di tessuto dissecato in un contenitore pulito riempito con azoto liquido e raccoglierli in provette da 2 mL (1....

Results

Qui, descriviamo la dissezione del tessuto, fissazione, lisi cellulare, purificazione tandem della cromatina e preparazione libreria DNA Sequencer di prossima generazione. Durante le procedure, si può testare la qualità del DNA, che è la chiave del successo sequenziamento, a più passaggi (Figura 2). Poiché un singolo nucleosoma è in genere circondato da 147 bp DNA ⁴, tranciata DNA non dovrebbe essere più breve di quella dimensione. Sub.......

Discussion

Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l'espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l'iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l'ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.

Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo è i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta Protein LoBind, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	Per lisi cellulare
Provetta Protein LoBind, 1,5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	Per ChIP e preparazione di librerie
Provetta DNA LoBind, 1,5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	Per ChIP e preparazione di librerie
Provetta per PCR a 8 strisce	BIO-BIK	3247-00	Per ChIP e preparazione di librerie
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Pratico macinatore criogenico per produrre polvere cellulare per il fissaggio Proiettile
metallico	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessorio di SK Mill
Provetta in acciaio inossidabile da 2 mL	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Un'opzione per la cella supporto per provette
acciaio inox da 2 mL	TOKKEN	SK-100-TL	Un'opzione per la lisi cellulare
16% formaldeide (p/v), senza metanolo	Pierce	28906	Per fissare le cellule. Preparare una soluzione all'1% prima dell'uso.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Preparare 2,5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Per il lavaggio di lisato e DNA purificato
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Per tampone di lisi 1. Preparare 1 M, pH 7,5 brodo.
5 M NaCl, grado di biologia molecolare	Nacalai Tesque	06900-14	Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grado di biologia molecolare	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl
glicerolo	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Per tampone di lisi 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Per tampone di lisi 1
Triton X-100, grado di biologia molecolare	Nacalai Tesque	12967-32	Per tampone di lisi 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Per tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl. Preparare 1 brodo M, pH 8.0.
0,1 M EGTA pH neutro	Nacalai Tesque	08947-35	Per tampone di lisi 2
Cocktail di inibitori della proteasi (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Per bloccare la degradazione del
tampone RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Per la lisi cellulare e il lavaggio
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Provetta sonicatrice. Accessorio dell'ultrasuonatore focalizzato
Ultrasuoni focalizzati	Covaris	S220 o E220	Per digerire il DNA in dimensioni adeguate per ChIP-Seq
UltraPure 10%	SDS Thermo Fisher Scientific	15553-027	Per ChIP Tampone di eluizione
RNasi A	Nacalai Tesque	30141-14	Per purificare il DNA dalla proteinasi K del lisato
, ricombinante, grado PCR	Sigma-Aldrich	3115887001	Per purificare il DNA dal lisato
Etanolo	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Prepara una soluzione al 70%
Anticorpo monoclonale anti-FLAG M2 prodotto nel topo	Sigma-Aldrich	F1804	Per purificare la cromatina espressa nelle cellule di interesse
Dynabead M-280 Pecora Anti-Topo IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Questo può essere utilizzato per anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metil istone H3 (K4), anticorpo monoclonale di topo	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Qualsiasi altro anticorpo che funziona per l'analisi ChIP funzionerà
10x Reagente bloccante	Sigma-Aldrich	11096176001	Per il blocco durante la purificazione di affinità
Denhardt' s soluzione	Nacalai Tesque	10727-74	Per il blocco durante la purificazione di affinità
Glicogeno (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Per purificare il DNA dal lisato
Qubit 2.0 Fluorimetro	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Per la quantificazione del DNA isolato
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Per la quantificazione del DNA isolato
Provetta da 0,5 mL	Axygen	10011-830	Per la quantificazione mediante Qubit
Fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Per purificare il DNA dal lisato
Perline AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Perline magnetiche SPRI per la preparazione della libreria
Portaghiaccio in metallo	Funakoshi	IR-1	Per mantenere congelato
il lisato cellulareRaffreddatore di campioni	New England Biolabs	T7771S	Aiuta a fissare le cellule con danni minimi
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Per controllare la qualità dei frammenti di DNA isolati. È possibile utilizzare un altro analizzatore di frammenti.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Fornito con il Bioanalyzer
Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent Technologies	5067-4626	Per verificare la qualità dei frammenti di DNA isolati Kit di
preparazione della libreria KAPA LTP	Roche	07961898001	Fornito con 10 tamponi per la riparazione dell'estremità KAPA, la miscela di enzimi per la riparazione dell'estremità KAPA, il tampone per la coda A KAPA, l'enzima per la coda A KAPA, il tampone per la legatura KAPA, la DNA ligasi KAPA e la soluzione PEG/NaCl
Codici a barre per DNA NEXTflex	Adattatore BIOO Scientific	NOVA-514101	per la preparazione della libreria. Fornito con adattatori per codici a barre DNA e miscela di primer.
Kit di amplificazione per librerie in tempo reale KAPA	Roche	07959028001	Fornito con 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix e standard fluorescenti 2x
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	Per la preparazione della libreria. Inoltre, questo enzima può essere necessario per il kit di amplificazione della libreria in tempo reale KAPA
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 per l'eluizione del DNA
Piastra qPCR a 386 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	4309849	Per la PCR in tempo reale
Sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 7 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485701	Per quantificare la
pellicola adesiva ottica DNA MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4311971	Per PCR in tempo reale
Pellicola adesiva trasparente MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4306311	Per la sigillatura di piastre
Master mix			Combina 1,4 &; L di 10x KAPA Tampone di riparazione fine, 1 & micro; L di KAPA End Repair Enzyme Mix, e 1,6 µ L di H2O
A-taling master mix			Combine 1 µ L di tampone KAPA A-Tailing, 0,6 & micro; L dell'enzima KAPA A-Tailing e 8,4 µ L di H2O
		tampone di legatura	Combine 2 µ L del tampone di legatura KAPA e 6 µ L di H2O
		master PCR in tempo reale	Combina 5 &; micro; L di 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix in tempo reale, 0,35 &; L di PCR Primer Mix (10 µ M ciascuno di primer diretto AATGATACGGCGACCACCGAG e primer inverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), e 3.15 µ L di H2O
PCR master mix			Combine 10 &; micro; L di 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 µ L di PCR Primer Mix e 0,6 µ L di H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Browser del genoma per visualizzare i dati di sequenziamento
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		Un primer per amplificare la regione del promotore dell'olgionucleotide del DNA GAPDH
: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		Un primer per amplificare la regione del promotore di GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	Per quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	Per quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH