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Articolo metodologico

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

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DOI:

10.3791/58307

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3 ottobre 2018

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1Department of Chemistry, Wesleyan University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l'enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.

Abstract

Proteine sensibili all'ossigeno, compresi quegli enzimi che utilizzano ossigeno come substrato, possono hanno ridotto la stabilità quando purificato utilizzando metodi di depurazione aerobica tradizionale. Questo manoscritto illustra i dettagli tecnici coinvolti nel processo di depurazione anaerobica, compresa la preparazione dei tamponi e reagenti, i metodi per cromatografia su colonna in un vano portaoggetti e la desalificazione della proteina prima della cinetica. Sono anche descritti i metodi per la preparazione e l'utilizzo di un elettrodo di ossigeno per eseguire la caratterizzazione cinetica di un enzima che utilizzano ossigeno. Questi metodi sono illustrati usando l'enzima diossigenasi Giuroma90, un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6.

Introduzione

Enzimi che utilizzano ferro o altri metalli per attivare ossigeno sono spesso suscettibili di inattivazione durante il processo di purificazione a causa della loro rimozione dall'ambiente riducente di una cella. Di conseguenza, queste proteine devono essere utilizzate come lisati cellulari, essere sottoposte agli agenti riducenti esterni o essere purificate anaerobicamente per garantire che essi hanno attività enzimatica ottimale1,2,3,4. Per quegli enzimi che sono sensibili all'ossigeno (in particolare ferro-contenenti enzimi), esecuzione di tutte le fasi di purificazione e caratterizzazione mantenendo condizioni anaerobiche sono necessario caratterizzare completamente loro. Questo ha portato i ricercatori a sviluppare configurazioni intero laboratorio entro i confini di anaerobiche alloggiamenti per gli studi che vanno dall'espressione della proteina attraverso cristallografia5,6,7,8 .

Qui, segnaliamo i metodi per la purificazione anaerobica e caratterizzazione cinetica dell'enzima Giuroma90 utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Giuroma90 è un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6 che è legato al LigAB, un dioxygenase di protocatecuate dallo stesso organismo. Entrambi gli enzimi appartengono alla superfamiglia di diossigenasi (PCAD) tipo II protocatecuato che non è stata studiata estesamente a data9, probabilmente in parte a causa di enzimi di questa superfamiglia essendo suscettibile di inattivazione quando purificato utilizzando standard aerobica metodi di purificazione della proteina. Poiché alcuni degli enzimi PCAD visualizzare promiscuità di substrato, mentre altri sono substrato specifico2,10, ulteriore caratterizzazione di questa superfamiglia è necessario individuare fattori determinanti di specificità. Come è stato osservato in diversi enzimi superfamilies11,12,13,14,15, piccole molecole possono alterare attività tramite inibizione competitiva diretta o l'associazione di molecole per separare le tasche allosterici che causa un aumento o diminuzione di attività enzimatica16. Mentre cinetica da solo non può distinguere il percorso di associazione di un modulatore, determinare la grandezza di un cambiamento di attività è importante per comprendere gli effetti. Come tali, metodi per la caratterizzazione cinetica di attività nativa di Giuroma90 e la sua attività in presenza di 4-nitrocatechol (4NC), un composto comunemente utilizzato per caratterizzare e inibire diossigenasi enzimi2,17, 18, sono mostrati.

Giuroma90 è in grado di abbattere gallato, un composto, tramite una reazione di diossigenasi (EDO) extradiol in quale anello di apertura è catalizzata usando ossigeno come uno dei substrati10,19lignina-derivato aromatico. Questa reazione enzimatica si verifica all'interno del contesto della ripartizione della lignina, un aromatico heteropolymer trovato nella parete cellulare delle piante. Lignina può essere depolimerizzato, producendo una varietà di composti aromatici che può essere suddiviso in metaboliti centrale3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol diossigenasi (EDO) catalizzano un reazione su composti aromatici dihydroxylated, cui scissione si verifica adiacente un diolo metallo-coordinato; di apertura dell'anello al contrario, intradiol diossigenasi fendono analoghi composti aromatici tra i due gruppi di idrossile (Figura 1). Evandri, come molti altri metalloenzymes, dispone di un centro di metalli bivalente per coordinamento Fe (II) composto da una due-istidina, uno-carbossilato triade9,34,35. Questi metalloenzimi ossidarsi, tramite autossidazione o basati sul meccanismo di inattivazione, considerando che l'enzima è reso inattivo2,36,37,38.

Nelle procedure sperimentali descritte in questo manoscritto, utilizziamo Giuroma90, un membro della superfamiglia PCAD da SYK-6, il batterio Sphingobium SP., per catalizzare l'aggiunta di ossigeno attraverso il legame C4-C5 di gallato (Figura 2A). La regiochimica di questa scissione è analoga a LigAB, che è un protocatecuato-4,5-diossigenasi (Figura 2B). Finora, le indagini di questo diossigenasi gallate non includono nessun rapporti di composti che inibiscono la Giuroma9010,19,39. Con l'uso di metodi di depurazione aerobica, Giuroma90 ha esibito l'attività variabile, mentre con l'uso di metodi anaerobici siamo riusciti a ottenere costantemente proteina con attività riproducibile. Gli studi cinetici descritti qui mostrano i metodi per la purificazione anaerobica di Giuroma90, caratterizzazione cinetica della reazione di Giuroma90 con gallato e l'inibizione di Giuroma90 di 4-nitrocatechol (4NC).

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Protocollo

1. generale materiali e metodi

  1. Preparare tutti i mezzi necessari come descritto nella tabella 1. Sterilizzare in autoclave a 120 ° c per 15 min. Sterile filtrare la soluzione SOC, dopo l'aggiunta di MgCl2 e glucosio, facendolo passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Regolare il pH della soluzione di brodo Lisogenesi (LB media) del Mugnaio prima della sterilizzazione in autoclave. Integrare la soluzione media LB-Amp dopo sterilizzazione in autoclave con soluzioni sterili di 0,2 mM L-cisteina, quindi 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio per migliorare la solubilità e l'espressione della proteina.
  2. Preparare il Laemmli buffer e buffer di corsa per elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina) come descritto nella tabella 2. Regolare il pH delle soluzioni (utilizzando 1 M HCl e Tris di base per la preparazione di buffer) prima di diluire i componenti ai loro volumi finali.
  3. Preparare i buffer per purificazione della proteina come descritto nella tabella 3. Regolare il pH delle soluzioni (utilizzando 1 M HCl e Tris di base per la preparazione di buffer) prima di diluire i componenti ai loro volumi finali.
  4. Trasferire i buffer preparati in una bottiglia che può essere sigillata con un tappo di gomma di un foro e contiene un tubo di vetro.
    1. Utilizzare un tubo flessibile per collegare il tubo di vetro nel tappo ad una sorgente di vuoto. Lasciare la soluzione degassare sotto pressione negativa per circa 30 minuti continuando a mescolare a velocità media.
    2. Rompere il vuoto seal in primo luogo, quindi spegnere il vuoto. Successivamente, perforare attraverso il tappo di gomma con due aghi di 20G (uno che è abbastanza a lungo per raggiungere il fondo della bottiglia e un ago più breve che può essere utilizzato come uno sfogo di fuga di gas). Bolla in un flusso costante di azoto mentre si mescolano a media velocità per 30 min.
    3. Rimuovere gli aghi e ripetere il degassamento e spumeggiante in azoto per un totale di tre cicli. Al termine, correttamente sigillare la bottiglia con un tappo di gomma solida. Inoltre fissare il fermo con la pellicola di paraffina e filo di rame (20G) e metterli nel vano portaoggetti.
      Nota: Tutti i materiali sono collocati in vano portaoggetti e sottoposti a 3 cicli di spurgo l'anticamera, seguita da aspirazione fuori l'ossigeno e riempirlo con azoto. Buffer utilizzati per la purificazione e la concentrazione può essere ridotta e conservati a tempo indeterminato nel vano portaoggetti.
  5. Preparare la soluzione di Ditionato di sodio sciogliendo circa una spatola (0,31 "x 2", l'estremità più piccola di una spatola di acciaio inox di micro-conico doppio attacco) completa di Ditionato di sodio in circa 1 mL di acqua degassato in una microcentrifuga da 1,5 mL . Sigillare il tubo con la pellicola di paraffina prima della rimozione dalla scatola per guanti.
    Nota: Conservare il Ditionato di sodio solido nel vano portaoggetti per prevenire l'ossidazione.

2. preparazione della colonna di amilosio per purificazione della proteina

  1. Fare un impasto dalla resina di amilosio ad alto flusso (15 mL) combinato con 5 volumi di colonna (75 mL) di tampone di colonna di amilosio. Trasferire l'impasto di resina in due bottiglie da 50 mL del siero e sigillare ogni bottiglia con un setto di gomma. Forare un 20G, ago di 305 mm attraverso i setti e bolla azoto nel liquame per circa 1 minuto per rimuovere l'ossigeno dalla sospensione. Trasferire la resina e la soluzione contenente proteine nel portaoggetti.
  2. In glove box, versare la resina in una colonna di borosilicato 2 x 30 cm dotata di un semplice rubinetto, permettendo la resina di stabilirsi e creare un letto di livello. Sgocciolare il buffer di colonna ed equilibrare la colonna con 3 volumi di colonna (~ 30 mL in totale) del buffer di colonna degassato amilosio utilizzando gas azoto pressurizzato a spingere il buffer attraverso la resina a circa 1 goccia/s o 5 mL/min, fino a quando il solvente è appena sopra la letto di resina.
    Nota: Dopo che la proteina è eluito (Vedi punto 3.5 qui sotto), la resina di colonna di amilosio viene rigenerata mediante lavaggio con volume 1 colonna (10 mL) di acqua, quindi volume 1 colonna di 1% sodio dodecil solfato (SDS) e, infine, 3 volumi di colonna (30 mL) di acqua. Questo passaggio può essere completato all'esterno della scatola di guanto. La resina di colonna è conservata a 4 ° C in etanolo al 20% e può essere rigenerata fino a 5 volte.

3. proteine espressione e purificazione anaerobica di Giuroma90

Nota: Il gene Giuroma90 in commercio è stato sintetizzato, essere stata posta in animali-15b, pET-32a e pMAL-c5x vettori utilizzando la restrizione NdeI e BamHI clonazione siti.

  1. Completare l'analisi di espressione di proteina secondo le linee guida del produttore per determinare le condizioni corrette per espressione su larga scala (descritti in breve sotto).
    1. Trasformare i plasmidi contenenti Giuroma90 commercialmente fatti, chimicamente competente e. coli BL21 (DE3) cellule, secondo le istruzioni del produttore. In breve, scongelare le cellule in ghiaccio per 10 minuti, aggiungere circa 10-50 ng di DNA plasmidico alla miscela delle cellule, scossa di calore le cellule a 42 ° C per 10 s e li Incubare in ghiaccio per un ulteriore 5 min media SOC aggiungere per ottenere un volume finale di 1 mL e permettere la cellule a scuotere (~ 200 giri/min) a 37 ° C per 60 min. Un piatto di LB-Amp, aggiungere e diffondere 100 µ l della soluzione cella e incubare per una notte a 37 ° C.
    2. Selezionare una singola unità formanti colonie dalla piastra dopo incubazione overnight e usare questa colonia per inoculare 10 mL di terreno LB-Amp. Crescere le cellule durante la notte, con agitazione (~ 200 giri/min) a 37 ° C.
    3. A 10 mL di media, aggiungere 100 µ l della soluzione di crescita durante la notte e scuotere i nuovi media come descritto al punto 3.1.2 a 37 ° C. Quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è compreso tra 0.4-0.8, aggiungere isopropilico di β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per ottenere una concentrazione di soluzione finale di 1 mM.
    4. Immediatamente rimuovere un'aliquota di 1 mL della soluzione e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con etichettato tempo = 0 ore. Girare il tubo a 15.000 x g per 10 min agglomerare le cellule. Dopo la filatura, rimuovere il supernatante e memorizzare le cellule a 4 ° C.
    5. Rimuovere ulteriori aliquote (1 mL ciascuno) a intervalli di tempo dopo l'aggiunta di IPTG (in genere a 5, 10, 12, 18 e 24 h). Come descritto al punto 3.1.4, ogni tubo centrifugo, decantare il supernatante e memorizzare le cellule a 4 ° C.
    6. Una volta che tutte le aliquote sono ottenute, risospendere le cellule da ogni timepoint in 30 µ l di soluzione di estrazione proteica batterica, li Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti e centrifugare le provette a 15.000 × g per 5 min separare il solubili e insolubili proteine.
    7. Trasferire la soluzione di proteina solubile ad un nuovo tubo del microcentrifuge e risospendere il pellet insolubile rimanente con 30 µ l di soluzione di estrazione proteica batterica.
    8. Unire i 30 µ l di ciascuna soluzione (sia solubile che insolubile soluzioni per ogni timepoint) con un volume equivalente di tampone di Laemmli, poi visualizzare su un gel di SDS-PAGE40. Selezionare le condizioni poste per le corsie contenente le bande di dimensioni corrette nella frazione solubile per l'espressione della proteina su larga scala e purificazione.
      Nota: Poiché la proteina solubile minimal inizialmente è stata generata utilizzando le condizioni di cui sopra, i vari supplementi sono stati aggiunti per verificare gli effetti sull'espressione della proteina solubile, con 0,2 mM L-cisteina e solfato ferroso dell'ammonio 0,1 mM mostrando migliorata della proteina espressione. Secondo questa schermata di espressione della proteina, un vettore di espressione appropriata per la produzione di sostanza solubile di Giuroma90 era pMAL-c5x vettoriale.
  2. Dopo la trasformazione in Escherichia coli BL21 (DE3), fare un magazzino di Giuroma90/pMal-c5x combinando 900 µ l di coltura batterica (coltivato pernottamento con agitazione a 200 giri/min e 37 ° C) con 100 µ l di 80% glicerolo. Conservare lo stock a-80 ° C in un tubo criogenico.
    Nota: Fare un nuovo congelati stock circa ogni 6-8 mesi.
  3. Utilizzare una pipetta per raschiare le cellule dallo stock congelati e avviare una coltura batterica, crescendo durante la notte in 5 mL di terreno LB-Amp a 37 ° C con agitazione. Inoculare 1,5 litri di media LB-Amp in un pallone da 2 L a 37 ° C e 200 giri/min, utilizzando la coltura batterica coltivata durante la notte.
    Nota: A causa della sensibilità osservata della proteina all'ossigeno, è stato trovato quello spazio di testa ridotto nella boccetta e moderata agitazione velocità migliorata proteina resa per espressione su larga scala.
  4. Indurre l'espressione della proteina quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è compreso tra 0.4-0.8 con 1 mM IPTG e completati con 0,2 mM L-cisteina e 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio. Abbassare la temperatura di incubazione a 30 ° C e agitare a 200 giri/min. Rotazione verso il basso le cellule tramite centrifugazione dopo post-induzione 24h a 4.700 x g per 10 min e scartare i media abbiamo trascorso.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di buffer di amilosio colonna per ogni 1,5 L di crescita, seguita dall'aggiunta di 1 mg di lisozima. Agitare per 20 minuti sul ghiaccio.
    Nota: Ulteriori buffer possono essere aggiunti se la soluzione è troppo viscosa, come proteina soluzioni che sono troppo viscosi potrebbero interferire con il passaggio seguente di omogeneizzazione.
  6. Lisare la soluzione di sedimento cellulare tramite omogeneizzazione ad alta pressione con 3-5 passa a circa 15.000 psi. La proteina di trasferimento di un tubo di centrifuga da 50 mL e svuotare lo spazio di testa con azoto per 1 min. Poi, centrifugare la cella lysata a 20.000 x g per 40 min rimuovere i residui insolubili.
    Nota: Omogeneizzazione successo provoca la proteina a micelle forma come esso scorre attraverso il tubo e nel pallone di raccolta, e la soluzione appare come un colore marrone-grigio traslucido. Mantenere la proteina omogeneizzata sul ghiaccio durante tutto il processo.
  7. Dopo la centrifugazione, trasferimento del surnatante in una provetta da 50 mL (più di uno potrebbe essere necessario), richiudere la provetta con un setto di gomma e con un ago di calibro 20, lentamente gas di azoto di bolla attraverso la soluzione per 2 min in assenza di ossigeno. Avvolgere il setto con pellicola di paraffina e ulteriormente fissarla con filo di rame e portare il supernatante in glove box insieme con i materiali di colonna.
  8. Equilibrare la colonna (Vedi punto 2.3) e caricare la proteina surnatante sulla colonna. Raccogliere il flusso continuo in frazioni di 5ml sotto azoto pressurizzato moderatamente (1 goccia al secondo o circa 5 mL/min). Successivamente, lavare la colonna usare un'altra colonna 3 volumi di tampone di colonna di amilosio e raccogliere manualmente le frazioni di 3 mL in provette di vetro sotto azoto pressurizzato moderatamente (circa 5 mL/min). Eluire la proteina utilizzando 5 volumi di colonna (~ 50 mL) di tampone di eluizione e raccogliere manualmente le frazioni di 3 mL in pressione di azoto moderato (circa 5 mL/min).
    Nota: Le frazioni in alternativa possono essere raccolti tramite filtrazione a gravità. Circa 12 frazioni di eluizione devono essere raccolti.
  9. Raccogliere 30 aliquote µ l delle frazioni e rimuoverli dalla casella di guanto per consentire la visualizzazione di proteine contenenti frazioni tramite analisi SDS-PAGE.
    Nota: La raccolta differenziata rimanga nel cassetto portaoggetti per tutta la durata del test. Giuroma90 purificata in genere eluisce dalla colonna in frazioni 3 a 5.

4. anaerobica proteina concentrazione/Buffer Exchange

  1. Assemblare il concentratore cellula pressurizzata, mescolato con un filtro a membrana cellulosa ricostituito 76 mm (taglio 10 kDa). Aggiungere una quantità sufficiente di etanolo al 20% nel concentratore per mantenere la membrana bagnata come il concentratore assemblato viene trasferito nel portaoggetti.
    Nota: Assicurarsi che non ci sono lacrime nella membrana e che l'o-ring non è rugosa.
  2. Dopo aver portato il concentratore cellula agitata in glove box, lavare la soluzione di etanolo fuori la membrana con acqua. Tappo e pressurizzare la cella agitata per pulire la tubazione e la membrana di eventuale acqua in eccesso.
  3. Aggiungere tutte le frazioni contenenti proteine come determinato da SDS-PAGE (Figura 3) al concentratore. Aggiungere sufficiente buffer di scambio per ottenere 150 mL di volume di soluzione di proteine totali.
  4. Pressurizzare la camera di agitata cella usando la linea esterna di2 N e concentrare la proteina a 50 mL con moderata velocità di agitazione.
    Nota: Realizzare una concentrazione di 50 mL richiede circa 20 min.
  5. Supplemento 100 mL di tampone di scambio con 0,1 mM dithiothreitol (DTT) e 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio, aggiungere la soluzione alla cella agitata e concentrare la proteina ad un volume totale di 50 mL con una moderata velocità di agitazione.
  6. Quando la soluzione raggiunge un volume di 50 mL, aggiungere nel buffer di scambio completato una volta di più, ma concentrare la soluzione per un volume totale di 10 mL con moderata velocità di agitazione.
  7. Filtrare il concentrato della proteina usando un 0,45 µm poro formato siringa filtro e aliquota nelle provette di reazione a catena (pcr) polimerasi individuali 0,2 mL (ciascuno contenente circa 150 µ l di soluzione della proteina). Rimuovere le aliquote ridotte da glove box e immediatamente flash congelarli con azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.

5. Giuroma90 di desalificazione

  1. Svuotare il sacchetto di guanto con gas azoto per circa 1,5 ore prima dell'uso.
  2. Scongelare un'aliquota di 150 µ l di proteina purificata di Giuroma90 dentro la borsa per i guanto, sul ghiaccio.
  3. Mentre la proteina si scioglie, preparare un piccolo peso, desalificazione colonna contenente 3 mL di gel di dissalazione grossolana Sephadex G-25 in una colonna di borosilicato 9 mL. Lavare la colonna con 2 volumi di colonna (~ 6 mL) di degassato desalificare buffer.
    Nota: Sostituire il gel di dissalazione quando c'è un cambiamento in gel di colore dal bianco al giallo (dopo circa 7 usi).
  4. Caricare il Giuroma90 scongelati sulla colonna tramite un processo controllato di gravità. Scartare il flusso continuo. Eluire la proteina con circa 5 mL di tampone di desalificazione.
    Nota: La pressione dal serbatoio continuamente riempire la borsa di guanto influenzerà il tasso a cui le soluzioni gocciolare dalla colonna.
  5. Per la determinazione iniziale di eluizione di proteina dalla colonna, raccogliere 12 fiale/eluizioni (contenente 3 gocce per flaconcino). Sigillato con un setto di gomma, rimuoverli dalla borsa per i guanto e test per la presenza della proteina sia direttamente (attraverso l'analisi del gel di SDS-PAGE) o indirettamente (attraverso l'esame dell'attività di ogni frazione).
    Nota: In genere, le frazioni sono testate singolarmente per attività, come descritto al punto 7.1, con la più grande attività corrispondente alla frazione con la maggiore concentrazione di proteina attiva. Giuroma90 eluisce solitamente a partire nella goccia 7, dopo il quale vengono raccolti i seguenti 9 gocce di proteina dissalata. Aliquote di proteina sono conservate nel ghiaccio durante le misure cinetiche (punti 7.1-7.4).

6. preparazione dell'elettrodo di ossigeno

  1. Lucidare l'anello d'argento anodo e catodo di platino con elettrodo pulita e un cotton fioc inumidito fino a quando non ci sono segni visibili di depositi di ossido nero.
  2. Con le forbici, tagliare circa un 1,5-pollice quadrato di distanziale carta (o rotolamento carta da sigarette, che funziona altrettanto bene). Quindi, tagliare 1) piccoli triangoli su ogni faccia del quadrato e 2) fessure negli angoli per facilitare la disposizione dell'elettrodo.
  3. Aggiungere 5 gocce di una soluzione di KCl 50% nell'anodo di argento di groove e collegarli in modo da formare un anello continuo di soluzione. Aggiungere 2 gocce di soluzione di KCl al 50% alla parte superiore dell'elettrodo di platino. Posizionare la carta distanziale in cima l'elettrodo di platino e lisciare fuori la carta di distanziatore in modo bolle d'aria.
    Nota: Prestare attenzione per evitare di strappare la carta di distanziatore.
  4. Tagliare un pezzo della membrana PTFE (politetrafluoroetilene) 30m S4 che è circa 2 pollici di lunghezza e posizionarlo sopra la carta del distanziatore. Tagliare i bordi della membrana in modo che siano allineati con l'anello esterno dell'elettrodo.
  5. Utilizzando l'applicatore o-ring, spingere l'o-ring piccolo sopra l'elettrodo per garantire il distanziale carta e membrana sopra l'elettrodo. Inserire l'o-ring più grande sulla scanalatura circolare dell'elettrodo, assicurando che non c'è nessuna membrana sotto di esso. Far scorrere la camera superiore dell'elettrodo sulla base e avvitare i due insieme.
    Nota: I due sono avvitati correttamente se nessun bastone di bolle di aria ai lati della camera.
  6. Posizionare l'elettrodo montato sulla sua base e collegare l'elettrodo al sistema di monitoraggio. Avviare il programma di controllo di elettrodo e calibrare l'elettrodo eseguendo il protocollo di calibrazione di fase liquida (Figura 4A). La variabile di temperatura dovrebbe essere la temperatura della stanza in cui viene eseguito l'esperimento, e la pressione ambiente variabile è dipenda sulla regione e dati meteo.
    Nota: Pressione ambiente possa essere ottenute da un bollettino meteo per la regione.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone Tris 25 mM per l'alloggiamento di elettrodo, inserire lo stantuffo, iniziare la calibrazione di una soluzione saturata di ossigeno e regolare la velocità dell'agitatore a 100. Dopo che l'elettrodo si stabilizza, il set-point di calibrazione per l'ossigeno in soluzione satura è determinato (Figura 4B).
  8. Senza rimuovere lo stantuffo, utilizzare una siringa di ago e 1ml di 1.2 x 40 mm per iniettare circa 1 mL di soluzione di sodio ditionito nell'alloggiamento, facendo attenzione a evitare di aggiungere eventuali bolle d'aria (Figura 4). Utilizzare un tappo di gomma per sigillare la camera di elettrodo immediatamente dopo l'aggiunta di Ditionito di sodio.
  9. Consentire la calibrazione continuare fino a quando non è utilizzato tutto l'ossigeno e il programma è completato e salvare la calibrazione (Figura 4). Aspirare la soluzione dalla camera e sciacquare il pistone e la camera con acqua deionizzata 5 - 6 volte a garantire la rimozione completa del Ditionito di sodio. Durante il risciacquo, utilizzare un tubo di plastica dotato di un puntale collegato ad un termos di braccio laterale. Evitare di danneggiare la membrana.

7. cinetiche dosaggi utilizzando l'elettrodo di ossigeno

  1. Identificare le aliquote dissalate contenenti proteina attiva di test in serie 1 µ l di soluzione di enzima per attività in una soluzione di tampone Tris 25 mM, con pH 7,5 e contenente 100 µM gallato. Utilizzare il aliquot(s) con la più grande attività osservate per gli esperimenti restanti. (Vedi punto 5.5.1)
  2. Determinare la velocità della reazione enzimatica misurando il consumo di O2 utilizzando una O2-elettrodo di Clark-tipo sensibile con l'integrazione di computer tramite l'unità di controllo dell'elettrodo.
    1. Per ogni dati di cinetica punto di misurazione di Giuroma90, aggiungere 1 mL di tampone Tris 25 mM (pH 7,5) alla camera di elettrodo. Aggiungere un volume calcolato di una soluzione di riserva di 25 mM di gallato nel buffer di Tris per ottenere la concentrazione di substrato finale desiderata (0.05-25 mM).
      Nota: Preparare ogni giorno fresche soluzioni di riserva di gallato e composti inibitori con acqua e regolare il pH a 7,5 con l'aggiunta di 0,1 mM NaOH, se necessario.
    2. Dopo 10 s di mescolatura per consentire la miscelazione della soluzione, tenuta la camera con lo stantuffo lentamente e avvitare la parte superiore. Un tessuto pulito può essere utilizzato per assorbire il liquido in eccesso che è stato spostato dalla camera. Consentire l'elettrodo equilibrare dove può produrre una misura stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno 1 minuto prima di procedere con l'aggiunta dell'enzima (il tasso di consumo sfondo O2 ± 0,5 µM/min).
    3. Usando un gas stretto 10 µ l siringa, aggiungere circa 1 µ l di enzima (circa 3-7 µM enzima) alla camera di elettrodo attraverso lo stantuffo.
      Nota: La quantità di enzima può essere aumentata o diminuita in risposta all'attività osservata dell'aliquota specifica per consentire velocità di reazione essere sufficiente.
    4. Calcolare la velocità di reazione basata sul versante delle prime 30 s di dati lineari dopo l'aggiunta di enzima e corretto per sfondo il consumo di O2 usando il 30 s di dati immediatamente prima dell'aggiunta di enzima. Il tasso di catalisi è pari al tasso di consumo di O2 (Figura 5A).
    5. Dopo la raccolta dei dati per una concentrazione di substrato dato tasso, svuotare la vaschetta di elettrodo mediante l'aspirazione utilizzando un tubo di plastica collegato ad un termos di braccio laterale e risciacquarle ripetutamente con acqua per 4-6 cicli. Impostazione della soluzione nell'elettrodo come descritto al punto 7.2.1 utilizzando una nuova concentrazione di substrato.
    6. Variare le concentrazioni di substrato in modo non ordinato e replicare durante tutto il corso dell'esperimento all'account per diminuzioni nell'attività enzimatica con tempo (figura 5B).
      Nota: Quando replicati di una concentrazione specifica vengono eseguiti e dimostrano più di una diminuzione del 30% nel tasso rispetto ad una prima fase, ulteriori analisi non devono essere eseguite con batch di enzima. In genere, dopo l'esecuzione del 30-40, l'enzima dimostra una diminuzione del 30% nell'attività.
    7. Determinare i parametri cinetici, kgatto (la costante catalitica per la conversione del substrato in prodotto) e Km (la costante di Michaelis, funzionalmente definita come la concentrazione di substrato in cui la velocità iniziale è metà della velocità massima), mediante un montaggio di minimi quadrati dei dati da ognuna delle concentrazioni di substrato per l'equazione di Michaelis−Menten (Figura 6) tramite GraphPad Prism.
  3. Aggiungere 4-nitrocatechol (4NC) per testare il suo impatto sulla cinetica di dioxygenation e determinare la costante di inibizione (Kho) con Giuroma90. Per ogni condizione di reazione, soluzioni di Tris (50 mM), gallato (25 mM) e 4NC di riserva (25 mM) vengono combinati e diluito con acqua per produrre una soluzione di 2 mL di tampone Tris 25 mM (pH 7.5) con 1 mM di epigallocatechin e variando le concentrazioni di 4NC. Il volume di 4NC è stato variato per ottenere la concentrazione desiderata finale inibitore (0,05-20 mM).
    1. Dopo 10 secondi di agitazione per consentire la miscelazione della soluzione, porre lo stantuffo nella camera lentamente e avvitare la parte superiore. Un tessuto pulito può essere utilizzato per assorbire il liquido in eccesso che è stato spostato dalla camera. Consentire l'elettrodo equilibrare e produrre una misura stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno 1 minuto prima di procedere con l'aggiunta dell'enzima (il tasso di consumo sfondo O2 ± 0,5 µM/min).
    2. Come descritto in precedenza, aggiungere la proteina (punto 7.2.3), determinare il tasso di reazione (punto 7.2.4) e reimpostare l'elettrodo per la condizione successiva.
    3. Come parte di questa serie di esperimenti, determinare la velocità di reazione in assenza di inibitore più volte. Determinare l'inibizione di normalizzazione dei tassi di consumo di ossigeno in presenza di varie concentrazioni di inibitore con il substrato di 1 mM e l'assenza di inibitore (v/vo).
    4. Montare l'inibizione di gallato dioxygenation equazione 7.3 a e quindi i dati di inibizione all'equazione 7.3 utilizzando un programma di grafica (Figura 7).
  4. Determinare la concentrazione di enzima preciso per ogni esperimento eseguendo un'analisi di Bradford dopo il completamento di tutte le esecuzioni di cinetiche.
    Nota: Tutti i prezzi sono stati corretti per la concentrazione dell'enzima. Questo passaggio non deve necessariamente essere fatto in un guanto sacchetto o scatola per guanti.

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Risultati

Viene mostrato l'analisi del gel di SDS-PAGE delle singole frazioni da purificazione del costrutto Giuroma90-maltosio binding protein (MBP) fusione (Figura 3). Il gel rivela che la proteina è pura (MW = 91.22 kDa), tranne la presenza di Giuroma90 (MW = 49.22 kDa) e dominio della proteina MBP (kDa 42) spaccati da altro. Le frazioni E2 ed E3 sono stati selezionati per la concentrazione (punto 4.2).

Ri...

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Discussione

I passaggi critici nell'ottenere attiva, purificata proteina Giuroma90 coinvolgono la formazione e il mantenimento del sito attivo Fe (II) ridotto nell'enzima. Come tale, correggere le prestazioni dell'induzione, purificazione, concentrazione e dissalazione passaggi sono essenziali per ottenere con successo enzima attivo. Che induce l'espressione della proteina in presenza di solfato ferroso dell'ammonio di 1 mM assicura che Fe (II) correttamente è incorporato nel sito attivo del Giuroma90. Questo metodo è ispirato da st...

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Dichiarazioni

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare la dottoressa Camille Keller di Wesleyan University per il supporto tecnico. Grazie professore Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk dalla University of British Columbia, come pure Christian Whitman dall'Università del Texas ad Austin, speciale per i loro consigli per quanto riguarda i metodi di purificazione della proteina anaerobica e l'utilizzo di un O2 -elettrodo sensibile.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Isopropilβ-D-1-tiogalattopiranodiseOro Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Blu brillante R-250Bio-Rad161-0400
Persolfato di ammonioBio-Rad161-0700
30% acrilammideBio-Rad161-0158
N,N'tetrametil-etilendiamminaBio-Rad161-0801
Resina di amilosio ad alto flussoNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) cellule di Escherichia coli competentiNew England BiolabsC2527I
L-cisteinaSigma AldrichC7352
acido gallicoSigma AldrichG7384
4-nitrocatecoloSigma AldrichN15553
ferroso solfato di ammonioMallinckrodt5064
Ditionito di sodioAlfa Aesar33381-22
flaconi di siero wheatonFisher Scientific06-406G
Filtro per siringa Acrodisc PF da 25 mm con membrana Supor PallCorportation4187
Concentratore di cellule agitate Amicon da 400 mlEMD MilliporeUFSC40001
Filtro a membrana in cellulosa ricostituita da 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa EMDMilliporePLGC07610
DL-ditiotreitoloGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 colonna gal a desalinizzazione grossolanaGE Healthcare17-0033-01
Fiale a crimpare da 2 mLFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control UnitHansatech InstrumentsOXYG1 Plus
Camera per elettrodi di ossigenoHansatech InstrumentsDW1
Disco per elettrodiHansatech Instruments S1
PTFE (0,0125 mmX25mm) Bobina da 30 mHansatech InstrumentsS4
Kit di pulizia per elettrodiHansatech InstrumentsS16
Carta distanziatriceZig Zagdisponibile in qualsiasi stazione di servizio
Scatola a guanti Dri-Lab serie LuiVuoto/Atmosfere Azienda
HE-493 Dri-TrainVuoto/Atmosfere Azienda
Spatola in acciaio inossidabile micro-conica a doppia estremitàFisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Colonna economicaFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, modello 701 N SYR, cementato NDL 26s ga, 2 pollici, punto stlye 2 siringheHamilton80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy ColumnFisher ScientificK420401-1505
Emulsionsiflex-C5 omogeneizzatore ad alta pressioneAvestin
B-PER Reagente completo per l'estrazione di proteine battericheThermo Fisher Scientific89821
Lisozima da albume d'uovo di gallinaSigma Aldrich12650-88-3
Sodio dodecil solfatoThermo Fisher Scientific151-21-3
ampicillinaSigma Aldrich7177-48-2
TriptoneFisher ScientificBP-1421-500
Estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-2
Clorurodi sodioFisher ScientificS271-10
Cloruro di potassioFisher ScientificP217-3
Cloruro di magnesioFisher ScientificM33-500
DestrosioFisher ScientificD16-3
Idrossido di sodioFisher ScientificS318-1
Tris cloridratoFisher ScientificBP153-500
MaltosioFisher ScientificBP684-500
GlicinaFisher ScientificG46-500

Riferimenti

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