Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l'enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.
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Articolo metodologico
Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteine sensibili all'ossigeno, compresi quegli enzimi che utilizzano ossigeno come substrato, possono hanno ridotto la stabilità quando purificato utilizzando metodi di depurazione aerobica tradizionale. Questo manoscritto illustra i dettagli tecnici coinvolti nel processo di depurazione anaerobica, compresa la preparazione dei tamponi e reagenti, i metodi per cromatografia su colonna in un vano portaoggetti e la desalificazione della proteina prima della cinetica. Sono anche descritti i metodi per la preparazione e l'utilizzo di un elettrodo di ossigeno per eseguire la caratterizzazione cinetica di un enzima che utilizzano ossigeno. Questi metodi sono illustrati usando l'enzima diossigenasi Giuroma90, un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6.
Introduzione
Enzimi che utilizzano ferro o altri metalli per attivare ossigeno sono spesso suscettibili di inattivazione durante il processo di purificazione a causa della loro rimozione dall'ambiente riducente di una cella. Di conseguenza, queste proteine devono essere utilizzate come lisati cellulari, essere sottoposte agli agenti riducenti esterni o essere purificate anaerobicamente per garantire che essi hanno attività enzimatica ottimale1,2,3,4. Per quegli enzimi che sono sensibili all'ossigeno (in particolare ferro-contenenti enzimi), esecuzione di....
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Protocollo
1. generale materiali e metodi
- Preparare tutti i mezzi necessari come descritto nella tabella 1. Sterilizzare in autoclave a 120 ° c per 15 min. Sterile filtrare la soluzione SOC, dopo l'aggiunta di MgCl2 e glucosio, facendolo passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Regolare il pH della soluzione di brodo Lisogenesi (LB media) del Mugnaio prima della sterilizzazione in autoclave. Integrare la soluzione media LB-Amp dopo sterilizzazione in autoclave con soluzioni sterili di 0,2 mM L-cisteina, quindi 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio per migliorare la solubilità e l'espressione della proteina.
- Preparare il Laemmli buffer....
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Risultati
Viene mostrato l'analisi del gel di SDS-PAGE delle singole frazioni da purificazione del costrutto Giuroma90-maltosio binding protein (MBP) fusione (Figura 3). Il gel rivela che la proteina è pura (MW = 91.22 kDa), tranne la presenza di Giuroma90 (MW = 49.22 kDa) e dominio della proteina MBP (kDa 42) spaccati da altro. Le frazioni E2 ed E3 sono stati selezionati per la concentrazione (punto 4.2).
Ri.......
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Discussione
I passaggi critici nell'ottenere attiva, purificata proteina Giuroma90 coinvolgono la formazione e il mantenimento del sito attivo Fe (II) ridotto nell'enzima. Come tale, correggere le prestazioni dell'induzione, purificazione, concentrazione e dissalazione passaggi sono essenziali per ottenere con successo enzima attivo. Che induce l'espressione della proteina in presenza di solfato ferroso dell'ammonio di 1 mM assicura che Fe (II) correttamente è incorporato nel sito attivo del Giuroma90. Questo metodo è ispirato da st.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare la dottoressa Camille Keller di Wesleyan University per il supporto tecnico. Grazie professore Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk dalla University of British Columbia, come pure Christian Whitman dall'Università del Texas ad Austin, speciale per i loro consigli per quanto riguarda i metodi di purificazione della proteina anaerobica e l'utilizzo di un O2 -elettrodo sensibile.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Isopropilβ-D-1-tiogalattopiranodise | Oro Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Blu brillante R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Persolfato di ammonio | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% acrilammide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetrametil-etilendiammina | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Resina di amilosio ad alto flusso | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) cellule di Escherichia coli competenti | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cisteina | Sigma Aldrich | C7352 | |
| acido gallico | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatecolo | Sigma Aldrich | N15553 | |
| ferroso solfato di ammonio | Mallinckrodt | 5064 | |
| Ditionito di sodio | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| flaconi di siero wheaton | Fisher Scientific | 06-406G | |
| Filtro per siringa Acrodisc PF da 25 mm con membrana Supor Pall | Corportation | 4187 | |
| Concentratore di cellule agitate Amicon da 400 ml | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| Filtro a membrana in cellulosa ricostituita da 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa EMD | Millipore | PLGC07610 | |
| DL-ditiotreitolo | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 colonna gal a desalinizzazione grossolana | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| Fiale a crimpare da 2 mL | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Camera per elettrodi di ossigeno | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Disco per elettrodi | Hansatech Instruments S1 | ||
| PTFE (0,0125 mmX25mm) Bobina da 30 m | Hansatech Instruments | S4 | |
| Kit di pulizia per elettrodi | Hansatech Instruments | S16 | |
| Carta distanziatrice | Zig Zag | disponibile in qualsiasi stazione di servizio | |
| Scatola a guanti Dri-Lab serie Lui | Vuoto/Atmosfere Azienda | ||
| HE-493 Dri-Train | Vuoto/Atmosfere Azienda | ||
| Spatola in acciaio inossidabile micro-conica a doppia estremità | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Colonna economica | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μ L, modello 701 N SYR, cementato NDL 26s ga, 2 pollici, punto stlye 2 siringhe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsionsiflex-C5 omogeneizzatore ad alta pressione | Avestin | ||
| B-PER Reagente completo per l'estrazione di proteine batteriche | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lisozima da albume d'uovo di gallina | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodio dodecil solfato | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillina | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Triptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Cloruro | di sodioFisher Scientific | S271-10 | |
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Cloruro di magnesio | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Destrosio | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Idrossido di sodio | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris cloridrato | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltosio | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glicina | Fisher Scientific | G46-500 |
Riferimenti
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A.
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Ristampe e permessi
