Articolo metodologico

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

DOI:

10.3791/58310

⸱

9 novembre 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Abstract

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Vescicole extracellulari (EVs) sono recentemente scoperti componenti sottocellulari che svolgono i ruoli importanti in molti biologico le funzioni di segnalazione durante gli stati fisiologici e patologici. L'isolamento del SVE continua ad essere una grande sfida in questo campo, a causa delle limitazioni intrinseche di ogni tecnica. L'ultracentrifugazione differenziale con metodo di centrifugazione su gradiente di densità è un approccio comunemente utilizzato ed è considerato come la procedura di gold standard per l'isolamento di EV. Tuttavia, questa procedura è che richiede tempo, lavoro ad alta intensità e provoca generalmente bassa scalabilità, che potrebbe non essere adatto per piccoli volumi di campioni come fluido di lavaggio broncoalveolare. Dimostriamo che un metodo di isolamento di centrifugazione di ultrafiltrazione è semplice ed efficiente in tempo e lavoro ancora fornisce un recupero ad alta resa e purezza. Proponiamo che questo metodo di isolamento potrebbe essere un metodo alternativo che è adatto per l'isolamento di EV, specialmente per piccoli volumi di campioni biologici.

Introduzione

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Gli esosomi sono il più piccolo sottoinsieme di EVs, 50 – 200 nanometro di diametro ed hanno funzioni biologiche attraverso una gamma diversificata di segnalazione processi1,2,3,4,5. Regolano l'omeostasi cellulare e tissutale soprattutto facilitando la comunicazione intercellulare attraverso molecole di carico quali lipidi, proteine e acidi nucleici6,7,8,9 . Un passo fondamentale nella ricerca di EV è il processo di isolamento. Ultracentrifugazione differenziale (UC), con o senza centrifugazione in gradiente di densità (DGC), è considerato l'approccio di gold standard, ma questo metodo comporta limitazioni principali, compresi tassi di recupero EV inefficienti e scalabilità basso10 , 11 , 12, che limitano il suo utilizzo migliore ai più grandi campioni di volume, come gli esemplari della produzione esosomi surnatante o alta coltura cellulare. I vantaggi e gli svantaggi di altri metodi, come l'esclusione di dimensione di ultrafiltrazione o cromatografia di immunoaffinità isolamento da perline o colonne e microfluidica, sono ben descritti e moderne procedure aggiuntive sono state sviluppate per superare e ridurre al minimo le limitazioni tecniche in ogni approccio11,12,13,14,15. Altri hanno indicato che una centrifugazione di ultrafiltrazione (UFC) con una membrana nanoporosa nell'unità filtro è una tecnica alternativa che fornisce purezza paragonabile a un UC metodo16,17,18. Questa tecnica potrebbe essere considerata come uno dei metodi alternativi di isolamento.

Fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) contiene SVE che possiedono numerose funzioni biologiche in varie circostanze respiratorie19,20,21,22. Lo Studio SVE BALF derivato comporta alcune sfide a causa dell'invasività della procedura broncoscopia in esseri umani, così come una quantità limitata di recupero liquido di lavaggio. In piccoli animali da laboratorio come topi, solo pochi millilitri possono essere recuperati in condizioni normali del polmone, anche meno in polmoni infiammati o fibrotica23. Di conseguenza, raccogliendo una quantità sufficiente di BALF per EV isolamento da un ultracentrifugazione differenziale per applicazioni a valle potrebbe non essere fattibile. Tuttavia, isolando corretta EV popolazioni è un fattore cruciale per lo studio delle funzioni biologiche EV. Il delicato equilibrio tra efficienza ed efficacia continua ad essere una sfida in metodi di isolamento EV ben stabiliti.

In questo studio, dimostriamo che un approccio di ultrafiltrazione centrifugo, utilizzando un'unità di filtro nanomembrana 100 kDa peso molecolare cut-off (MWCO), è adatto per piccoli volumi di campioni biologici quali BALF. Questa tecnica è semplice, efficiente e fornisce ad alta purezza e scalabilità per supportare lo studio di BALF derivato EVs.

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Protocollo

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L'utilizzazione degli animali e tutte le procedure di animali sono state approvate dai comitati di uso (IACUC) al Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) e istituzionali Animal Care.

1. murino lavaggio broncoalveolare fluido (BALF) raccolta e preparazione

  1. Collezione di BALF
    1. Eutanasia topi con un cocktail di ketamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) seguita da dislocazione cervicale per via intraperitoneale.
    2. Inserire un angiocatheter 22 G nella trachea. Collegare una siringa da insulina contenente 1 mL (mL) di soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco sterile ghiacciata (DPBS) e instillare 1 mL di DBPS in entrambi i polmoni attraverso la angiocatheter.
    3. Ritirare lentamente lo stantuffo della siringa per recuperare BALF e dispensare il BALF in una provetta conica da 50 mL. Mantenere il BALF sul ghiaccio.
    4. Ripetere i passaggi da 1.1.2 e 1.1.3 3 volte (4 volte in totale in ogni mouse).
      Nota: Circa 0,8 mL viene generalmente recuperato per millilitro di instillazione. Inoltre, le seguenti operazioni possono essere eseguite per singoli topi (cioè, 3 mL di BALF), ma il pool di campioni multipli di BALF permetterà l'isolamento di un lotto più ampio di EVs per la coerenza in esperimenti a valle.
  2. Preparazione di BALF
    1. Piscina BALF da 25 topi e dividerlo in due insiemi uguali (~ 35 mL ogni aliquota).
    2. Centrifugare il BALF a 400 x g, a 4 ° C per 5 min, per rimuovere le cellule e altri detriti cellulari e raccogliere il surnatante.
    3. Centrifugare il supernatante a 1.500 x g, a 4 ° C per 10 minuti, per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante e procedere con i passaggi di isolamento di EV.

2. isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino

Nota: In questo studio, tecniche di isolamento di due EV, vale a dire UFC e ultracentrifugazione con galleggiante utilizzato per isolare SVE da BALF. Il protocollo dettagliato di ogni metodo è descritto di seguito.

  1. Metodo di arricchimento di ultrafiltrazione centrifugazione (UFC)
    Nota: Questo metodo è stato modificato da un protocollo descritto in precedenza10.
    1. Filtrare il surnatante dal punto 1.2.3 attraverso un filtro di siringa sterile 0,2 μm e mantenere il BALF filtrata sul ghiaccio.
      Nota: Questo è un passo di esclusione di dimensione per cui solo vescicole inferiore a 200 nm sono raccolti.
    2. Equilibrare l'unità filtro centrifugo MWCO di 100 kDa con DPBS sterile per 10 min. Centrifugare il Gruppo centrifugo a 1.500 x g per 10 min a 4 ° C per annullare il DPBS.
      Attenzione: La membrana del dispositivo di filtro è equilibrata con DPBS, la membrana dovrà essere mantenuta bagnata a tutto il tempo fino a quando il dispositivo viene utilizzato.
    3. Riempire il filtro con 15 mL di campione BALF dal punto 2.1.1 e centrifugare a 3.000 x g per 30 min a 4 ° C. Il flusso continuo BALF può essere scartato o raccolti in un tubo separato canonico e conservati a-80 ° C per un uso futuro.
    4. Ripetere il passaggio 2.1.3 per il restante 0,2 µm-filtrata BALF.
      Nota: Ci sono voluti tre ripetizioni di centrifugazioni sufficientemente concentrare lo SVE BALF dal volume originale di partenza di 35 mL. Ciò ha provocato 1 – 1,5 mL di retentato.
    5. Lavare il retentato con 14 mL di DPBS sterile pipettando un delicatamente in modo ripetitivo. Centrifugare l'unità filtro a 3.000 x g, a 4 ° C per 30 min, rimuovere il DPBS e concentrare il retentato di EV.
    6. Raccogliere il concentrato SVE BALF derivato dal dispositivo filtro inserendo un pipettatore nella parte inferiore del dispositivo filtro e prelevare il campione con un movimento laterale per garantire il recupero totale.
    7. Aliquota dello SVE BALF derivato e conservarli a-80 ° C per ulteriore particella quantificazione e caratterizzazione (vedi passo 3).
  2. Ultracentrifugazione (UC) con centrifugazione in gradiente di densità capace di galleggiare (DGC)
    Nota: Il seguente protocollo è stato modificato dal protocollo descritto in precedenza24.
    1. Trasferire il surnatante dal punto 2.1.1 in una provetta ultracentrifuga 37-mL e centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 min a 4 ° C, usando ultracentrifuga. Raccogliere il surnatante e centrifugare a 100.000 x g, a 4 ° C per 60 min. Mentre i pellet EV sono centrifugati, preparare le concentrazioni differenti di buffer di gradienti di densità capace di galleggiare (tabella 1) al punto 2.2.3.
    2. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di EV in 200 μL di DPBS.
    3. Mescolare la sospensione di EV con 300 μL di soluzione di lavoro 50% iodixanol (tabella 1) e trasferirlo al tubo da 15 mL ultracentrifuga. In cima la sospensione di miscela 50% iodixanol-EV, in sequenza di strato seguente soluzione tampone nell'ordine dal basso verso l'alto: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% di iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2,5 mL) e 5% iodixanol (6 mL). Centrifuga a 100.000 x g, a 4 ° C per 230 min.
      Nota: Il gradiente di densità capace di galleggiare si basa la percentuale di ridimensionamento con la più alta concentrazione (50%) nella parte inferiore per la concentrazione più bassa (5%) nella parte superiore di iodixanol. Per generare diverse concentrazioni di iodixanol, varie quantità di mezzo di omogeneizzazione (tabella 1) sono stati mescolati con soluzione di lavoro (50% iodixanol).
    4. Raccogliere la frazione di 15% e 25% e diluirli in DPBS sterile per far apparire il volume di 15 mL. Trasferirli su una nuova piccola ultracentrifuga provetta e centrifugare a 100.000 x g, a 4 ° C per 60 min.
    5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di EV in 50 μL di DPBS sterile per ulteriore caratterizzazione.

3. extracellulare vescicola quantificazione

Nota: La resa di recupero BALF derivato EVs è quantificata con due metriche.

  1. Nanoparticle tracking misura analysis (NTA)
    1. Diluire il campione di EV a 1: 200 – 1: 500 a 1 mL di DPBS e carico il campione in una siringa da insulina. Attaccare una siringa di campione per una pompa a siringa e cominciare a misurare il numeri di particelle e le dimensioni (Vedi Tabella materiali).
    2. Impostare il livello di fotocamera a 14 e la soglia di rilevamento 1 per tutte le misurazioni di campioni. Cinque misurazioni ripetitive con 1.500 fotogrammi in 30 s sono stati registrati per ogni campione, con un ritardo di 20 s tra letture. Combinare e media i dati per concentrazione finale e i rapporti di dimensione.
      Nota: Per l'acquisizione accurata di tutte le particelle, regolare il livello di fotocamera più appropriato per visualizzare tutte le particelle e utilizzare impostazioni simili per tutte le misurazioni di campioni in ogni esperimento.
  2. Quantificazione della proteina
    Nota: L'analisi della proteina (BCA) acido bicinconinico è stato utilizzato per misurare la concentrazione di proteina dello SVE BALF-derivato.
    1. Solubilizzare i campioni di EV in 1 tampone di lisi di x.
    2. Quantificare la quantità di proteine nel server EVs BALF derivato al protocollo standard BCA mediante rilevazione colorimetrica misurando l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastra.

4. rilevazione delle vescicole extracellulari BALF derivato

Nota: Comunemente noto esosomi proteine di superficie dell'indicatore (TSG101, CD63, CD81 e CD9) sono state utilizzate per verificare EV recuperi da SDS-PAGE e immunoblotting e flusso cytometry analisi.

  1. SDS-PAGE e immunoblotting
    1. Sciogliere una pari quantità di proteine di EV di ciascun campione con un blotting caricamento buffer (solfato dodecilico di litio) e 50 mM dithiothreitol (DTT) in un tubo di 1,6 mL. Riscaldare i campioni a 70 ° C per 10 min.
    2. Caricare i campioni dal punto 4.1.1 in un gel di acrilammide 4 – 12% Bis-Tris Plus ed eseguire l'elettroforesi (150 volt, 35 mA) per 35 min.
    3. Proteine di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa mediante un metodo di trasferimento asciutto.
    4. Bloccare la membrana con 5% di latte scremato per 60 min, a dondolo a temperatura ambiente (TA).
    5. Incubare la membrana con un anticorpo ad un marcatore di proteina di superficie di EV, tumore suscettibilità Gene 101 (TSG101), alla diluizione di 1: 500 in 5% BSA in Tris-buffered saline Tween-20 (TBST) a 4 ° C, a dondolo durante la notte.
    6. Il giorno successivo, lavare la membrana 3 x, 10 min ciascuno lavare, nel buffer di TBST e viene quindi incubato con anti-coniglio IgG, anticorpi HRP-collegato, a 1:5,000 una diluizione per 60 minuti a TA.
    7. Lavare la membrana 3 x, 10 min ciascuno lavare, nel buffer di TBST. Sviluppare la membrana con chemiluminescenza HRP anticorpo reagente di rilevamento e immagine (Vedi Tabella materiali per sistema di imaging).
  2. Citometria a flusso
    1. Diluire BALF derivato SVE in 49 μL di PEB macchiatura buffer (PBS + 5 mM di EDTA + 0,5% BSA, filtrata attraverso una membrana filtrante di 0,1 μm siringa).
    2. Aggiungere tutti i seguenti anticorpi in ogni singolo campione: 1) anticorpo di topo anti-topo PE CD63 (100 ng per reazione); 2) ratto anti-topo PE CD81 (500 ng); 3) ratto anti-topo CD9 FITC (200 ng). Incubare a 4 ° C, a dondolo per 60 min al buio.
    3. Diluire i campioni con 450 μL di membrana-filtrata PEB macchiatura buffer e sottoporre i campioni per l'analisi di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali)25.
    4. Regolare le impostazioni di cytometer di flusso come segue: 1) impostare tutti i canali su iper log (hlog); 2) impostare il trigger su SSC a 4; 3) disattivare il trigger secondario. Eseguire gli esempi in un ambiente a bassa velocità e acquisire almeno 10.000 eventi in ciascun campione.
    5. Eseguire analisi di dati basso cytometry in ciascun campione utilizzando software di analisi (Vedi Tabella materiali).

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Risultati

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Abbiamo effettuato EV isolamento da mouse BALF utilizzando metodi di isolamento UFC e UC-DGC nello stesso giorno. Il metodo UFC richiesto circa 2,5-3 h, mentre la tecnica di UC-DGC richiesto 8 h tempo di elaborazione. Questo non include buffer e tempo di preparazione del reagente. Dovrebbe essere notato che alcune altre attività potesse essere eseguita durante i periodi lunghi di centrifugazione. Tuttavia, l'intera procedura è durato quasi un giorno intero per la tecnica di isolamento UC-...

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Discussione

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Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno dipanato i significati del SVE in omeostasi cellulare. Ancora più importante, EVs svolgono un ruolo importante in molti processi di malattia modulando le celle vicine e lontane a loro carico bioattivi molecole1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è supportato da sovvenzioni NHLBI/NIH HL103868 (a P.C.) e HL137076 (a P.C.), la sovvenzione di associazione cuore americano (a P.C.) e Samuel Oschin completa Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (a P.C.). Vorremmo esprimere il nostro grande apprezzamento per l'Istituto del cuore di Smidt al Cedars-Sinai Medical Center che ci fornisce una macchina Nanosight per EV nanoparticle tracking analysis.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
Filtri centrifughi Amicon Ultra-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SaccarosioSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
Cloruro di sodioSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Gradiente di densità medio
ketaminaVetOne, Boise, ID13985-702-10
XilazinaAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Siringa 1 mLSiringa BD, Franklin Lakes, NJ309656
Angiocatheter 20 GSiringa BD, Franklin Lakes, NJ381703
Provette per centrifuga 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Provette per centrifuga 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Saggio delle proteine dell'acido bicinconico (BCA)Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Anticorpo TSG101 anti-topo di coniglioAbCam, Cambridge, MAAB125011
Anticorpo PE-CD63 anti-topo di rattoBiolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
IgG anti-coniglio, anticorpi legati a HRPTecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Agente riducente (Bolt)
10x Tampone di lisi (Bolt)Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel di acrilammideInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 mini pile di nitrocellulosaInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Reagente per il rilevamento di anticorpi HRP chemiluminescenti HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Provette per ultracentrifuga 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Provette per ultracentrifuga 38,5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA Filtri per Siringhe 0,2 & micro; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeEppendorf, Amburgo,Germania-Ultracentrifuge
Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire, UK-Permisurare la distribuzione granulometrica e Citometro
a flusso MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Germania-iBlot
Apparecchio di trasferimentoThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10
Software di analisi

Riferimenti

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