Quantificare intermembrana distanze con le dilatazioni immagine seriale

Summary

Lo scopo di questo algoritmo è quello di misurare continuamente la distanza tra due spigoli 2-dimensionale utilizzando path-finding e le dilatazioni immagine seriale. Questo algoritmo può essere applicato ad una varietà di campi come la biologia strutturale cardiaca, biologia vascolare e ingegneria civile.

Abstract

Un nanodomini extracellulare recentemente descritto, chiamato perinexus, sono stato implicato nella ephaptic di accoppiamento, che è un meccanismo alternativo per la conduzione elettrica tra cardiomyocytes. Il metodo corrente per quantificare questo spazio di segmentazione manuale è lento e ha scarsa risoluzione spaziale. Abbiamo sviluppato un algoritmo che utilizza le dilatazioni immagine seriale di una struttura binaria per contare il numero di pixel tra due opposti bordi dimensionali 2. Questo algoritmo richiede meno ore uomo e ha una maggiore risoluzione spaziale rispetto al metodo manuale mantenendo la riproducibilità del processo manuale. Infatti, esperti e ricercatori alle prime armi erano in grado di riassumere i risultati di uno studio precedente con questo nuovo algoritmo. L'algoritmo è limitata dalla input umano necessario per delineare manualmente il perinexus e potenza di calcolo principalmente gravata da un algoritmo di path-finding pre-esistenti. Tuttavia, l'algoritmo le capacità ad alta velocità, alta risoluzione spaziale e riproducibilità renderlo uno strumento di misura versatile e robusto per uso attraverso una varietà di applicazioni che richiedono la misurazione della distanza tra qualsiasi 2-dimensionale (2D ) i bordi.

Introduction

Il seguente algoritmo è stato sviluppato per misurare la distanza intermembrana tra due cardiomyocytes strutturalmente accoppiato al punto che si separano gli uni dagli altri al bordo di una placca di svincolo gap in un nanodomini chiamato il perinexus¹, che ha implicati in ephaptic raccordo^2,3,4,5. Nel processo di analizzare centinaia di immagini di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione di perinexi utilizzando un metodo di segmentazione manuale in un precedente studio⁶, è stata identificata la necessità per un metodo di throughput più elevato che campionati perinexal larghezza in più in alto risoluzione spaziale mantenendo la precisione del processo di segmentazione manuale precedente durante la segmentazione manuale, le linee vengono disegnate a intervalli di 15 nm, circa ortogonali all'asse di mezzeria, al fine di misurare la larghezza di perinexal. Il nuovo algoritmo prende un contorno spesso binario di un pixel di due linee parallele e utilizza le dilatazioni immagine seriale per contare il numero di pixel tra le due membrane. Mentre le dilatazioni immagine comunemente sono state utilizzate in una miriade di applicazioni di elaborazione di immagine, compreso il contorno o bordo rilevamento^7,8, questo algoritmo utilizza le dilatazioni come un meccanismo di conteggio. La linea centrale è quindi isolato utilizzando una larghezza di⁹ e perinexal algoritmo di path-finding viene quindi misurata ad una risoluzione lungo la lunghezza del perinexus uguale alla risoluzione dell'immagine. La differenza di risoluzione in questo caso è 1 misura ogni 15 nm per la segmentazione manuale e 1 misura a 0,34 nm con il nuovo algoritmo, un 44-fold aumento della frequenza di campionamento spaziale. Inoltre, questa aumentata frequenza di campionamento avviene in circa 1/5^th il tempo necessario per la segmentazione manuale.

Questo algoritmo sarà utilizzato nella sua forma attuale per misurare la larghezza del perinexal il convenzionale 0-150 nm dal bordo di un gap junction placca⁵ (GJ) così come all'interno di una determinata area di interesse, dove il perinexus altipiani tra 30 e 105 nm^{2 , 3 , 10}. la maggiore frequenza di campionamento riduce la variabilità nelle misurazioni individuali perinexus rispetto alla segmentazione manuale e riduce notevolmente i tempi di analisi, permettendo per un'elaborazione efficiente di grandi insiemi di dati. Tuttavia, questo programma non è limitato alle immagini TEM su scala nanometrica dei dischi intercalari cardiaci. Lo stesso approccio potrebbe essere utilizzato per quantificare il diametro vascolare, frazione di eiezione ventricolare o persino non-biologico fenomeni quali l'erosione del fiume o inondazioni. Questo algoritmo è adatto per quantificare la distanza tra qualsiasi due bordi quasi paralleli.

Protocol

Nota: Software richiesti sono ImageJ (o software di modifica di immagine simile) e Matlab R2015. L'utente potrebbe riscontrare problemi di compatibilità con altre versioni di Matlab.

1. pre-elaborazione immagini

1. Per le immagini in scala di grigi, garantire il valore di intensità massima di ogni dato pixel è < 255. In genere ciò avviene sottraendo un valore pari a 1 dall'immagine nel programma Matlab personalizzato "ImageSub.m", incluso nel file supplementare S1.

2. delineare il Perinexus

1. Delineare la perinexus in ImageJ o altri software di elaborazione delle immagini.
2. Assicurarsi che il contorno è un pixel di spesso ed è impostato sul valore più alto di intensità di un'immagine (255 in un'immagine in scala di grigi da 0 a 255).
3. Identificare il GJ di sua pentalaminar struttura^11,12e definire l'inizio del perinexus come il punto in cui i due opposti strati lipidici della membrana cellulare divergono, come mostrato nella Figura 1A. Begin ~ 200 nm dal bordo di GJ, traccia lungo la membrana interna della prima cella e indietro lungo la membrana interna della seconda cella. In ImageJ, rilasciare la penna per chiudere automaticamente il contorno. Questa chiusura artificiale verrà ritagliata più tardi.
   Nota: È fondamentale delineare il perinexus con grande cura al più alto un ingrandimento possibile, come anche piccole MIS-applicazioni del contorno possono provocare diversi nanometri di errore nella misura finale.

3. impostare l'algoritmo e selezionando Perinexus di interesse

Nota: L'algoritmo di path-finding richiede l'autografo, Edge, grafico, nodo e Pathfinding funzioni⁹ per essere nella stessa directory come il MembraneSepDist m-file. Tutti i file possono essere trovati nel file supplementare S1.

1. Selezionare Salva percorsi per dati e cifre. Queste sono attualmente hardcoded nel file di m.
   Nota: La prima riga del programma è una funzione per cancellare tutte le variabili, chiudere tutte le finestre e cancella la finestra di comando. Salvare le variabili desiderate o figure prima di eseguire il file di m.
   Nota: Software screenshot sono inclusi nel file supplementare S2 per tutti i valori hardcoded.
2. Eseguire il programma "MembraneSepDist.m".
3. Impostare i parametri.
   Nota: Una GUI si aprirà con i parametri predefiniti per la soglia di gradiente, la scala, la regione di interesse e di avvio manuale. I valori predefiniti possono essere modificati nel m-file, o possono essere cambiati per ogni singola immagine.
   1. Soglia di gradiente derivata spazio impostata.
      Nota: Valori maggiori producono in più punti selezionati in isolamento linea d'asse. Valori che sono troppo alte o troppo basse (di fuori di un intervallo di circa 3.0-7.9) potrebbero computazionale inefficienza o un'imprecisa selezione di punti di mezzeria ottenendo isolamento imprecisa linea d'asse (Vedi Figura 2A-C).
   2. Impostare la scala in unità di pixel/scala.
   3. Impostare i limiti superiori e inferiori spaziali per la regione di interesse.
      Nota: Per convenzione del nostro laboratorio, la regione definita di interesse è tra 30 e 105 nm dal bordo del GJ^2,3,10.
   4. Impostare l'avvio automatico/manuale. Nella maggior parte dei casi, l'algoritmo rileva con precisione il punto di partenza dove inizia il gap junction estremità e perinexus. Tuttavia, in alcuni casi di perinexi di forma irregolare, l'utente deve identificare manualmente il punto iniziale. Impostare questo valore su 0 per automatico, 1 manuale.
4. Selezionare l'immagine desiderata.
   Nota: Selezionare la cartella file può essere modificata nel m-file.
5. Ritagliare l'immagine per selezionare il perinexus di interesse.
   1. Quando l'immagine viene visualizzata, il cursore cambierà automaticamente di un mirino. Ritagliare l'immagine trascinando un riquadro intorno alla perinexus di interesse (Vedi Figura 3). La casella di ritaglio può essere regolata utilizzando i quadrati sui lati e gli angoli per renderla più grande o più piccolo.
   2. Durante il ritaglio, garantire l'estremità "aperta" della perinexus (più lontana la GJ, Vedi Figura 3) viene ritagliata in modo che i contorni di due membrana raggiungono il bordo dell'immagine ritagliata.
      Nota: È consigliabile l'immagine a schermo intero per visualizzare il perinexus di interesse più facilmente e ritagliare in modo appropriato.
6. Selezionare il raccolto finale facendo doppio clic con il cursore tra i bordi opposti da misurare.
   Nota: È fondamentale che il doppio clic essere eseguita all'interno del perinexus. Se il programma non riesce a identificare una linea di mezzeria, riavviare il programma e assicurarsi che il clic si verifica entro il perinexus.
7. Osservare la linea di mezzeria finale dopo tutte le dilatazioni e le erosioni pop-up per una valutazione di utente finale dell'efficacia del programma.
   Nota: Una finestra di dialogo apparirà sullo schermo durante l'esecuzione del programma per informare l'utente che Matlab sarà in grado di elaborare qualsiasi comando fino a quando il programma ha terminato. Quanto tempo questo processo richiede dipende dalla dimensione della matrice (immagine) e potenza di elaborazione del computer.
8. Se è attivato il punto di avvio manuale, osservare l'immagine della linea di mezzeria pop-up sopra l'immagine anatomica originale, insieme a un mirino cursore (vedere la Figura 2E). Selezionare un punto di fuori del perinexus vicino al punto di avvio desiderato.
   Nota: Il programma sarà trovare il punto di linea d'asse più vicino al pixel selezionati e utilizzarlo come punto di partenza.
9. Dati del record.
   Nota: Una volta che il programma ha terminato, il programma restituirà una linea di mezzeria mappata, trama del perinexal larghezza in funzione della distanza dal bordo del GJ. Inoltre, il programma restituirà la larghezza media perinexal fino a 150 nm dal bordo della GJ, nonché la media all'interno dell'area definita di interesse nella riga di comando di Matlab. I valori di_p W e distanze dal GJ vengono memorizzati nella variabile "WpList" o l'utente manualmente possibile registrarli separatamente.

4. algoritmo di risoluzione dei problemi

1. Se la linea di mezzeria non è correttamente identificato (Figura 2A), aprire la figura "Gmag" e utilizzare l'indice per identificare una soglia di gradiente appropriata (Figura 2C).
2. Se il punto iniziale non viene identificato correttamente, impostare manualmente il punto iniziale (Vedi protocollo 3,8).

Results

Metodi statistici: I confronti sono stati fatti fra gruppi sperimentali utilizzando il test t di Student. Un valore p < 0,05 è considerato significativo e tutti i valori sono rappresentati come media ± deviazione standard.

Segmentazione manuale. La quantificazione della GJ-adiacente perinexus nanodomini larghezza (W_p) avviene in genere mediante segmentazione manuale. Questo processo di segmentazione manuale illustrato in Figura 1A ed è stato descritto in precedenza⁶. L'osservatore identifica il bordo di GJ (Figura 1, punto rosso), misura 5nm lungo il centro della perinexus e misura la distanza tra le membrane a quel punto. Il processo viene quindi ripetuto alle 10, 15, 30 e ogni 15 nm fino a 150 nm. Questa tecnica, mentre efficace, ha limiti di tempo e di sotto-campionamento spaziale lungo la lunghezza della perinexus.

Significa misure_p W da studi precedenti possono variare da circa 10 a 20 nm^2,3,10e 3 nm sembra essere la differenza media necessaria per rilevare la significatività statistica, che è ben di sopra del frequenza di Nyquist spaziale di 0,7 nm per misura basato su una risoluzione interpixel di 0,34 nm. Pertanto, mentre segmentazione manuale è molto tempo, il metodo è sufficiente per misurare le differenze in W_p associato uno stato di malattia o di intervento.

Immagine seriale dilatazioni. Al fine di misurare la perinexus in un modo più veloce, riproducibile con risoluzione spaziale appropriato, abbiamo sviluppato un programma basato sulle dilatazioni immagine seriale per contare i pixel tra due membrane manualmente tracing, che possono essere visto in Figura 1B .

Il processo di dilatazione seriale è illustrato nella Figura 4. Come l'immagine binaria è dilatata (Figura 4A-4D), che la dilatazione è quindi invertita e aggiungere un'immagine di lavoro - il modulo non binari del contorno originale (Figura 4E-4h). Il processo viene ripetuto fino a quando il contorno è interamente riempito inD(Figura 4). A questo punto, l'immagine finale di lavoro (Figura 4H) è un conteggio del numero di volte che un determinato pixel è rimasta non dilatato. Come tale, i valori vicino la struttura delle membrane cellulari sono molto bassi, mentre i valori al centro sono più alti. Contando il numero di dilatazioni per riempire l'area in ogni punto, può essere calcolata la distanza tra i bordi della membrana. La prossima sfida è quello di identificare e isolare la linea di mezzeria per quantificare perinexal larghezza in funzione della distanza da GJ, che avviene applicando un derivato spaziale per l'immagine finale di lavoro (Figura 2-Ultima immagine e Figura 5 A). Un secondo esempio di un perinexus più di forma irregolare può essere trovato nel file supplementare S3.

Identificazione centerline. La sfumatura dell'immagine lavoro finale può essere quantificata da un derivato spaziale, come conteggio di dilatazione valori da bordo a bordo cambiano da alta a bassa a alta nuovamente (Figura 5A sinistra a destra). Tenendo conto solo della grandezza del derivato spaziale (Figura 5B), il contorno e la linea di mezzeria, evidenziata con frecce bianche, sono immediatamente identificabili come zone di discontinuità. A queste posizioni, la direzione della sfumatura cambia da crescente a decrescente o viceversa. L'applicazione di una soglia (Figura 5C) produce un'immagine binaria della linea di mezzeria e muta, e sottraendo il contorno originale produce la linea di mezzeria isolato(Figura 5). Mentre questo metodo per isolare la linea di mezzeria è computazionalmente efficiente, la soglia applicata alla derivata spaziale crea degli spazi in mezzeria risultante. Queste lacune (Figura 5D, inserire) devono essere compilate per fornire una misurazione accurata della distanza dal GJ e per garantire che perinexus viene misurata nella sua interezza. In primo luogo, la linea di mezzeria è dilatato per colmare eventuali lacune (Figura 5E), seguite da un'erosione (Figura 5F) e una funzione di "bwmorph" (operazione = 'skel', n = inf) per eliminare quanti più punti possibile, lasciando un linea d'asse continuo, aumentando così l'efficienza computazionale di un algoritmo di path-finding successive sviluppato da Wasit Limprasert e disponibile su MATLAB Central⁹. Questa funzione di dilatazione-erosione produce la linea di mezzeria completato, che si combina con l'immagine finale di lavoro (Figura 5G). Tuttavia, questa linea di mezzeria è spesso più di un pixel di spesso e di conseguenza non è un preciso isolamento della linea di mezzeria.

L'algoritmo di path-finding Wasit Limprasert viene utilizzato per determinare la linea d'asse perinexus. L'algoritmo di path-finding è in grado di monitorare i valori più alti - in questo caso i valori più vicini al centro che è rimasto non-dilatato più iterazioni lungo la linea centrale (Figura 5G, inserire). Il risultato è un'analisi automatica della linea di mezzeria, come illustrato nella Figura 6. Isolando la linea d'asse, larghezza di perinexal possa essere presentato come una funzione della distanza dall'estremità di GJ, come illustrato nella Figura 6B (in alto), o come la larghezza media di una determinata area di interesse.

Analisi kernel. È importante notare che immagini digitalizzate sono basati su matrici quadrate e noccioli di dilatazione similarmente sono basati su matrici quadrate. Questo significa che la distanza di dilatazione attraverso una diagonale è maggiore di ortogonali. Pertanto, abbiamo cercato successiva determinare se il kernel interessati i risultati dell'algoritmo. Al fine di quantificare la variabilità del kernel specifico, sono state analizzate cinque forme di kernel diverso: "Plus" (la forma utilizzata nelle analisi di cui sopra), "X", "Box" e "linea", come descritto in Figura 7A. Il kernel è applicato a ogni punto diverso da zero di un'immagine binaria. La stella in ogni kernel di Figura 7A rappresenta il centro, dove bianco è un valore di 1 e un valore pari a 0 per il kernel di dilatazione è nero.

Influenza di ogni kernel sulla misura_p W media di una singola immagine di perinexal circa orizzontale (Figura 7B, in alto), quantificato da un utente esperto, è stato determinato dalla rotazione dell'immagine con il comando "imrotate" di Matlab e calcolo W_p a passi di 10 °. I valori di misurazione di_p W (Figura 7B, in basso) oscillano con orientamento dell'immagine in modo sinusoidale raddrizzato con un Plus a forma di kernel. I valori più bassi si verificano quando un perinexus relativamente diritta è orientato orizzontalmente o verticalmente. La X, casella, né linea kernel fornito alcun vantaggio sopra il nocciolo a forma di più. Il kernel X e casella prodotto risultati identici, ma i valori di dire W_p erano fuori fase con th_e kernel più di 45 °. Il kernel di linea non è riuscito a dilatare completamente l'immagine in certi angoli, come si evince dall'assenza di dati nella traccia verde per l'immagine ruotata a meno di 30 o più di 145 °. Così, il kernel di dilatazione ortogonale Plus sovrastimato separazione a membrana quando dilatando un perinexus con un asse orientato diagonalmente ad esempio a circa 45 °, e il kernel X e casella sottovalutato significa W_p quando l'asse del perinexus è stato anche a 45°. Sulla base di questa analisi, abbiamo sviluppato un fattore di correzione applicato ai valori generati da dilatare con il kernel a forma di più. Per contabilizzare la sovrastima di separazione a membrana associati con orientamento dell'immagine, questo fattore di correzione moltiplicato per il valore di larghezza misurata a seconda dell'orientamento dell'immagine (equazione 1).

Se θ < 45°
     W_{p rettificato} = cosd(θ) * W_{p misurata}
Se θ ≥ 45 °
     W_{p rettificato} = cosd(θ) * W_{p misurata} (equazione 1)

In questa equazione, W_p misurata è il valore di_p W originale generato dall'algoritmo sopra e θ è l'angolo calcolato dall'orizzontale, in gradi. Θ è calcolato prendendo la tangente inversa del cambiamento totale nella direzione orizzontale divisa per il totale cambiamento nella direzione verticale della linea di mezzeria perinexal. La correzione precedente si approssima l'angolo medio, relativo orizzontale, della perinexus (Figura 8A, superiore sinistro) e si traduce in una misura come se ottenuti da un perinexus orizzontale (Figura 8A, basso a sinistra). La logica dietro questa equazione deriva dal fatto che il kernel a forma di più (Figura 7A) è essenzialmente due a forma di riga kernel disposti ortogonalmente a vicenda. Come tale, di sotto di 45° (vicino a orizzontale), le dilatazioni verificano verticalmente e quindi moltiplicando per il coseno dell'angolo dà la misura corretta. Al contrario, per gli angoli sopra le dilatazioni (vicino alla verticale), 45° verificarsi orizzontalmente e il seno viene utilizzato per determinare la misura corretta. A 45° con precisione, il seno e coseno sono uguali. File supplementare S4 fornisce una rappresentazione di questo concetto. Si noti che questa correzione è basata sull'angolo medio e deve essere usata cautela quando si analizzano le forme sostanzialmente non-lineare. Questo processo è stato ripetuto il 20 perinexi selezionati in modo casuale e le misurazioni corrette fortemente correlato con misure ottenute manualmente ruotando e ri-analizzando le immagini (Figura 8A, destra). Per confermare la correzione accurata per orientamento dell'immagine, due insiemi dei bordi fantasma sono stati generati (Figura 8B, sinistra) e ruotato di 180 °. Con la correzione trigonometrica, l'algoritmo restituito con precisione il valore corretto a ogni orientamento, risoluzione spaziale indipendentemente dalla dimensione dell'immagine (Figura 8B, destra).

Applicazione analitica e riproducibilità con orientamento correzione. Ricordando che gli studi precedenti utilizzando segmentazione manuale rapporto statisticamente significativo dire le differenze di_p W maggiore di o uguale a 3 nm, era importante determinare se l'algoritmo potrebbe essere utilizzato per riepilogare i risultati precedenti utilizzando un set di dati completo. Utilizzando il nuovo algoritmo, due osservatori - uno sperimentato e uno unexperienced con analisi perinexal (OBS. 1 e 2 di OBS., rispettivamente)-analizzato le stesse immagini da un precedente studio⁶ che comprendeva 12 pazienti che sono stati diagnosticati con atriale fibrillazione (AF) prima della raccolta del tessuto e 29 pazienti che non hanno AF pre-esistenti (No-AF). L'utente esperto trovato che W_p era significativamente maggiore nei pazienti con AF rispetto senza AF (21.9±2.5 e 18.4±2.0 nm, rispettivamente, nella figura 9A). Questi valori con il fattore di correzione applicato sono simili a quelli segnalati in precedenza (24.4±2.2 nm e 20.7±2.4 nm, rispettivamente)⁶. D'importanza, l'utente inesperto trovato la stessa differenza significativa (22.1±2.8 nm e 20.1±2.6 nm, rispettivamente) tra Stati di malattia con il programma automatico. Inoltre, la deviazione standard dei valori di_p W non è cambiato con il fattore di correzione, che indica che la deviazione standard di 2-3 nm non è un artefatto dell'algoritmo, ma della struttura stessa e processazione dei tessuti. Questi risultati dimostrano che il metodo proposto automatizzato è capace di ricapitolare i risultati degli studi precedenti.

D'importanza, il perinexus è una struttura recentemente definito e nessun consenso è stato raggiunto sulla gamma dei valori assoluti di separazione a membrana adiacente a GJ^2,3. Poiché la larghezza GJ-membrana-a-esterno-membrana esterna è stato precedentemente stimato a 20 nm¹³, abbiamo cercato di determinare l'efficacia dell'algoritmo misurando anche larghezza GJ. Entrambi gli osservatori non trovati alcuna differenza significativa tra larghezze di gap junction (Jan) dei pazienti con o senza pre-esistente AF (Figura 9B). Valori assoluti di Jan per pazienti non-AF e AF erano 20,5 ± 2,5 nm e 20,3 ± 1,9 nm, rispettivamente, per l'osservatore esperto e 21.0 ± 3.1 nm e 20.0 ± 2.2 nm per l'osservatore inesperto, simile a quello che è stato segnalato precedentemente.

Per determinare se l'algoritmo automatizzato richiede meno tempo per analizzare i dati di segmentazione manuale, sia l'utente esperto e inesperto hanno registrato il tempo necessario per quantificare una formazione di 10-immagine set (file supplementare S5). Tabella 1 dimostra che l'utente esperto e inesperto in diminuzione tempo di analisi da 4.7 e 8.3 volte rispettivamente utilizzando l'algoritmo automatizzato rispetto all'approccio di segmentazione manuale, con un aumento circa 43-fold spaziale risoluzione lungo il perinexus.

Algoritmo di risoluzione dei problemi. L'errore più comune quando si esegue l'algoritmo si verifica quando l'asse di mezzeria finale non si limita al bordo dell'immagine. In tali casi, non abbastanza punti sono stati selezionati dalla mappa derivata spazio, causando il programma per errore e produrre un messaggio di errore consigliare all'utente di selezionare un'area di ritaglio o aumentare la soglia derivata spazio. Disegno di una casella di ritaglio più grande migliorerà l'affidabilità del programma in alcuni casi come le modifiche derivate spaziali drasticamente vicino ai bordi della figura, che possono interferire con gli algoritmi di rilevamento di path-finding o bordo.

È anche possibile per l'algoritmo di path-finding a non riescono ad identificare correttamente la linea di mezzeria, anche se la linea di mezzeria raggiunge il bordo dell'immagine, specialmente se la soglia di gradiente è troppo bassa (Figura 2A). Se la soglia di gradiente è impostata troppo alta, non ci sarà più punti inutili inglobati l'algoritmo di path-finding (Figura 2B), diminuendo l'efficienza computazionale. Se l'utente è in grado di determinare una soglia appropriata, la matrice dell'immagine "GMag" (Figura 2C), che viene generato dal programma e può essere trovato nell'area di lavoro, può aiutare l'utente determinare la soglia. Trovare punti lungo la linea centrale e impostare la soglia leggermente sopra il valore di indice per assicurare che questi punti vengono selezionati. Nell'esempio dato, una soglia appropriata sarebbe sopra ~5.1 (Figura 2C, inserire).

Il punto di partenza anche potrebbe non riuscire a raggiungere l'inizio della perinexus (Figura 2D). In questo caso, eseguire nuovamente il programma e impostare il valore di Avvio manuale su 1. Dopo la linea d'asse è stata isolata, l'utente seleziona un punto esterno il perinexus e il punto di linea d'asse più vicino al pixel selezionati (Figura 2E, Piazza rossa) verrà impostato come punto di partenza. Il risultato è la linea di mezzeria completo (Figura 2F).

Figura 1 : Immagini TEM con processi di quantificazione. Il processo di segmentazione manuale (A) richiede all'utente di eseguire 12 singole misurazioni intermembrana mentre stima la linea di mezzeria. Il processo automatico (B) richiede una traccia manuale, continua del contorno della perinexus. Il puntino rosso in ogni immagine rappresenta fine utente identificato il GJ e l'inizio del perinexus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2 : Risoluzione dei problemi di linea di mezzeria. Due modalità principali di errore per l'identificazione di linea d'asse e le loro soluzioni: ogni immagine è etichettato con il nome della matrice in Matlab. Se la soglia di gradiente è troppo basso (A, soglia 0,2) l'algoritmo di linea d'asse può avere esito negativo. Impostazione della soglia troppo alta (B, soglia 70) può ridurre l'efficienza computazionale dell'algoritmo path-finding. Un'appropriata soglia gradiente può essere determinata dalla matrice GMag (C, inserire). Se la linea di mezzeria non riesce a raggiungere il bordo di inizio della perinexus (D), l'utente può optare per selezionare manualmente il punto iniziale. Dopo la "Start Point" opzione è impostata su 1 nella GUI di apertura, l'utente, quindi seleziona un punto di fuori del perinexus di interesse (E). Il risultato finale dovrebbe essere una linea di mezzeria che descrive accuratamente la totalità del perinexus (F). Tutte le etichette in citazioni (A-F) corrispondono ai nomi di variabile in Matlab. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Selezione di Perinexus. Per ritagliare il perinexus, click-and-hold per trascinare una casella intorno a esso (lo strumento Ritaglia è selezionato automaticamente) come indicato dalla freccia blu. Questa casella può essere regolata utilizzando i quadrati sui lati e gli angoli per renderla più grande o più piccolo. La freccia verde rappresenta la fine della perinexus, che l'utente deve assicurarsi rimane "aperta". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Le dilatazioni seriale immagine. La struttura binaria è ripetutamente dilatata in incrementi di un pixel (A-D) e aggiunti all'immagine di lavoro (la forma non-binario dell'immagine, E-H) dopo ogni dilatazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: path-finding e isolamento di linea di mezzeria. Un derivato spaziale viene calcolato dall'immagine lavoro finale (A) e la grandezza di quella derivata spaziale (B) viene utilizzata per isolare la struttura e la linea di mezzeria (frecce bianche). Una soglia definita dall'utente identifica il contorno e linea d'asse e sottraendo il contorno originale produce la linea di mezzeria (D). Tuttavia, le lacune vengono visualizzati in linea d'asse a causa della soglia (D - inserire). Al fine di produrre una linea di mezzeria continua, una dilatazione secondaria viene eseguita sull'asse di mezzeria isolato (E), seguita da un'erosione secondaria per aumentare l'efficienza computazionale di un algoritmo di path-finding successive. Questa immagine erosa (F) è poi combinata con l'immagine finale del lavoro, che consenta l'identificazione di una linea d'asse continuo, uno-pixel-spesso (G - inserire). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Presentazione dei dati finale. Il programma restituisce il profilo finale sopra l'immagine originale di TEM (A). La linea è verde color-coded per 0-150 nm, blu per la regione definita dall'utente di interesse e rosso per la zona oltre 150 nm. Inoltre, il programma genera un grafico allo stesso modo con codifica a colori che rappresentano W_p in funzione della distanza dall'inizio del perinexus e per la regione di interesse (B), così come la media W_p (inserto nel rispettivo grafico). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Analisi della forma di dilatazione kernel. Forme per i kernel di dilatazione (A): la stella al centro rappresenta i pixel dilatati. Scatole bianche sono colpiti dalla dilatazione, a forma di un plus, X, casella o linea di pixel. Un perinexus circa orizzontale (B, superiore, con una linea rossa che indica 0°) è stata ruotata in senso orario da 0 a 180° in incrementi di 10° e ripetutamente dilatata utilizzando le forme di kernel diverso (B, in basso). Kernel e linea-a forma di più produrre risultati simili, anche se il kernel di linea non riesce a determinati orientamenti, mentre i kernel e X-a forma di scatola sono sfasate di 45 °. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Orientamento correzione immagine. A corretto per l'orientamento dell'immagine, l'angolo medio del perinexus viene calcolato dalle posizioni dell'inizio - ed end punti (A, a sinistra, inizio e fine della linea nera). La tangente inversa del cambiamento nella direzione y (A, sinistra, linea verde) diviso per il cambiamento nei rendimenti di direzione x (A, sinistra, linea rossa) l'angolo di correzione, θ (A, a sinistra, gialla). L'obiettivo è quindi di correggere il valore di_p W medio per dare la distanza minima tra i bordi, come se la perinexus era stato ripreso circa orizzontalmente (A, qui sotto a sinistra). L'applicazione del fattore di correzione descritto dall'equazione 1 è stato confrontato manualmente ruotando ciascuna delle 15 immagini selezionati in modo casuale da θ calcolata prima dell'analisi. I corretti valori fortemente correlati con i valori dell'immagine ruotata (R² = 0.991, A, destra), che indica di equazione 1 è un fattore di correzione valido per orientamento dell'immagine. Per confermare che il fattore di correzione è appropriato, due fantasmi sono stati generati dei bordi perfettamente parallelo con una distanza nota tra di loro (B, a sinistra). Phantom 1 e Phantom 2 hanno risoluzioni spaziali 2,833 pixel / mm e 71,6 pixel/pollici, rispettivamente. Come dimostrano i diamanti blu e rossi piazze in B, bene, l'algoritmo calcola con precisione le larghezze in tutto 180 gradi di rotazione dell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9 : Riproducibilità algoritmo. Con il processo automatico con correzione orientamento dell'immagine, osservatore esperto e inesperto trovato differenze significative tra AF e AF No gruppi (A), coerenti con uno studio precedente, rilevando una differenza minima di 2,6 nm. Inoltre, né osservatore trovato una differenza significativa in Jan (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Manuale	Automatico
Tempo - OBS. 1 (s)	205±11	44±14
Tempo - OBS. 2 (s)	248±18	30 ± 5
Risoluzione spaziale (misure/nm)	0.08	3,45

Tabella 1: confronto dei processi manuali e automatici. Entrambi gli osservatori richiesto meno tempo per ogni immagine per tracciare il contorno di to eseguire il processo di segmentazione manuale per un 10-immagine training set. Inoltre, il processo automatico ha una maggiore frequenza di campionamento, registrazione 3,45 misurazioni al nm, rispetto a una media di 1 misura ogni 12,5 nm per il processo manuale. Le immagini del set di formazione si trovano in supplementare File S5, insieme a contorni e misurazioni interpretato da un utente esperto.

Discussion

L'algoritmo utilizza le dilatazioni immagine seriale per contare il numero di pixel tra due bordi opposti 2D in un'immagine binaria, che in questo caso è la separazione di Inter-membrana del perinexus^2,3,14. Un derivato spaziale e un algoritmo di path-finding vengono quindi utilizzati per isolare la linea di mezzeria, seguito da una sequenza di dilatazione ed erosione secondaria per colmare le lacune nella linea di mezzeria, simile a quello che è stato fatto prima delle¹⁵. La linea di mezzeria è poi combinato con l'immagine di dilatazione-conteggio finale per rappresentare perinexal larghezza in funzione della distanza dall'inizio della separazione di bordo, in questo caso alla fine del GJ e l'inizio del perinexus¹⁶.

Quattro parametri primari sono definiti dall'utente in una GUI all'inizio del programma:

1. Soglia di gradiente
2. Scala
3. Regione di gamma di interesse
4. Avviare il metodo di selezione del punto (automatica o manuale)

Il meccanismo più comune di errore per l'algoritmo è il fallimento della linea di mezzeria per raggiungere il bordo dell'immagine, che è come l'endpoint viene determinata per l'algoritmo di path-finding. Al fine di risolvere tale problema, l'utente può aumentare la soglia di gradiente descritta al punto 3.3.1, che farà sì che il programma selezionare più punti fuori l'immagine spaziale di derivati, che consentirà di aumentare il tempo di calcolo richiesto dall'algoritmo di path-finding. Di conseguenza, questo algoritmo richiede un compromesso tra l'integrità di linea d'asse e velocità di calcolo. È importante notare che, fino a quando tutti i punti della linea di mezzeria vengono identificati dal derivato spaziale, insieme a un punto di partenza appropriato, la soglia derivata spazio non avrà alcun effetto sulla misura di separazione di bordo.

Orientamento dell'immagine sembra influire sui valori di dilatazione, perché il kernel si dilata in incrementi di 90 gradi, che possono introdurre un errore se la maggior parte della regione di interesse è a un angolo di 45° rispetto agli assi delle matrici di dilatazione. Pertanto, il conteggio di dilatazione non può sempre essere una rappresentazione accurata dello spazio tra i bordi. Questa limitazione è stata affrontata da un fattore di correzione trigonometriche, ma potenzialmente potrebbe essere ignorata se tutte le immagini in un dataset sono allineate allo stesso orientamento. Inoltre, attenzione deve essere utilizzato nell'interpretazione dei risultati, come è possibile che i piani di sezione non sono perfettamente perpendicolari le due membrane. Nella Figura 9B, usiamo Jan a suggerire che le nostre immagini di perinexus fossero in piano. Ancora, è indispensabile che le dimensioni del campione sia sufficientemente grande per tenere conto di eventuali variazioni di sezionamento tra immagini. Inoltre, le nostre misurazioni perinexal larghezza non devono essere interpretate riflettono interamente in vivo , ma questo approccio è utilizzato per misurare le differenze medie di perinexal larghezza rispetto allo stato qualche intervento o malattia.

L'algoritmo corrente richiede anche un contorno manualmente Tracing dei bordi come input. È importante notare che fino a quando la scala è impostata correttamente, risoluzione spaziale non ha effetto sulle misurazioni dell'algoritmo, come testimoniano le diverse risoluzioni delle immagini nella Figura 6 e immagine a bassa risoluzione addizionale in supplementare file S6. Il passo successivo nel migliorare l'algoritmo sta rimuovendo intervento umano dalla generazione di contorno con uno strumento che può selezionare l'area di interesse. Queste caratteristiche sarebbero probabilmente aumentare la precisione della misurazione e ridurre i pregiudizi di utente.

Questo algoritmo computazionalmente efficiente fornisce un metodo più veloce, che richiede circa un quinto le ore lavorative, di quantificare la perinexus con nessuna penalità rilevabile alla riproducibilità rispetto al processo di segmentazione manuale. Inoltre, il processo di segmentazione manuale utilizza una misurazione ogni 15 nanometri per quantificare perinexal larghezza, che può portare a sotto campionamento come la separazione di membrana del perinexus può cambiare sostanzialmente all'interno dell'intervallo 15 nm. Al contrario, il programma automatico ha una risoluzione spaziale uguale a quello della modalità imaging, in questo caso 2,9 pixel per nanometro lungo la lunghezza del perinexus, offrendo quindi una media di più finemente risolta di larghezza perinexal.

Mentre le applicazioni nel campo della biologia strutturale cardiaca sono promettenti e interessanti, usi di questo algoritmo non si limitano alle immagini TEM. Qualsiasi campo che richiedono una misurazione precisa e ad alta risoluzione di due bordi quasi paralleli 2D può fare uso di questo algoritmo. L'algoritmo potrebbe essere utilizzato per monitorare qualsiasi cosa da modelli di erosione e inondazioni riverbank da immagini satellitari da sviluppo vascolare con microscopia in campo chiaro o fluorescenti. Una delle più promettenti applicazioni potenziali è nel campo della cardiologia e misurare la frazione di eiezione ventricolare (EF) con ecocardiografia cardiaca point-of-care. Attualmente, la tecnica standard è il metodo di biplano di dischi¹⁷, anche se un nuovo algoritmo, AutoEF, è attualmente il tagliente EF-quantificazione metodo^18,19. Per metodo biplano di dischi, la camera in questione manualmente viene tracciata e quantificati tramite metodo di Simpson modificate, per cui volume complessivo è calcolato automaticamente dalla sommatoria di dischi ellittici in pila. La limitazione principale con questo metodo è che può restituire solo l'area della sezione trasversale totale della sezione desiderata, con nessuna risoluzione per identificare le aree specifiche di interesse e inoltre richiede competenze e sostanziale contributo umano. Il metodo più recente, AutoEF, identifica e delinea il bordo del ventricolo mediante un algoritmo di pezzatura 2D e quindi calcola l'area della sezione trasversale ventricolare. Questo processo, mentre preciso ed efficiente per la misurazione di superficie lorda ventricolare, ha anche una simile limitazione inerente di misurare solo la superficie della sezione trasversale totale. Questo svantaggio principale limita le capacità diagnostiche e di trattamento dei clinici. Al contrario, l'algoritmo presentato in questo manoscritto può identificare un midline e ha una risoluzione pari alla risoluzione della modalità imaging per individuare specifiche regioni di interesse. Questo è importante perché scanner a ultrasuoni con risoluzione spaziale di micrometro sono commercialmente disponibili^20,21, che implica che questo algoritmo potrebbe rilevare anomalie di movimento localizzata della parete alla risoluzione di micrometri invece di centimetri. Mentre questa applicazione deve essere convalidata sperimentalmente, è una delle applicazioni più immediatamente promettente di questo algoritmo. Infatti, esso potrebbe essere facilmente combinato con la speckle le funzionalità di AutoEF di gestione o le tracce manuale utilizzato in manuale planimetria per fornire informazioni ad alta risoluzione in parallelo con dati EF convenzionali.

Versatile ed applicabile come l'algoritmo corrente è, è stato sviluppato per immagini 2D. Tuttavia, come tecnologie di imaging continuano a migliorare, c'è una crescente domanda di tecnologie di quantificazione D 3 e 4. Pertanto, la prossima iterazione dell'algoritmo è quello di adattare lo stesso approccio, dilatando in serie un'immagine binaria, un oggetto 3-dimensionale, dove definire automaticamente una linea di mezzeria è attualmente oltre le funzionalità di programmi di imaging corrente. Un tale algoritmo sarebbe hanno ampie applicazioni sia clinicamente e sperimentalmente nel campo cardiaco da solo, compresi gli ecocardiogrammi cardiaci 3D^22,23, microscopia 3D^{24,25, 26}e^27,28,29la 3D risonanza magnetica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monitor touchscreen	Dell	S2240T	Richiede stilo a punta morbida
Desktop	Dell	Precision T1650	8GB RAM
Sistema operativo	Microsoft	Windows 7 Enterprise	64-bit OS
Piattaforma del programma	Mathworks	Matlab R2015b	Il programma potrebbe essere incompatibile con le versioni più recenti/precedenti di Matlab