Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Summary

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Abstract

Microscopia di fluorescenza è un potente strumento per rilevare molecole biologiche in situ e monitorare le dinamiche e le interazioni in tempo reale. Oltre alla microscopia convenzionale epi-fluorescenza, varie tecniche di formazione immagine sono stati sviluppati per raggiungere specifici obiettivi sperimentali. Alcune delle tecniche ampiamente utilizzate includono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola (smFRET), che può segnalare cambiamenti conformazionali e interazioni molecolari con angstrom risoluzione e singola molecola basata sul rilevamento Super-risoluzione (SR) di imaging, che può migliorare la risoluzione spaziale di circa dieci a twentyfold rispetto alla microscopia a diffrazione limitata. Qui presentiamo un sistema integrato di cliente-progettato, che fonde più metodi di imaging in un microscopio, compreso formazione immagine convenzionale di epi-fluorescente, singola molecola basata su rilevazione SR imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, compreso formazione immagine smFRET. Diversi metodi di imaging possono essere ottenute facilmente e riproducibile elementi ottici di commutazione. Questo set-up è facile da adottare presso un laboratorio di ricerca in scienze biologiche con una necessità di routine e diversi esperimenti di imaging a un costo ridotto e spazio rispetto a costruire microscopi separati per scopi individuali.

Introduction

Microscopi a fluorescenza sono strumenti importanti per la ricerca moderna scienza biologica e formazione immagine di fluorescenza è effettuata ordinariamente in molti laboratori di biologia. Applicando a biomolecole di interesse con fluorofori, possiamo direttamente visualizzarli sotto il microscopio e registrare i cambiamenti di tempo-dipendente nella localizzazione, conformazione, interazione e stato di assemblaggio in vivo o in vitro. Microscopi a fluorescenza convenzionali hanno una risoluzione spaziale di diffrazione limitata, che è ~ 200-300 nm in direzione laterale e ~ 500-700 nm in direzione assiale^1,

Protocol

1. microscopio Design e assemblaggio

1. Percorso di eccitazione
   Nota: Il percorso di eccitazione include laser, componenti (DIC) contrasto differenziale di interferenza, il corpo del microscopio e il suo braccio di illuminazione.
   1. Preparare una tabella ottica vibrazione-isolato. Ad esempio, una tabella di smorzamento strutturale di 48 x 96 x 12 ' dà spazio sufficiente per tutti i componenti.
      Nota: Costruire il set-up in una stanza con controllo della temperatura (ad es., 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilità della temperatura è fondamentale per mantenere l'allineamento ottico.
   2. Installare un corpo del microscopio che è eq....

Results

Questo microscopio permette flessibile e riproducibile di commutazione tra diversi metodi di imaging. Qui vi mostriamo immagini campione raccolti con ogni modulo imaging.

Figura 5 viene illustrato il PSF della molecola il lampeggiare durante l'acquisizione di SR. Migliaia di tali immagini vengono ricostruiti per generare l'immagine finale di SR (Figura 5E).

Discussion

Questo sistema di microscopio ibrido Elimina la necessità di acquistare più microscopi. Il costo totale per tutte le parti, compresa la tabella ottica, tabella installazione manodopera, software e workstation, è circa 230.000 $. Custom lavorati parti, tra cui la mag lente e lente 3D, un costo di circa $700 (il costo dipende da veri e propri addebiti presso diversi istituti). Tipico commercialmente disponibili sistemi integrati per la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola costato più di $300.000 ~ 400........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supporto per microscopio Nikon Ti-E	Obiettivo Nikon	Ti-E
Obiettivo	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Software di imaging per microscopia	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC include il modulo "JOBS", il modulo di acquisizione programmato utilizzato per l'imaging SR.
Il braccio di illuminazione	Nikon	Ti-TIRF-EM Unità illuminatore motorizzato M	Questo braccio è dotato di una fessura per una lente di ingrandimento
Blocco di analisi	Nikon	Ti-A	Questo è installato nella torretta del filtro.
Sistema di correzione della deriva Z	Nikon	PFS	Questo sistema è composto dal motore passo-passo sul revolver dell'obiettivo, dal LED IR e da un rivelatore.
Piano ottico da tavolo	TMC	783-655-02R
Basi ottiche da tavolo	TMC	14-426-35
Laser 647 nm	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diodo laser modulato 647nm 120mW incl. testa laser, scatola di controllo CDRH, cavo USB e alimentatore (unità di alimentazione)
Laser da 561 nm	1280721 coerente		OBIS 561nm LS 150mW Laser
System 488 nm	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diodo laser modulato 488nm 60mW incl. testa laser, scatola di controllo CDRH, cavo USB e alimentatore (unità di alimentazione)
Laser 405 nm	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, circolare, M2 < 1.3, basso rumore, CW, TTL fino a 20MHz. 2 connettori BNC per TTL & Regolatore analogico
Dissipatore di calore	Cobolt	11658 (HS-03)	Due unità, Dissipatore di calore senza ventola HS-03, Dissipatore di calore per laser a 647 nm e 488 nm
Dissipatore di calore	Dissipatore	di calore coerente 1193289	Obis con ventola, 165 x 50 x 50 mm per il laser a 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Due unità, cavo di comunicazione per laser a 647 nm e 488 nm
in alluminio per la regolazione dell'altezza	McMaster-Carr	9146T35	Alluminio 6061 multiuso, barra rettangolare, 4 mm x 40 mm, 1' di lunghezza per il sollevamento di 561 nm
di alluminio laser per la regolazione dell'altezza	McMaster-Carr	8975K248	Alluminio 6061 multiuso, 1-1/4" di spessore x 3" di larghezza x 1' di lunghezza per il sollevamento di un cavo BNC laser da 405 nm
	L-com	CC58C-6	RG58C, BNC maschio / maschio, adattatore BNC da 6,0 piedi
	L-com	BA1087	Adattatore coassiale, paratia BNC,
adattatore SMA a BNC	HOD	SMA-870	I laser Cobolt MLD sono dotati di interfaccia SMA, quindi questo adattatore viene utilizzato per il collegamento BNC.
Adattatore da SMB a BNC	Fairview Microwave	FMC1638316-12	Cavo da pannello SMB a BNC femmina RG316 Coassiale da 12 pollici per laser Obis coerenti
Scheda di acquisizione dati	Instruments	PCI-6723	a 13 bit, 32 canali, 800 kS/s Dispositivo di uscita analogico per il controllo di laser, LED DIC e così via
Controller della ruota del filtro barriera	Sutter Instrument Cambio	ottico
Lambda 10-BSplitter di emissione	Cairn	OptoSplit III
Dicroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dicroic beamsplitter che separa l'emissione rossa dall'emissione verde in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Beamsplitter dicroico che separa l'emissione verde e rossa dall'emissione blu in OptoSplit III
Filtro di emissione	Chroma	ET700/75M	Due unità, Filtro di emissione per l'emissione di rosso (come Alexa Fluor 647) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri a barriera
Filtro di emissione	Chroma	ET595/50M	Due unità, Filtro di emissione per l'emissione giallo/verde (come Cy3B) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri a barriera
Filtro di emissione	Chroma	ET525/50M	Due unità, Filtro di emissione per emissione blu (come Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri barriera
Filtro di emissione	Semrock	FF02-447/60-25	Filtro di emissione per emissione viola (come DAPI/Alexa Fluor 405), installate nella ruota portafiltri
Dicroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Divisore di fascio dicroico multibanda per eccitazioni laser da 647, 561, 488 e 405 nm all'interno del corpo del microscopio
Set di filtri DAPI	Chroma	49000	installato nel corpo del microscopio
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 filtro passa lungo	Chroma	T590LPXR-UF1	per la combinazione di laser da 647 nm e laser da 561 nm
525 filtro passa lungo	Chroma	T525LPXR-UF1	per la combinazione di laser già combinati da 647 nm e 561 nm con laser da 488 nm
Filtro passa lungo 470	Chroma	T470LPXR-UF1	per la combinazione di laser già combinati da 647 nm, 561 nm e 488 nm con laser da 405 nm
Filtro per pulizia laser (647)	Chroma	zet640/20x	per la pulizia di altre lunghezze d'onda dal laser a 647 nm
Filtro per pulizia laser (488)	Semrock	LL01-488-25	per la pulizia di altre lunghezze d'onda dal laser a 488 nm
Sorgente luminosa a LED	Excelitas	X-Cite120LED	utilizzato solo per l'imaging DAPI
Montatura a specchio	Newport	SU100-F3K
Montanti ottici	Newport	PS-2
Forcella di serraggio	Newport	PS-F
Misuratore di potenza	Newport	PMKIT	Per misurare la potenza del laser
Montatura per combinatore di fascio dicroico	Edmund Optics	58-872	Montatura cinematica C-Mount, per il fissaggio di combinatori di fascio dicroici nel gruppo di eccitazione laser
Anello di ritegno	Thorlabs	CMRR	utilizzato per montature per combinatori di fascio dicroico
Piastra adattatore in fibra	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Piastra adattatore in fibra con filettatura esterna SM1 (1.035"-40) Montatura
traslazionale sull'asse Z	Thorlabs	SM1Z	Supporto di Traslazione Asse Z,
Obiettivo Doppietto Acromatico	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø Doppietti acromatici montati da 5 mm, rivestiti AR: piastra a gabbia da 400 a 700 nm
	Thorlabs	CP1TM09	piastra a gabbia da 30 mm con filettature interne M9 x 0,5, asta di montaggio della gabbia del rubinetto 8-32
	Thorlabs	ER4	, lunga 4", Ø
Staffa di montaggio a gabbia	Thorlabs	CP02B	Staffa di montaggio a gabbia da 30 mm
Fibra ottica monomodale	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Cavo patch, PM, FC/PC a FC/APC, 405 nm, Panda,
fibra ottica multimodale	Thorlabs	M42L01	Ø 50 µ m, 0,22 NA, FC/PC-FC/PC Cavo patch in fibra, 1 m
Lente doppietta acromatica (lente magnetica)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25,0 mm, Ø Doppietto acromatico da 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente concava nella "lente magnetica"
Lente doppietta acromatica (lente magnetica)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø Doppietto acromatico da 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente convessa nella "lente magnetica"
Anello di ritenzione	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Anello di ritenzione in plastica per Ø Tubi e supporti per lenti da 1/2", per "mag lens"
Vite con punta in nylon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Vite di fissaggio con punta in nylon, lunghezza 6 mm, per il fissaggio di "lenti 3D"
Lenti 3D Ottica	laser CVI	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, telecamera EMCCD con obiettivo cilindrico rettangolare
	Andor	iXon Ultra 888
100 nm perline multicanale	Thermo	T7279, TetraSpeck microsfere colorante
rosso	Thermo	Alexa Fluor 647
colorante giallo-verde	GE Healthcare	Cy3
colorante verde	GE Healthcare	Cy3B
colorante blu	Thermo	Alexa Fluor 488