Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Summary

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Abstract

Microscopia di fluorescenza è un potente strumento per rilevare molecole biologiche in situ e monitorare le dinamiche e le interazioni in tempo reale. Oltre alla microscopia convenzionale epi-fluorescenza, varie tecniche di formazione immagine sono stati sviluppati per raggiungere specifici obiettivi sperimentali. Alcune delle tecniche ampiamente utilizzate includono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola (smFRET), che può segnalare cambiamenti conformazionali e interazioni molecolari con angstrom risoluzione e singola molecola basata sul rilevamento Super-risoluzione (SR) di imaging, che può migliorare la risoluzione spaziale di circa dieci a twentyfold rispetto alla microscopia a diffrazione limitata. Qui presentiamo un sistema integrato di cliente-progettato, che fonde più metodi di imaging in un microscopio, compreso formazione immagine convenzionale di epi-fluorescente, singola molecola basata su rilevazione SR imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, compreso formazione immagine smFRET. Diversi metodi di imaging possono essere ottenute facilmente e riproducibile elementi ottici di commutazione. Questo set-up è facile da adottare presso un laboratorio di ricerca in scienze biologiche con una necessità di routine e diversi esperimenti di imaging a un costo ridotto e spazio rispetto a costruire microscopi separati per scopi individuali.

Introduction

Microscopi a fluorescenza sono strumenti importanti per la ricerca moderna scienza biologica e formazione immagine di fluorescenza è effettuata ordinariamente in molti laboratori di biologia. Applicando a biomolecole di interesse con fluorofori, possiamo direttamente visualizzarli sotto il microscopio e registrare i cambiamenti di tempo-dipendente nella localizzazione, conformazione, interazione e stato di assemblaggio in vivo o in vitro. Microscopi a fluorescenza convenzionali hanno una risoluzione spaziale di diffrazione limitata, che è ~ 200-300 nm in direzione laterale e ~ 500-700 nm in direzione assiale^1,2e sono, pertanto, limitata a imaging presso il 100s di scala di nanometri micron. Al fine di rivelare i dettagli più fini nell'organizzazione o assemblaggio molecolare, sono stati sviluppati vari microscopie SR che possono rompere il limite di diffrazione. Strategie utilizzate per raggiungere SR includono effetti ottici non-lineari, quali emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia^3,4 e illuminazione strutturata microscopia (SIM)^{5,6, 7}, stocastico rilevazione di singole molecole, come ricostruzione ottico stocastico microscopia (tempesta)⁸ e fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM)⁹e una combinazione di entrambi, ad esempio MINFLUX¹⁰. Tra questi microscopie SR, microscopi SR basati sul rilevamento di singola molecola possono essere relativamente facilmente modificate da un set-up di microscopio di singola molecola. Con attivazione ripetitiva e la formazione immagine di proteine fluorescenti fuse (FPs) o coloranti foto-commutabile uploaded biomolecole di interesse, la risoluzione spaziale può raggiungere 10-20 nm¹¹. Per ottenere informazioni sulle interazioni molecolari e conformazionale dinamica in tempo reale, angstrom-nanometri risoluzione è necessaria. smFRET^12,13 è un approccio per ottenere questa risoluzione. Generalmente, a seconda le questioni biologiche di interesse, sono necessari metodi di formazione immagine con risoluzioni spaziali diverse.

In genere, per ogni tipo di imaging, configurazione ottica eccitazione e/o emissione specifica è necessaria. Per esempio, uno dei metodi più comunemente utilizzati illuminazione per il rilevamento di singola molecola è attraverso la riflessione interna totale (TIR), in cui un angolo specifico di eccitazione deve essere ottenuta attraverso un prisma o attraverso la lente dell'obiettivo. Per il rilevamento di smFRET, le emissioni da donatore e accettore coloranti devono essere spazialmente separate e diretto a diverse parti del elettrone-moltiplicando, charge coupled device (EMCCD), che può essere raggiunto con una serie di specchi e dicroico beam splitter inseriti nel percorso di emissione. Per tridimensionale (3D) SR imaging, un componente ottico, come una lente cilindrica¹⁴, è necessario per causare un effetto di astigmatismo nel percorso di emissione. Pertanto, autocostruito o commercialmente disponibile integrati microscopi sono, solitamente, funzionalmente specializzati per ogni tipo di metodo di imaging e non sono flessibili per passare tra diversi metodi di formazione immagine sull'assetto stesso. Qui presentiamo un sistema ibrido conveniente, che fornisce opzioni regolabili e riproducibili tra tre diversi metodi di imaging: imaging convenzionale di epi-fluorescente con diffrazione limitata risoluzione, singola molecola basata su rilevazione SR Imaging e rilevazione di singola molecola multi-colore, compresi smFRET imaging (Figura 1A). In particolare, il set-up presentato qui contiene accoppiati in fibra laser input per l'eccitazione di multi-colore e programmato un braccio commerciale illuminazione sul sentiero di eccitazione, che permette di controllo dell'angolo di eccitazione, per passare da epi-modalità e TIR. Nel percorso di emissione, una cassetta di lente cilindrica autocostruito rimovibile viene inserita all'interno del corpo del microscopio per l'imaging 3D SR e un divisore di fascio commerciale viene inserito prima di una macchina fotografica EMCCD che possa essere abilitata in modo selettivo per rilevare più canali di emissione contemporaneamente.

Protocol

1. microscopio Design e assemblaggio

1. Percorso di eccitazione
   Nota: Il percorso di eccitazione include laser, componenti (DIC) contrasto differenziale di interferenza, il corpo del microscopio e il suo braccio di illuminazione.
   1. Preparare una tabella ottica vibrazione-isolato. Ad esempio, una tabella di smorzamento strutturale di 48 x 96 x 12 ' dà spazio sufficiente per tutti i componenti.
      Nota: Costruire il set-up in una stanza con controllo della temperatura (ad es., 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilità della temperatura è fondamentale per mantenere l'allineamento ottico.
   2. Installare un corpo del microscopio che è equipaggiato con un braccio di illuminazione per il collegamento in fibra ottica, a 100 X lente obiettiva TIRF di immersione in olio e componenti DIC.
   3. Inserire quattro teste del laser (647 nm, 561 nm, 488 nm e 405 nm, circondata in Figura 1B) e dissipatori di calore di loro sul tavolo ottico, e assicurarsi che i raggi laser emessi hanno la stessa altezza e sono più corto possibile assicurare la buona stabilità (ad es. 3 ').
      Nota: Se una testa laser si trova ad un'altezza inferiore rispetto alle altre stampanti laser, è possibile mettere una piastra di alluminio con spessore adeguato sotto di esso. Sempre garantire il massimo contatto tra i dissipatori di calore e la tabella ottica per la migliore dissipazione di calore (Figura 1B). I laser devono essere abbastanza potente per l'imaging di SR. Vedere la tabella dei materiali. Si consiglia di avere laser pulizia filtri davanti a diodi laser.
   4. Installare una scheda di acquisizione dati attraverso un'interfaccia di peripheral component interconnect (PCI) in una workstation e collegare i laser con questa scheda. Controllare i comportamenti di ON/OFF dei laser di logica del transistore-transistore (TTL) uscita e loro regolazione della potenza di uscita analogica di questa scheda (Figura 1). Installare un'adeguato microscopia imaging software (commerciale o autocostruito) per controllare la scheda di acquisizione dati, così come il corpo del microscopio.
   5. Montare la specchi dicroici beam splitter (590, 525 e 470 filtri passa-lungo) ai loro rispettivi supporti. Utilizzare supporti specchio molto stabile per gli specchi. Utilizzare separatori circolari con anelli di sicurezza per evitare qualsiasi flessione dei dicroici beam splitter (Figura 1).
   6. Posizionare gli specchi e dicroico beam splitter sul tavolo ottico per combinare i raggi laser (Figura 1B). Per ottenere l'allineamento più stabile, rendere l'intera disposizione più compatto possibile e utilizzare 1 '-spessore ottico post. Disporre i laser in modo che i laser di lunghezza d'onda più corti sono più vicini all'accoppiamento di fibra ottica (Figura 1B) poiché onda corta luci dissipano più nell'aria.
   7. Combinare i raggi laser in una fibra ottica monomodale. A tale scopo, è necessario costruire un accoppiatore di fibra in un sistema di gabbia attraverso le seguenti fasi:
      1. Montare una piastra adattatore fibra in un Monte di traduzione dell'asse z (Figura 1E, pannello all'estrema sinistra).
      2. Monta un obiettivo di doppietto acromatico (lunghezza focale = 7,5 mm) in un piatto di gabbia (Figura 1E, secondo pannello da sinistra).
      3. Collegare le due parti sopra di aste di prolunga per formare una gabbia. Montare la gabbia sul tavolo ottico con staffe di montaggio sui posti 1 ' di spessore ottici (Figura 1E, pannello centrale).
      4. Allineare il laser 647-nm prima con una fibra ottica monomodale (conclusione FC/APC l'accoppiatore).
         Nota: Un allineamento grossolano utilizzando una fibra ottica multi-mode prima di utilizzare la fibra ottica monomodale può aiutare il processo di allineamento. Regolare gli angoli di specchi e dicroico beam splitter (Figura 1, di manopole di regolazione), così come la distanza tra la lente doppietto acromatico e la piastra dell'adattatore della fibra (Figura 1E, regolando Monte traduzione di z-asse) per ottenere uscita di potenza massima laser attraverso la fibra.
      5. Una volta fatto l'allineamento del primo laser, temporaneamente installare una coppia di Iris e allineare il resto dei laser uno (Figura 1F). Verificare l'efficienza di allineamento con un misuratore di potenza.
      6. Lasciare un iride nella parte anteriore della piastra di adattamento per ridurre i riflessi dei laser.
         Nota: Strong indietro riflessioni possono ridurre la durata delle sorgenti laser. Facoltativamente, un isolatore ottico può essere installato fronte ogni testa laser per rimuovere completamente i riflessi.
   8. Collegare l'altra estremità della fibra ottica per il braccio di illuminazione del microscopio (Figura 1 H).
   9. Progettare e installare il "ingrandimento lente (mag)" attraverso le seguenti fasi:
      Nota: Il laser può essere utilizzato per l'imaging di epi-fluorescenza del campione, ma la dimensione del fascio stretto di ogni laser limita l'area illuminata del campione di un'area più volte più piccola rispetto alle dimensioni effettive del sensore della fotocamera corrispondente, soprattutto per i più recenti macchine fotografiche (con 18,8 mm di lunghezza diagonale rispetto alla convenzionale lunghezza 11,6-mm). Pertanto, è auspicabile per espandere il raggio per ottenere un'illuminazione più grande e più piatta del campione.
      1. Progettare la lente mag, che può adattarsi al braccio di illuminazione (Figura 1 H).
         Nota: Il design della lente mag dipende dove che verrà installato. Figura 1 H Mostra un esempio dell'installazione del braccio di illuminazione, ma può essere installato in qualsiasi posto dopo i fasci laser sono collimato (Vedi discussione). Progettare con un computer-aided design e software di disegno.
      2. Posizionare due lenti acromatiche, una concava (lunghezza focale = f₁) e uno convesso (lunghezza focale = f₂) nel porta-lente fatta in casa mag (Figura 2A e 2C), con la distanza uguale alla somma delle loro lunghezze focali, f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (Figura 2B).
         Nota: Con questa scelta di lunghezze focali, la lente di mag si espande il fascio da f₂/ | f₁| = 2 pieghe. L'obiettivo di mag fornisce la versatilità. Può essere rimosso per riprendere la normale illuminazione senza espandere le travi (Figura 2D) o inserito nella direzione inversa per focalizzare il fascio laser per ottenere una maggiore intensità di eccitazione.

2. percorso di emissione

Nota: Il percorso di emissione è composto da una lente cilindrica rimovibile, una ruota portafiltri barriera, uno splitter di emissione e una fotocamera EMCCD (Figura 1). Per raggiungere il miglior punto di diffondere la funzione (PSF) di singole molecole, il prisma DIC è messo dalla lente dell'obiettivo.

1. -Progettazione personalizzata la cassetta cilindrica lente (3D), che può adattarsi l'analizzatore DIC manuale inserire slot nel corpo del microscopio (Figura 3).
   Nota: Questo disegno non compromette l'analizzatore DIC poiché un blocco di analizzatore può essere inserito nella torretta filtro.
2. Posizionare la lente 3D di 10 m di lunghezza focale nella cassetta e inserire il percorso del raggio di emissione per creare l'effetto di astigmatismo necessari per l'estrazione la coordinata z di ogni singola molecola¹⁴.
   Nota: Facoltativamente, la cassetta di lente 3D posizionabile in o fuori del percorso di emissione (Figura 3).
3. Installare un divisore di fascio dicroica multi-banda della torretta di filtro all'interno del corpo del microscopio.
4. Emissione dei filtri.
   Nota: I filtri di emissione vengono scelti a seconda i fluorophores preferito. A seconda del modulo imaging, filtri di emissione collocati in sedi diverse vengono utilizzati come descritto di seguito:
   1. Per sequenziale multi-colore epi-fluorescenza o SR imaging, è possibile utilizzare filtri di emissione inseriti nella ruota filtro barriera collegata accanto al corpo del microscopio per ridurre al minimo le vibrazioni nel corpo del microscopio durante switch channel (Figura 1).
   2. Per la rilevazione simultanea multi-colore (per esempio, esperimenti di smFRET), inserire un altro filtro impostato in uno splitter di emissione (controllo passaggio 4 per i dettagli).
      Nota: Solitamente, uno splitter commerciale emissione ha due modalità commutabile ("cioè, impegnato" o modalità di "bypassare"). Per separare le luci di emissione cromaticamente per simultanea multi-color imaging (modalità "impegnato"), viene utilizzato un cubo di filtro che tiene due divisori di fascio dicroici e tre filtri di emissione ("Tripla cubo," Figura 4 e 4 D). Uno slot vuoto nella ruota filtro barriera è usato in combinazione con il cubo triplo. D'altra parte, sequenziale multi-color imaging, per il cubo triplo è sostituito da un cubo che ha solo uno specchio all'interno ("bypass cubo," Figura 4A e 4D).
5. Installare la telecamera EMCCD come l'ultima parte del percorso delle emissioni. Utilizzare la connessione USB-PCI per ottenere un veloce frame rate.
   Nota: Una telecamera EMCCD è consigliata per la rilevazione di singola molecola più sensibile, ma una fotocamera avanzata sCMOS può essere un'alternativa.

3. diffrazione limitata di Imaging con Epi-eccitazione

1. Regolare l'angolo incidentali dei laser di eccitazione epi-modalità al braccio di illuminazione.
2. Disinnestare la lente 3D se impegnati (Figura 3, pannello di destra).
3. Inserire il cubo di bypass nello splitter di emissione (Figura 4A e 4E, pannello inferiore).
4. (Opzionale) Inserire l'obiettivo di mag per una zona di illuminazione ampliato (Figura 2D, pannello di sinistra).
   Nota: Con l'uso di una lente di mag e un 100 X obiettivo di immersione in olio, circa 91 x 91 µm² può essere illuminato in modo uniforme, eliminando la necessità di utilizzare una sorgente di luce bianca e più cubi di filtro.
5. Utilizzare una microscopia software di prendere multi-canale, di imaging e/o Z-stack e/o immagini time-lapse.
   Nota: Ci sono più programmi disponibili per formazione immagine di microscopia, non solo da microscopio produttori, ma anche da società terze o sviluppatori open source.

4. multi-canale singola molecola Imaging compreso smFRET

Nota: Spostare in una posizione "vuota" nella ruota filtro barriera, affinché tutte le emissioni con qualsiasi lunghezza d'onda possono raggiungere per il secondo set di filtri/dicroico beam splitter nella barra di divisione di emissione.

1. Per impostare il rilevamento di singola molecola multi-colore di molecole di superficie-immobilizzata¹⁵ con eccitazione TIRF, compreso la misura di smFRET, regolare il angolo accidentali dei laser di eccitazione per l'angolo TIRF. Disinnestare la lente mag e la lente 3D.
2. Attivazione della modalità di tre canali nello splitter di emissione (Figura 1) attraverso le seguenti fasi:
   1. Sostituire il cubo di bypass con un "cubo di calibrazione" che permette alla luce di passare attraverso tutti i canali (Figura 4B e 4E).
   2. Accendere la fotocamera sotto DIC (cioè, nessun filtro di emissione nella ruota filtro barriera) e regolare l'apertura della barra di divisione di emissione fino a tre canali completamente separati appaiono sullo schermo.
      Nota: Eseguire questo passaggio con la luce di camera illuminata, per visualizzare tutti i canali.
   3. Ruotare le manopole di controllo regolazione verticale/orizzontale sulla barra di divisione di emissione e allineare approssimativamente i tre canali (Figura 4E e 4F).
   4. Spegnere la fotocamera e sostituire il cubo di calibrazione con un cubo triplo (Figura 4 e 4E).
   5. Posizionare un campione con perline multicanale di 100 nm in cima il 100x obiettivo e messa a fuoco sul campione.
   6. Accendere la fotocamera e il laser di 488 nm, zoomare su una delle perle luminose e finemente allineare i tre canali ruotando nuovamente la regolazione controllo manopole (Figura 4E e 4G).
      Nota: 100 nm multicanale perline emettono lunghezze d'onda della luce di eccitazione 488 nm, che permette l'allineamento di tre canali.
3. Accendere la fotocamera e laser, messa a fuoco e trovare una buona posizione con una densità del punto ragionevole. Regolare il tempo di esposizione e potenza laser per raggiungere livelli di segnale-rumore e photobleaching. Utilizzare il software di imaging microscopia per prendere immagini time-lapse.

5. SR Imaging

Nota: Questa è la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola.

1. Per impostare la formazione immagine SR, inserire la lente 3D e rimuovere la lente di mag. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera nei canali laser appropriato (ad esempio, 5-60 ms). Determinare e impostare manualmente il angolo accidentali dei laser di eccitazione ottimale per essere l'angolo TIRF.
2. Il campione viene posto in SR buffer¹⁶di imaging. Permettere al tampone di equilibrare per almeno 10 minuti prima di formazione immagine.
   Nota: Buffer di imaging SR scade dopo circa 1 h, quindi assicuratevi di nuovo SR imaging buffer di conseguenza.
3. Prendete un'immagine DIC prima formazione immagine SR. Al fine di trovare la corretta altezza obiettiva per SR, che ottimizza l'effetto di astigmatismo, utilizzare DIC imaging per trovare il piano intermedio delle cellule. Identificare il piano per l'altezza a cui le cellule di transizione da "light" per immagini "scuri" e sembrano diventare trasparente (Figura 5A, 5Be 5C). Una volta determinato il piano focale desiderato, coinvolgere il sistema di correzione z-drift (Figura 1A).
4. Condurre la formazione immagine SR. Modificare la potenza laser 405 nm per mantenere una ragionevole densità di 'lampeggiante-on' macchie.
   Nota: Mentre è possibile modificare manualmente il laser di 405 nm, è più conveniente eseguire un codice di acquisizione dati programmati per mantenere la densità dei punti "lampeggiante-su". Ecco un esempio di come è condotta automaticamente. Il codice sorgente è disponibile su richiesta (Figura 6).
   1. Iniziare l'acquisizione di immagine con 0 W/cm² laser viola potenza.
   2. Contare il numero di lampeggiante su punti in un determinato periodo.
   3. Consente di modulare la potenza laser viola in modo che il numero di spot il lampeggiante è mantenuto soglia un user-defined"conteggio" nel campo visivo. Aumentare la potenza del laser viola quando il numero di lampeggiante su spot scende sotto la soglia di conteggio.
   4. Terminare l'acquisizione quando il numero di lampeggiante su spot scende sotto la soglia di conteggio utilizzando la potenza massima laser viola.
      Nota: Il massimo può essere impostata in modo diverso a seconda della luminosità di campione, ma non superiore a 130 W/cm². A seconda l'obiettivo reale dell'imaging SR, questo codice di acquisizione automatica può essere interrotta manualmente in qualsiasi punto desiderato.
5. Controllare il comportamento lampeggia e PSF delle macchie presto dopo l'inizio dell'acquisizione.
   Nota: Se il comportamento lampeggio non è ideale, cambiare angolo accidentali dei laser di eccitazione o sostituire il buffer di imaging. Aspettatevi un campionamento di "verticale", "orizzontale" e "diamond" forme di FPF, che rappresenta fluorofori da sotto, sopra e all'interno del piano focale, rispettivamente (Figura 5). Se la maggior parte delle macchie Visualizza PSF orizzontale o verticale, quindi il piano focale è fuori dal centro delle cellule, quindi terminare l'esperimento e regolare nuovamente il piano focale. Una presenza di bolle d'aria nell'olio di immersione o altri fattori locali può influenzare la qualità degli PSF, quindi potrebbe essere necessario sostituire l'olio o passare a una diversa area di imaging del campione.
6. Per l'analisi di dati, utilizzare open source (nel plugin di ImageJ NIH) o codici commercialmente disponibili per rilevare i centroidi di ogni spot in ogni fotogramma di imaging ed estrarre valori z di ogni spot da x - e y-larghezze¹⁴.
   Nota: In questo rapporto, un codice sorgente sviluppato originariamente in una delle prime singola molecola basata su rilevazione SR⁸ fu modificato per rilevazione 3D¹⁶ ed è stato usato.
7. Nel caso di formazione immagine di due colori, immagini il fluoroforo con la lunghezza d'onda di eccitazione, seguito da quello con la minore lunghezza d'onda di eccitazione. Eseguire il codice di acquisizione automatizzata Analogamente a quello descritto al punto 5.4, ma con un diverso laser imaging.
   Nota: è necessario correggere aberrazione cromatica tra le immagini con diversi fluorofori (ad es., colorante rosso e giallo-verde colorante). Ecco i passaggi.
   1. Immobilizzare più 100 nm multicanale perline su vetrino coprioggetti, evitando che formano i mazzi.
   2. Prendere le immagini di loro in canali diversi di eccitazione.
   3. Estratto di (X, Y, Z) Coordinate dal software (punto 5.6).
   4. Trama ΔX_ho = X_1i - X_2i e ΔY_i = Y_1i - Y_2i (i è per sfere diverse, e 1 e 2 sono i canali di colore diverso) separatamente e farli stare con funzioni proprie. Salvare le funzioni.
      Nota: Le funzioni lineari sono sufficienti nella maggior parte dei casi. Una volta che queste funzioni sono determinate, questa misura non deve essere ripetuta ogni volta di imaging.
   5. Nell'imaging di SR due colori effettivo di un campione di interesse, è possibile applicare le funzioni a (X, Y) correggere l'aberrazione cromatica. Per z-direzionale aberrazione cromatica, la condotta di ottenere ΔZ = Z₁ - Z₂ per perline multicanale o campioni multicanale di riferimento noto seminati insieme con il campione di interesse.
      Nota: a differenza di (X, Y) aberrazione cromatica, aberrazione cromatica z-direzionale non è ben riproducibile in ogni esperimento, principalmente a causa di manutenzione incompleta z-direzionale focus sulla commutazione dei canali. Così, si consiglia di effettuare la correzione ogni volta. ΔZ = Z₁ - Z₂ è per lo più indipendenti di (X, Y), quindi, solo un paio di perline o campioni di riferimento sarebbe sufficienti per ciascuna area campione di interesse. Tracciare le immagini di SR due colori finali costruite in un software di visualizzazione 3D e controllare ΔZ manualmente.

Results

Questo microscopio permette flessibile e riproducibile di commutazione tra diversi metodi di imaging. Qui vi mostriamo immagini campione raccolti con ogni modulo imaging.

Figura 5 viene illustrato il PSF della molecola il lampeggiare durante l'acquisizione di SR. Migliaia di tali immagini vengono ricostruiti per generare l'immagine finale di SR (Figura 5E).

Discussion

Questo sistema di microscopio ibrido Elimina la necessità di acquistare più microscopi. Il costo totale per tutte le parti, compresa la tabella ottica, tabella installazione manodopera, software e workstation, è circa 230.000 $. Custom lavorati parti, tra cui la mag lente e lente 3D, un costo di circa $700 (il costo dipende da veri e propri addebiti presso diversi istituti). Tipico commercialmente disponibili sistemi integrati per la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola costato più di $300.000 ~ 400....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supporto per microscopio Nikon Ti-E	Obiettivo Nikon	Ti-E
Obiettivo	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Software di imaging per microscopia	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC include il modulo "JOBS", il modulo di acquisizione programmato utilizzato per l'imaging SR.
Il braccio di illuminazione	Nikon	Ti-TIRF-EM Unità illuminatore motorizzato M	Questo braccio è dotato di una fessura per una lente di ingrandimento
Blocco di analisi	Nikon	Ti-A	Questo è installato nella torretta del filtro.
Sistema di correzione della deriva Z	Nikon	PFS	Questo sistema è composto dal motore passo-passo sul revolver dell'obiettivo, dal LED IR e da un rivelatore.
Piano ottico da tavolo	TMC	783-655-02R
Basi ottiche da tavolo	TMC	14-426-35
Laser 647 nm	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diodo laser modulato 647nm 120mW incl. testa laser, scatola di controllo CDRH, cavo USB e alimentatore (unità di alimentazione)
Laser da 561 nm	1280721 coerente		OBIS 561nm LS 150mW Laser
System 488 nm	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diodo laser modulato 488nm 60mW incl. testa laser, scatola di controllo CDRH, cavo USB e alimentatore (unità di alimentazione)
Laser 405 nm	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, circolare, M2 < 1.3, basso rumore, CW, TTL fino a 20MHz. 2 connettori BNC per TTL & Regolatore analogico
Dissipatore di calore	Cobolt	11658 (HS-03)	Due unità, Dissipatore di calore senza ventola HS-03, Dissipatore di calore per laser a 647 nm e 488 nm
Dissipatore di calore	Dissipatore	di calore coerente 1193289	Obis con ventola, 165 x 50 x 50 mm per il laser a 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Due unità, cavo di comunicazione per laser a 647 nm e 488 nm
in alluminio per la regolazione dell'altezza	McMaster-Carr	9146T35	Alluminio 6061 multiuso, barra rettangolare, 4 mm x 40 mm, 1' di lunghezza per il sollevamento di 561 nm
di alluminio laser per la regolazione dell'altezza	McMaster-Carr	8975K248	Alluminio 6061 multiuso, 1-1/4" di spessore x 3" di larghezza x 1' di lunghezza per il sollevamento di un cavo BNC laser da 405 nm
	L-com	CC58C-6	RG58C, BNC maschio / maschio, adattatore BNC da 6,0 piedi
	L-com	BA1087	Adattatore coassiale, paratia BNC,
adattatore SMA a BNC	HOD	SMA-870	I laser Cobolt MLD sono dotati di interfaccia SMA, quindi questo adattatore viene utilizzato per il collegamento BNC.
Adattatore da SMB a BNC	Fairview Microwave	FMC1638316-12	Cavo da pannello SMB a BNC femmina RG316 Coassiale da 12 pollici per laser Obis coerenti
Scheda di acquisizione dati	Instruments	PCI-6723	a 13 bit, 32 canali, 800 kS/s Dispositivo di uscita analogico per il controllo di laser, LED DIC e così via
Controller della ruota del filtro barriera	Sutter Instrument Cambio	ottico
Lambda 10-BSplitter di emissione	Cairn	OptoSplit III
Dicroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dicroic beamsplitter che separa l'emissione rossa dall'emissione verde in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Beamsplitter dicroico che separa l'emissione verde e rossa dall'emissione blu in OptoSplit III
Filtro di emissione	Chroma	ET700/75M	Due unità, Filtro di emissione per l'emissione di rosso (come Alexa Fluor 647) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri a barriera
Filtro di emissione	Chroma	ET595/50M	Due unità, Filtro di emissione per l'emissione giallo/verde (come Cy3B) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri a barriera
Filtro di emissione	Chroma	ET525/50M	Due unità, Filtro di emissione per emissione blu (come Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III e nella ruota portafiltri barriera
Filtro di emissione	Semrock	FF02-447/60-25	Filtro di emissione per emissione viola (come DAPI/Alexa Fluor 405), installate nella ruota portafiltri
Dicroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Divisore di fascio dicroico multibanda per eccitazioni laser da 647, 561, 488 e 405 nm all'interno del corpo del microscopio
Set di filtri DAPI	Chroma	49000	installato nel corpo del microscopio
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 filtro passa lungo	Chroma	T590LPXR-UF1	per la combinazione di laser da 647 nm e laser da 561 nm
525 filtro passa lungo	Chroma	T525LPXR-UF1	per la combinazione di laser già combinati da 647 nm e 561 nm con laser da 488 nm
Filtro passa lungo 470	Chroma	T470LPXR-UF1	per la combinazione di laser già combinati da 647 nm, 561 nm e 488 nm con laser da 405 nm
Filtro per pulizia laser (647)	Chroma	zet640/20x	per la pulizia di altre lunghezze d'onda dal laser a 647 nm
Filtro per pulizia laser (488)	Semrock	LL01-488-25	per la pulizia di altre lunghezze d'onda dal laser a 488 nm
Sorgente luminosa a LED	Excelitas	X-Cite120LED	utilizzato solo per l'imaging DAPI
Montatura a specchio	Newport	SU100-F3K
Montanti ottici	Newport	PS-2
Forcella di serraggio	Newport	PS-F
Misuratore di potenza	Newport	PMKIT	Per misurare la potenza del laser
Montatura per combinatore di fascio dicroico	Edmund Optics	58-872	Montatura cinematica C-Mount, per il fissaggio di combinatori di fascio dicroici nel gruppo di eccitazione laser
Anello di ritegno	Thorlabs	CMRR	utilizzato per montature per combinatori di fascio dicroico
Piastra adattatore in fibra	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Piastra adattatore in fibra con filettatura esterna SM1 (1.035"-40) Montatura
traslazionale sull'asse Z	Thorlabs	SM1Z	Supporto di Traslazione Asse Z,
Obiettivo Doppietto Acromatico	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø Doppietti acromatici montati da 5 mm, rivestiti AR: piastra a gabbia da 400 a 700 nm
	Thorlabs	CP1TM09	piastra a gabbia da 30 mm con filettature interne M9 x 0,5, asta di montaggio della gabbia del rubinetto 8-32
	Thorlabs	ER4	, lunga 4", Ø
Staffa di montaggio a gabbia	Thorlabs	CP02B	Staffa di montaggio a gabbia da 30 mm
Fibra ottica monomodale	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Cavo patch, PM, FC/PC a FC/APC, 405 nm, Panda,
fibra ottica multimodale	Thorlabs	M42L01	Ø 50 µ m, 0,22 NA, FC/PC-FC/PC Cavo patch in fibra, 1 m
Lente doppietta acromatica (lente magnetica)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25,0 mm, Ø Doppietto acromatico da 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente concava nella "lente magnetica"
Lente doppietta acromatica (lente magnetica)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø Doppietto acromatico da 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente convessa nella "lente magnetica"
Anello di ritenzione	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Anello di ritenzione in plastica per Ø Tubi e supporti per lenti da 1/2", per "mag lens"
Vite con punta in nylon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Vite di fissaggio con punta in nylon, lunghezza 6 mm, per il fissaggio di "lenti 3D"
Lenti 3D Ottica	laser CVI	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, telecamera EMCCD con obiettivo cilindrico rettangolare
	Andor	iXon Ultra 888
100 nm perline multicanale	Thermo	T7279, TetraSpeck microsfere colorante
rosso	Thermo	Alexa Fluor 647
colorante giallo-verde	GE Healthcare	Cy3
colorante verde	GE Healthcare	Cy3B
colorante blu	Thermo	Alexa Fluor 488