Articolo metodologico

Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

DOI:

10.3791/58339

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22 ottobre 2018

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1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

In questo articolo

Sommario

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È descritto un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per identificare la fase S e analizzare le dinamiche del ciclo cellulare in c. elegans ermafrodita germinale utilizzando la timidina EdU analogico. Questo metodo non richiede nessun transgeni ed è compatibile con la macchiatura immunofluorescente.

Abstract

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Analisi del ciclo cellulare negli eucarioti utilizza frequentemente la morfologia del cromosoma, espressione e/o localizzazione di prodotti genici necessari per le varie fasi del ciclo cellulare, o l'incorporazione di analoghi nucleosidici. Durante la fase S, polimerasi del DNA incorporare gli analoghi della timidina come EdU o BrdU nel DNA cromosomico, marcatura delle cellule per l'analisi. Per c. elegans, il nucleoside analogico EdU durante regolare cultura è alimentata con i vermi ed è compatibile con tecniche di immunofluorescenza. La linea germinale di c. elegans è un sistema potente modello per gli studi di segnalazione vie, cellule staminali, meiosi e ciclo cellulare perché è trasparente, geneticamente facile e Profase Meiotica e differenziazione cellulare/gametogenesi si verificano in un lineare Assemblea-come la moda. Queste caratteristiche rendono EdU un ottimo strumento per studiare aspetti dinamici delle cellule mitoticamente ciclismo e sviluppo di germline. Questo protocollo viene descritto come correttamente preparare EdU batteri, nutrirli wild-type c. elegans ermafroditi, sezionare la gonade ermafrodita, macchia per EdU incorporazione nel DNA, macchia con gli anticorpi per rilevare vari ciclo cellulare e gli indicatori dello sviluppo, la gonade di immagine e analizzare i risultati. Il protocollo descrive le variazioni nel metodo e nell'analisi per la misurazione della fase S indice, M-fase indice, G2 durata, durata del ciclo cellulare, tasso di entrata meiotica e tasso di progressione della Profase Meiotica. Questo metodo può essere adattato per studiare il ciclo cellulare o la storia di cella in altri tessuti, fasi, ambiti di provenienza genetici e condizioni fisiologiche.

Introduzione

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Nello sviluppo animale, centinaia, migliaia, milioni, miliardi o anche migliaia di miliardi di divisioni cellulari è necessari per formare l'organismo adulto. Il ciclo cellulare, il set di eventi cellulari composto di G1 (gap), S (sintesi), G2 (gap), e M (mitosi) definire la serie di eventi che vengono eseguiti ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare è dinamico e meglio apprezzato in tempo reale, che può essere tecnicamente difficile. Le tecniche presentate in questo protocollo permettono di effettuare le misurazioni delle fasi e la tempistica del ciclo cellulare da immagini fisse.

Etichettatura con analoghi nucleosidici come 5-Etinil-2'-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) è il gold standard per identificare la fase S negli studi della dinamica del ciclo cellulare nell'adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline ermafroditi1,2,3,4,5. EdU sia BrdU utilizzabile in quasi qualsiasi background genetico, come che non si basano su qualsiasi costrutto genetico. Visualizzazione di BrdU richiede duro trattamento chimico per esporre l'antigene per l'anticorpo anti-BrdU colorazione, che spesso è incompatibile con la valutazione di altri markers cellulari visualizzati dalla co-macchiatura con altri anticorpi. Al contrario, visualizzazione EdU si verifica dalla chimica clicca in condizioni blande e quindi è compatibile con l'anticorpo co-macchiatura6,7.

La specificità dell'etichetta è chiara, dal momento che i nuclei solo incorporano gli analoghi (5-Etinil-2'-deoxyuridine) della timidina in DNA durante la fase S. Visualizzazione avviene nel tessuto fisso. L'etichetta di EdU è invisibile da solo fino a un colorante contenenti azide o fluorophore reagisce covalentemente con alchini in EdU di rame-catalizzata clic chimica8. EdU etichettatura può fornire informazioni immediate su cui i nuclei sono in fase S, utilizzando un breve impulso di etichettatura. EdU possono anche fornire informazioni dinamiche, utilizzando pulse-chase o etichettatura continuo; ad esempio, in un esperimento di pulse-chase, l'etichetta è diluita a ogni divisione cellulare o propagate come nondividing cellule progresso attraverso lo sviluppo.

C. elegans ermafrodita germinale è un sistema potente modello per gli studi del ciclo cellulare, cellule staminali, meiosi e vie di segnalazione. La linea germinale adulta è una linea di assemblaggio polarizzata con cellule staminali presenti all'estremità distale, seguita da voce e progressione attraverso Profase Meiotica, coordinato con le fasi della gametogenesi più prossimalmente (Figura 1). L'estremità prossimale, ovociti maturo, sono ovulati e fertilizzato e cominciano l'embriogenesi nel utero9,10,11. La regione lungo ~ 20 cella-diametro accanto alla cella di punta distale, che include il gambo di germline mitotically ciclismo, cellule progenitrici e le cellule di S-fase meiotiche ma non le cellule in Profase Meiotica, viene chiamata il progenitore zona2,4 , 9 , 12. le membrane delle cellule forniscono incompleta separazione tra i nuclei la linea germinale distale, ma la zona cellule progenitrici subiscono mitotica cellulare ciclismo in gran parte in modo indipendente. La durata mediana ciclo cellulare mitotica delle cellule di zona progenitrici di germline in giovane adulti ermafroditi è ~6.5 h; Fase G1 è breve o assente, e quiescenza non è osservato1,2,13. Differenziazione delle cellule staminali germinali si verifica attraverso la differenziazione essenzialmente diretta e quindi manca di transito-amplificando divisioni4. Durante la differenziazione nel pachitene, circa 4 su 5 nuclei non si formano gli ovociti ma invece andare incontro ad apoptosi, in qualità di infermiera cellule donando loro contenuto citoplasmatico di sviluppo dell'ovocita12,14 , 15.

Oltre alle etichette cellule in fase S con analoghi nucleosidici, si possono identificare le cellule in mitosi e meiosi usando la macchiatura dell'anticorpo. Nuclei in mitosi sono immunoreactive all'anti-fosfo-istone H3 (Ser10) anticorpo (chiamato pH3)7,16. Nuclei in meiosi sono immunoreactive all'anticorpo anti-lui-3 (una proteina di asse meiotic del cromosoma)17. I nuclei nella zona del progenitore possono essere identificati dall'assenza di HIM-3, la presenza di adrenocorticale REC-818o la presenza di WAPL-119. WAPL-1 intensità è massima nella gonade somatica, alta nella zona del progenitore e basso durante i primi meiotica prophases19. Diverse misurazioni del ciclo cellulare sono possibili con poche variazioni nel protocollo: I) identificare i nuclei in fase S e misurare l'indice di S-fase; II) identificare i nuclei in fase M e misurare l'indice di fase M; III) determinano se i nuclei erano nella S-fase mitotica o meiotica; IV) misurare la durata di G2; V) misura la duartion delle fasi G1 + G2 + M; VI) misura il tasso di entrata meiotica; VII) stimare il tasso di progressione meiotica.

Si possono fare misurazioni multiple del ciclo cellulare da solo alcuni tipi di esperimenti di laboratorio bagnato. Il protocollo sottostante descrive un 30 min impulso etichettatura alimentandosi di c. elegans adulti ermafroditi con EdU etichettato batteri e cellule co-etichettatura di M-fase macchiando con progenitore e degli anticorpi anti-pH3 zona cellule macchiando con anticorpo anti-WAPL-1. Soltanto i cambiamenti nella durata della EdU feed (punto 2.5), tipo di anticorpi impiegati (punto 5), e sono necessarie per le misure ulteriori analisi (punto 8.3).

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Protocollo

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1. preparazione di EdU-identificati batteri

  1. Crescere una coltura starter di MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) trasporta una mutazione in thyA.
    1. Striscia fuori MG1693 di Escherichia coli da uno stock di glicerolo congelato su un agar di brodo (LB) di 120 mm Lisogenesi di Petri. Coltura a 37 ° C durante la notte.
    2. Inoculare da due singoli e. coli MG1693 colonie in due duplicare 4 mL provette di coltura liquida lb a 37 ° C per ~ 16 h.
      Nota: La MG1693 cresce bene in LB senza completare con timina o della timidina.
  2. Crescere e. coli MG1693 in media minimi completati con EdU.
    1. Autoclave una beuta da 500 mL.
    2. Usare una tecnica sterile per aggiungere 5 mL di glucosio 20%, 50 μL di 10 mg/mL di tiamina, 120 μL di timidina 5 mM, 100 μL di 1m MgSO4, 200 μL di 10 mM EdU, 100 mL di tampone di M9 e 4 mL di appena cresciuti durante la notte MG1693 cultura.
      Nota: La concentrazione finale di EdU è 20 μM in questa cultura1,7. Questa concentrazione conduce ad arresto del ciclo cellulare e danno del DNA, se applicato direttamente a cellule di mammifero in coltura20. Tuttavia, solo una frazione di questo EdU è incorporata in e. coli e quindi disponibile al c. elegans. C'è nessuna prova di arresto del ciclo cellulare e nessun cambiamento nella dimensione della zona di progenitore o Indice M-fase dopo il trattamento di EdU di giovane adulti ermafroditi.
    3. Coltura durante la notte, ma non più di 24 ore a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  3. Concentrarsi EdU-etichettati e. coli e applicare a M9 agar capsule di Petri.
    1. Pre-raffreddare una centrifuga da tavolo a 4 ° C.
    2. Usare una tecnica sterile per trasferire la cultura in 2 – 4 provette coniche da 50 mL sterile.
    3. Centrifugare le culture a 3.000 x g a 4 ° C per 30 min a pellet la EdU-etichettati e. coli.
      Nota: Smaltire il supernatante contenente EdU secondo linee guida locali e istituzionali.
    4. Risospendere il pellet con 4 mL di fresco M9. Utilizzare una punta di pipetta sterile da 1 mL o una pipetta sierologica sterile 5 mL. Risospendere il pellet potrebbe richiedere alcuni minuti.
    5. Utilizzare la stessa pipetta per applicare e diffondere ~ 8 gocce di sedimento EdU-etichettati e. coli MG1693 al centro delle piastre di Petri di temperatura da 60 mm M9 agar. Un unico lotto produce piatti ~ 16.
    6. Consentire i piatti asciugare per diverse ore o una notte a temperatura ambiente, quindi sigillare ogni piatto con una striscia di pellicola di laboratorio. Piatti possono essere memorizzati a 15 ° C ~ 2 settimane e a 4 ° C per ~ 2 mesi. Utilizzare la stessa serie di EdU piatti per ogni set di esperimenti.

2. alimentazione EdU al c. elegans

  1. Sincronizzare popolazione temporizzato uovo laici, alcalini ipoclorito trattamento seguita da Nidoran ♀ medio-S con il colesterolo, o scegliendo la fase appropriata21. Crescere gli animali alla fase desiderata (qui, 24h post-L4), il Medium di crescita Nematode seminato con Escherichia coli OP50 a 20 ° C.
    Nota: Preparare 50 – 100 animali per esperimento, come alcuni non possono sezionare bene, e altri saranno persi nel processo di lavaggio e trasferimento.
  2. Consentire i piatti EdU riscaldare a 20 ° C (o la temperatura necessaria per l'esperimento).
  3. Lavare gli animali dai piatti NGM utilizzando M9 o tampone fosfato salino (PBS) in una provetta da 1,5 mL. Consentire agli animali di risolvere brevemente per gravità o un breve giro in una microcentrifuga.
  4. Eliminare il surnatante e lavare gli animali 1 – 2 volte con ~ 1 mL di PBS o di M9. Eliminare il surnatante.
  5. Utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per trasferire gli animali in una piccola goccia di M9 o PBS al centro del prato EdU. Attendere qualche minuto per il liquido essere assorbito, quindi incubare a 20 ° C per 30 min (per la misura diretta di S-fase) o più (per misurare la storia della fase S), come necessario.
    Nota: EdU segnale è rilevabile nei nuclei di germline dopo appena 15 min di EdU alimentazione1.
  6. Lavare i vermi il piatto di EdU con ~ 2 mL di M9 o PBS in un vetro piatto di dissezione.

3. dissezione e la fissazione di Germline di c. elegans

Nota: Questo protocollo per la dissezione, la fissazione e la macchiatura dell'anticorpo della linea germinale di c. elegans ermafrodita è quasi identico a quello pubblicato da Gervaise e Arur (2016)22, ad eccezione del fatto che i tubi di vetro da 1 mL possono essere centrifugati per accelerare lavatrice passi e un bicchiere di tratte-out pipetta Pasteur può essere utilizzato per rimuovere il liquido da tubi di vetro da 1 mL in modo più efficace.

  1. Lavare e sezionare germlines di c. elegans .
    1. Consentire agli animali di depositarsi sul fondo del piatto per dissezione, ricciolo a raccogliere gli animali nel centro e utilizzare una pipetta Pasteur lunga per rimuovere PBS. Lavare 1 – 2 volte con ~ 2 mL di PBS.
    2. Aggiungere 2 mL di PBS e 4 μL di levamisole 100 mM per immobilizzare gli animali. Roteare il piatto per raccogliere gli animali al centro del piatto.
      Nota: Immobilizzazione può durare da pochi secondi e pochi minuti. L'immobilizzazione completa non è necessaria per la dissezione di successo. Alcune persone hanno successo migliore quando in modo incompleto di dissezione immobilizzato animali.
    3. Sezionare gli animali con una coppia di aghi 25 5/8" da taglio alla testa (circa tra le due lampadine pharyngeal) o la coda. Fare attenzione a non per tagliare il ciclo della linea germinale. Intestino e germinale dovrebbero "saltar fuori" della cavità di corpo dovuta alla pressione interna, ma rimangono attaccati. Questo protocollo è simile a precedentemente pubblicati Gervaise e Arur (2016)22.
      Nota: Tenere il tempo di dissezione a ~ 5 min, certamente non più di 15 minuti più lunghi tempi di dissezione possono provocare la perdita del segnale di macchiatura dell'anticorpo (Sudhir Nayak, comunicazione personale) e fame in PBS può influenzare la fisiologia degli animali. Imparare a sezionare rapidamente e con precisione potrebbe richiedere un po' di pratica.
    4. Se necessario, di turbinio per raccogliere gli animali sezionati nel centro e utilizzare una pipetta Pasteur lunga per rimuovere quanto più PBS come possibile.
  2. Difficoltà e disidratare i tessuti
    1. Aggiungere 2 mL di 3% paraformaldeide (PFA) in soluzione PBS. Coprire il piatto senza bloccare con parafilm e negozio su una panchina o in un cassetto per 10 min.
      Nota: Scongelare PFA soluzione in un a 37 ° C bagno d'acqua e poi raffreddare a temperatura ambiente prima del germlines di dissezione.
      Attenzione: La soluzione PFA è moderatamente tossico e un probabile cancerogeno e teratogeno. Vapori che emettono da soluzioni di paraformaldeide sono infiammabili. Indossare guanti in nitrile. Diluire PFA dal 16% al 3% in una cappa chimica. Quando si lavora di fuori della cappa, mantenere tutti i contenitori coperti.
    2. Trasferire le gonadi attentamente una provetta da centrifuga vetro pulito 5 mL.
    3. Aggiungere circa 3 mL di PBSTw (PBS con 0,1% Tween-20) per il piatto che conteneva le gonadi di aiutare a recuperare i restanti gonadi e diluire la soluzione PFA.
    4. Centrifugare in una centrifuga clinica a 870 x g per un minimo di ~ 1 giovane o animali più piccoli richiedono tempi più lunghi di rotazione rispetto agli animali di età superiore o più grandi.
    5. Utilizzando una pipetta di vetro lunghe, trasferire il surnatante becher di materiale indesiderato per l'eventuale eliminazione in bottiglia materiale indesiderato nella cappa chimica.
    6. Aggiungere 2 mL di metanolo prima scelta pre-raffreddata a-20 ° C. Coprire la provetta da centrifuga strettamente con parafilm.
      Nota: Uso del metanolo fresco alta qualità "gold label" è essenziale per morfologia corretta con alcuni anticorpi.
      Attenzione: Il metanolo è un liquido altamente infiammabile e vapore, che è tossico se ingerito, inalato o autorizzati a contatto pelle. Indossare adeguati dispositivi di protezione personali e guanti. Utilizzare un congelatore adatto per piccoli volumi di materiali infiammabili.
    7. Conservare in congelatore a-20 ° C per 1 h, anche durante la notte o anche parecchi mesi.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. reidratare Germlines

  1. Riempire la provetta di vetro verso l'alto con PBSTw per diluire il metanolo e reidratare le gonadi. Rotazione verso il basso in una centrifuga clinica a 870 x g per ~ 1 min.
  2. Utilizzando un pipetta Pasteur di vetro lunghe, trasferire il surnatante becher di materiale indesiderato per l'eventuale eliminazione in bottiglia materiale indesiderato nella cappa chimica.
  3. Lavare le gonadi 3 volte usando ~ 5 mL di PBSTw, filatura giù in una centrifuga clinica a 870 x g per ~ 1 min ogni volta. Eliminare il surnatante.
  4. Sciacquare un tubo di vetro borosilicato piccolo 1 mL e un vetro lungo pipetta Pasteur con PBSTw.
  5. Aggiungere ~ 700 µ l di PBSTw e utilizzare il pipetta Pasteur di vetro lunghe per trasferire le gonadi al piccolo tubo. Utilizzare ulteriori poche gocce di PBSTw per garantire che tutte le gonadi sono trasferiti.
  6. Rotazione verso il basso in una centrifuga clinica a 870 x g per un minimo di ~ 1 utilizzando un pipetta Pasteur di vetro lunghe tratte-out, rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare le gonadi. Lasciare non più di 50 μL.
    Nota: Se la rilevazione dell'anticorpo non è necessario, andare al passaggio 6.

5. rilevare anticorpi-

  1. Diluire gli anticorpi primari in siero di 30% in PBS. Nell'esempio, anticorpo anti-WAPL-1 è 1:2,000 diluito e dell'anticorpo anti-pH3 è diluito 1: 500. Centrifugare il siero appena scongelato per 10 min in un microfuge a 20.000 x g a 4 ° C per rimuovere il particolato. Utilizzare il surnatante, che può essere conservato a 4 ° C per diversi giorni. Utilizzare il siero appropriato per abbinare l'organismo ospite di anticorpi secondari (siero di capra viene utilizzato qui). Un passo di blocco opzionale può essere aggiunto prima dell'aggiunta di anticorpi primari.
  2. Applicare 100 µ l di anticorpo primario diluito per ogni piccolo tubo di vetro. Incubare a temperatura ambiente per 4 h.
    Nota: Tempi di incubazione variano dall'anticorpo. Per alcuni anticorpi, 2 h a temperatura ambiente è sufficiente. Le incubazioni più lungo (ad es., durante la notte) sono possibili, ma può aumentare la priorità bassa.
  3. Riempire le provette per top con PBSTw e rotazione verso il basso in una centrifuga clinica a 870 x g per ~ 1 min.
  4. Lavare le gonadi 3 volte utilizzando ~ 1 mL di PBSTw. Incubare per ~ 5 min per lavaggio per consentire in eccesso anticorpo primario di diffondere nel lavaggio. Utilizzando un tratte-out lungo vetro pipetta Pasteur, rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare le gonadi. Lasciare non più di 50 μL.
  5. Diluire gli anticorpi secondari in siero di capra del 30% in PBS. Nell'esempio, capra-anti-coniglio-594 e capra-anti-mouse-647 sono ciascuno diluiti a 1: 400.
    Nota: Selezionare anticorpi secondari con attenzione per assicurarci che i coloranti sono distinte dal colorante nel kit di EdU. Nell'esempio, il kit di EdU conteneva una tintura di eccitazione 488 nm.
  6. Applicare 100 µ l di anticorpo secondario diluito per ogni piccolo tubo di vetro. Incubare al buio a temperatura ambiente 2 h.
    Nota: Tempi di incubazione variano dall'anticorpo. Per alcuni anticorpi secondari, è sufficiente 1 ora a temperatura ambiente. Le incubazioni più lungo (ad es., durante la notte) sono possibili, ma può aumentare la priorità bassa.
  7. Lavare le gonadi 3 volte utilizzando ~ 1 mL di PBSTw. Incubare per ~ 5 min per lavaggio per consentire anticorpo secondario in eccesso per diffondersi nell'autolavaggio. Utilizzando un tratte-out lungo vetro pipetta Pasteur, rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare le gonadi. Lasciare non più di 50 μL.
    Nota: Gonadi possono essere memorizzati in 100 μL di PBS dopo questo passaggio, se necessario, anche se questo può ridurre il segnale. Rimuovere PBS prima di procedere.

6. eseguire la reazione di EdU Click per rilevare EdU

Nota: Eseguendo l'EdU clic reazione prima l'anticorpo che macchia (eseguire il passaggio 6 fino al passo 5) passaggi è possibile, a seconda gli anticorpi utilizzati7. Tuttavia, i reagenti di clic potrebbero interferire con determinati antigeni (ad es., REC-8 anticorpo è sensibile alla fissazione e permeabilizzazione). L'ordine presentato qui rese luminosa anticorpo che macchia con il REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, bandiera e CYE-1 gli anticorpi usati, tra gli altri.

  1. Preparare il clic EdU cocktail8 fresco aggiungendo quanto segue in una provetta pulita 1,5 mL. L'ordine delle aggiunte è importante. Proteggere dalla luce e conservare tutti i reagenti sul ghiaccio. Questa ricetta produce abbastanza per un campione (100 μL); moltiplicare la ricetta come necessario.
    1. Aggiungere 2 mL di acqua ultrapura per il buffer di additivo. Questo rende 10x additivo di buffer, che devono essere diluiti a 1 x immediatamente prima dell'uso.
    2. Aggiungere 8,5 μL di tampone di 10 x 76,5 μL di acqua ultrapura. Mescolare bene.
    3. Aggiungere 4 μL di 100mm di CuSO4 (possono essere etichettati come componente E). Mescolare bene.
    4. Aggiungere 0.25 μL della tintura 488 nm Azide. Devono essere scongelato a temperatura ambiente, come il solvente, il solfossido dimetilico, è solido a 4 ° C. Mescolare bene e proteggere dalla luce.
    5. Mix 9 μL di acqua ultrapura con 1 μL del buffer additivo nel tappo del tubo. Dispensare dal tappo per aggiungere al cocktail rimanente e mescolare bene pipettando su e giù.
  2. Eseguire la reazione di clic di EdU.
    1. Aggiungere ~ 100 μL di clic EdU cocktail per le gonadi nel piccolo tubo. Coprire con la pellicola di laboratorio ed incubare per 30-60 min a temperatura ambiente.
    2. Lavare una volta con 100 μL di tampone di reazione risciacquo.
    3. Lavare le gonadi 4 volte utilizzando ~ 1 mL di PBSTw. Incubare per ~ 15 min per lavaggio per consentire in eccesso EdU cocktail componenti si diffondono nella lavata. Utilizzando un tratte-out lungo vetro pipetta Pasteur, rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare le gonadi. Lasciare non più di 50 μL.

7. macchia DNA e preparare i vetrini

  1. Aggiungere 1 goccia (~ 25 μL) di mezzo di montaggio antifade con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, utilizzato per visualizzare il DNA) per le gonadi. Attendere qualche minuto in modo che possa depositarsi e mescolare con le gonadi.
    Nota: In alternativa, può essere applicata una diluizione di 1:1,000 di DAPI (da uno stock di 0,1 mg/mL) in PBS per 5 min, seguita da 20 μL di 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano (DABCO) in 90% glicerolo, o un'altra soluzione di montaggio antifade.
  2. Preparare un grande rilievo di agarosio 2,5% su un vetrino per microscopio standard.
  3. Uso un nuovo pulito privo di polvere di vetro lunghe pipetta Pasteur di trasferire le gonadi per il pad di agarosio. Tenere tutti i liquidi e le gonadi in fondo stretto della pipetta per minimizzare la perdita delle gonadi.
    Nota: Gonadi attaccato al piccolo tubo di vetro o in vetro lunga pipetta Pasteur può essere "salvato" da risciacquo con PBSTw, raccogliendo il liquido in un piatto di dissezione e raccogliendo singoli animali sulla diapositiva con un ciglio.
  4. Utilizzare un ciglio (o un ciclo dei capelli sottili) incollato su uno stuzzicadenti per distribuire le gonadi sul riquadro dell'agarosi ed eliminare le particelle di polvere.
  5. Coprire con un vetrino coprioggetto rettangolare in vetro. Inferiore lentamente da un lato per evitare bolle d'aria. Utilizzare un fazzoletto di carta per rimuovere la soluzione in eccesso, impedendo così il coprioggetto di muoversi liberamente.
    Nota: Scegliere le lamelle che corrispondono al microscopio che verrà utilizzato. #1 e #1.5 coprioggetti funzionano bene.
  6. Lasciare i vetrini vivere e trasferirsi a secco leggermente durante la notte a temperatura ambiente o a 4 ° C. Questo aiuta ad per appiattire leggermente le gonadi. I vetrini devono essere conservati a 4 ° C.
  7. Optional: Sigillare i bordi della diapositiva con smalto, o un'altra diapositiva sealer. Sigillatura degli angoli in primo luogo, quindi i lati, impedisce di spostando il vetrino coprioggetti.

8. analisi e Imaging confocale

  1. Immagine la gonade distale con un microscopio a fluorescenza confocale filatura disco è dotato di una sorgente di luce ad alta energia, obiettivi plan-apocromatici e una fotocamera di microscopio ad alta efficienza. Catturare le immagini con 1 μm o più stretto spaziatura tra z-stack. Prendere nota del tempo di esposizione, la sensibilità e la potenza del laser per tutti i canali.
    1. Utilizzare la seguente: 405 nm linea eccitazione laser con un filtro di emissione 485 nm (W60) per DAPI, 488 nm laser linea eccitazione con un filtro di emissione nm (W55) 527 per EdU, 561 nm laser linea di eccitazione con un filtro di emissione nm (L70) 615 per WAPL-1 e un 640 nm laser linea excita zione con un filtro di emissione 705 nm (W90) per pH3.
      Nota: L'intensità del segnale e priorità bassa intensità varia. Allo stesso modo, i tempi di esposizione richiesta varierà, possibilmente fino a 10 volte.
  2. Utilizzare il plug-in contatore di cellule23 in Fiji24,25 per contare manualmente ogni nucleo. Etichettare ogni nucleo individuale secondo la presenza e l'assenza di pH3, EdU e WAPL-1. Utilizzare le classi dei nuclei descritti nella tabella 1 e Figura 2, come questi faciliterà tutti i calcoli descritti di seguito.
    Nota: Sperimentalisti qualificati possono contare con precisione tutti i nuclei in un'immagine 3D senza duplicazioni o manca qualsiasi nuclei. Alternativamente, uno può contare ogni nucleo in ogni piano z, e i segni di cellule R script3 può essere usato per rimuovere i nuclei si moltiplicano-contato.
  3. Calcolare i numeri di cellulare e frequenze comprese tra i conteggi sopra a seconda del tipo di ciclo cellulare misura necessaria. I tipi di nuclei sono definiti nella tabella 1 e Figura 2. I calcoli sono riassunti nella tabella 2.
    1. (Variazione mi) Per identificare i nuclei in fase S, nutrire gli animali EdU per 30 min. Qualsiasi visualizzazione etichetta EdU i nuclei sono i nuclei di fase S. Per calcolare, prendere i nuclei somma di A e C, Vedi tabella 1 e Figura 2.
      Nota: In un 30 min EdU impulso nel selvaggio-tipo adulti ermafroditi, EdU tutti etichettati i nuclei sono co-etichettati con progenitrici zona marcatori1.
    2. Per misurare la zona di progenitrici, macchia con un indicatore di zona del progenitore come anticorpo REC-8 o WAPL-1. La zona di progenitrici è definita qui come tutti adrenocorticale REC-818 o nuclei immunoreactive germline WAPL-1. Per calcolare, sommare tutti i nuclei immunoreactive di WAPL-1 (A + B + C + D, Vedi tabella 1 e Figura 2).
      Nota: WAPL-1 etichette anche il DTC e nuclei di gonade somatico che non devono essere conteggiati. I nuclei somatici sono facili da identificare con segnale estremamente intenso WAPL-1, posizione leggermente fuori la linea germinale e una morfologia "uovo fritto" dei nuclei.
    3. Per misurare l'indice di fase S, eseguire un 30 min EdU esperimento e co-etichetta con anticorpo REC-8 o WAPL-1. L'indice di S-fase è definita come la proporzione della zona progenitore che è in fase S. Per calcolare, contare tutti i nuclei di fase S e poi dividere per il numero totale di nuclei di cellule progenitrici zona (A + C / A + B + C + D, Vedi tabella 1 e Figura 2).
    4. (Variazione II) Per identificare i nuclei in fase M, macchia con l'anticorpo pH3. Qualsiasi nuclei immunoreactive di pH3 sono nuclei M-fase. Questo funziona indipendentemente dalla durata di EdU feed. Per calcolare, prendere la somma di A e nuclei di B, Vedi tabella 1 e Figura 2.
      Nota: WAPL-1 etichette anche il DTC e nuclei di gonade somatico che non devono essere conteggiati. I nuclei somatici sono facili da identificare con segnale estremamente intenso WAPL-1, posizione leggermente fuori la linea germinale e una morfologia "uovo fritto" dei nuclei.
    5. Per misurare l'indice di fase M, co-etichetta con pH3 e REC-8 o gli anticorpi WAPL-1. L'indice di M-fase è definita come la proporzione della zona progenitore che è in fase di M. Per calcolare, contare tutti i nuclei di fase M e poi dividere per il numero totale di nuclei di cellule progenitrici zona (A + B / A + B + C + D, Vedi tabella 1 e Figura 2).
    6. (Variazione III) I nuclei in fase S mitotica e meiotica entrambi etichetta con EdU. A dire le due popolazioni apart, determinare se la fase di S è stata seguita da mitosi o meiosi. Per determinare se i nuclei sono in fase S mitotica o meiotica, feed EdU per 4h e co-etichetta per pH3 (un indicatore di fase M) e HIM-3 (una proteina di asse meiotic del cromosoma) dalla macchiatura dell'anticorpo. Registrare i nuclei che visualizzano sia EdU e pH3 (tipo A, Vedi tabella 1 e Figura 2) come S-fase mitotica mentre i nuclei che visualizzano sia EdU e HIM-3 (tipo E, Vedi tabella 1 e Figura 2) come S-fase meiotica.
    7. (Variazione IV) Calcolare la durata della fase G2.
      Nota: Fase G2 separa la fase S dalla fase di M. Anche se nessun marcatore è stato segnalato in etichetta G2 nella linea germinale di c. elegans , si può calcolare la durata della fase G2 combinando i dati da diversi esperimenti che etichetta M-fase (al momento della dissezione) e S-fase (a partire da diverse ore prima dissezione). Una cella che visualizza sia M-fase e fase S marcatori completato fase G2 nel corso dell'esperimento. Una cella che visualizza solo l'indicatore di fase M e non l'indicatore di fase S non era in fase S durante l'esperimento.
      1. Per calcolare la durata della fase G2, feed EdU per 2 h e co-etichetta con anticorpo pH3. Esaminare solo i nuclei che etichettare con pH3 (queste sono in fase di M al momento della dissezione) per la presenza di EdU (questi erano in fase S durante l'etichetta di EdU 2 h prima della dissezione). Calcolare la frazione di nuclei di M-fase che completato fase G2 (A / A + B, Vedi tabella 1 e Figura 2).
      2. Ripetere questo esperimento con un'etichetta di EdU 3h e ancora con un'etichetta di EdU 4h (e, facoltativamente, un'etichetta di EdU 5h). Tracciare la percentuale di nuclei positivi pH3 che sono EdU positivo sull'asse y e la durata dell'EdU etichetta sull'asse x, come mostrato in Figura 3A.
      3. Calcolare la durata mediana della fase G2 collegando i punti sul grafico e determinare dove la linea attraversa il 50%, come mostrato in Figura 3A.
      4. Calcolare la durata massima della fase G2 collegando i punti sul grafico e determinare dove la linea attraversa il 99%, come mostrato in Figura 3A.
    8. (Variazione V) Calcolare il duraion di G1 + G2 + M.
      Nota: In c. elegans germinale, fase G1 è insolitamente breve. Anche se nessun marcatore è stato segnalato per etichettare G1 sulla linea germinale di c. elegans , possibile stimare la durata di somma della fase G1 G2 e M e quindi confrontare questa volta con il tempo di fase G2 descritto sopra. La durata massima del G1 + G2 + M è stimata dalla percentuale di tutti i nuclei di zona progenitrici (WAPL-1 immunoreactive) che rimangono EdU negativo (non subissero fase S) dopo l'EdU etichettatura per diverse ore.
      1. Per calcolare la durata del G1 + G2 + M, feed EdU per 2 h e co-etichetta con anticorpo REC-8 o WAPL-1. Determinare la frazione della zona progenitore che ha subito la fase S durante questo periodo (A + C / A + B + C + D, Vedi tabella 1 e Figura 2).
      2. Ripetere questo esperimento con un'etichetta di EdU 3h e ancora con un'etichetta di EdU 4h (e, facoltativamente, un'etichetta di EdU 5h). Tracciare la percentuale di REC-8 o WAPL-1 nuclei positivi che sono EdU positivo sull'asse y e la durata dell'EdU etichetta sull'asse x, come mostrato nella Figura 3B.
      3. Calcolare la durata massima del G1 + G2 + M collegando i punti sul grafico e trovare dove la linea attraversa il 99%, come mostrato nella Figura 3B.
        Nota: È possibile eseguire gli esperimenti per determinare la durata del G2 e G2 + M + G1 come un singolo set di 2, 3, 4 e 5 h EdU esperimenti di co-etichettatura con anticorpi di coniglio-anti-WAPL-1 sia del mouse-anti-pH3.
    9. (Variazione VI) Per identificare i nuclei che replicato nella zona progenitrici dal immesso meiosi, nutrire gli animali EdU per 10 h e co-etichetta con anticorpi REC-8 o WAPL-1. Qualsiasi nuclei visualizzazione etichetta EdU erano in fase S durante quei 10 h. Qualsiasi nuclei che non vengono visualizzati adrenocorticale colorazione REC-8 o WAPL-1 erano nella meiosi. Basta contare i nuclei con EdU etichettatura che non vengono visualizzati l'etichettatura con l'indicatore di zona del progenitore (E, Vedi tabella 1).
      Nota: Al contrario, se gonadi sono macchiati per il marcatore di Profase Meiotica HIM-3 con gli anticorpi anti-HIM-3, il numero dei nuclei con EdU etichettatura che sono anche positivo per HIM-3.
    10. Per calcolare il tasso di entrata meiotica, eseguire l'esperimento di cui sopra con un'etichetta 5 h, 10 h e 15 h di EdU. Tracciare il numero di nuclei che entrato meiosi sull'asse y e la durata dell'etichetta EdU sull'asse x, come mostrato in Figura 3. Quindi utilizzare una regressione lineare per calcolare la pendenza (meiosi i nuclei entrati a h) da y = mx + b.
      Nota: È fondamentale utilizzare una regressione lineare per calcolare il tasso di entrata meiotica. Non sarebbe corretto per dividere semplicemente il numero di nuclei che immesso meiosi dalla durata dell'etichetta EdU, perché l'intercetta y non è zero.
    11. (Variazione VII) Misurare il tasso di progressione meiotica.
      Nota: Poiché EdU in covalenza è incorporato nel DNA, può essere utilizzato per tenere traccia di una popolazione di cellule con differenziazione. Le cellule che hanno subito la fase S nella zona di progenitrici conservano l'etichetta EdU entrano in meiosi, progressi attraverso meiosi e subiscono oogenesi. Un esperimento di pulse-chase con EdU può essere utilizzato per misurare la velocità di progressione meiotica.
      1. Batteri di EdU-labeled mangimi agli animali per 4 h (il "polso"). Trasferire gli animali senza etichetta OP50 batteri per 48 h (la "caccia"), poi sezionare e co-etichetta con un indicatore di zona del progenitore come REC-8 o WAPL-1 (o un indicatore di Profase Meiotica come HIM-3), se lo si desidera.
      2. Quando la formazione immagine, cercare la posizione del nucleo di EdU-labeled più prossimale. Il tasso di progressione meiotica è percorsa la distanza (in diametri cellulari dalla fine della zona di progenitrici) dal più prossimale EdU etichettato nucleo durante l'inseguimento di 48 h.

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Risultati

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Poiché per incorporare EdU sono necessaria la sintesi del DNA, si può concludere che EdU-identificati i nuclei hanno subito la fase S durante l'intervallo di tempo EdU-etichettatura. Si può interpretare i nuclei quell'etichetta in un'alimentazione di 30 min con EdU batteri identificati come appartenenti a nuclei in fase S al momento della dissezione. I nuclei che etichettare in un più EdU continuo esperimento di alimentazione possono avere etichettato presto nella finestra temporale e dal...

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Discussione

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Preparazione di EdU-identificati batteri (passaggio 1) è critica per questo protocollo e il primo punto della risoluzione dei problemi. Etichetta di selvaggio-tipo giovane adulto ermafroditi molto affidabile in un 4h EdU-impulso, rendendo questo un controllo utile per ogni nuovo lotto di EdU-identificati batteri. Inoltre, intatti EdU-etichetta per i batteri che entrano l'intestino (in più vecchi animali o alcuni mutanti difettosi faringe/smerigliatrice) verranno etichettare con clic chimica e appaiono come brillante punc...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati al centro stock di e. coli per MG1693; WormBase; il centro di genetica di Caenorhabditis che è finanziato dai nazionali istituti di salute di ricerca infrastrutture programmi di Office (P40OD010440) per i ceppi; Zach Pincus per consulenza statistica; Aiping Feng per reagenti; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner per formazione, consulenza, supporto e discussioni utili; e i laboratori Kornfeld e Schedl per feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 a KK, R01 GM100756 TS] e una borsa di dottorato National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 a ZK]. Il National Institutes of Health, né la National Science Foundation ha avuto alcun ruolo nella progettazione di studio, raccolta, analisi e interpretazione dei dati, né per iscritto il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411cresce bene in LB
em>E. coli standard non integrato OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitThermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridineSigma900584-50MGo utilizzare l'EdU fornito nel kit
GlucosioSigmaD9434-500GD-(+)-Destrosio
Tiamina (Vitamina B1)SigmaT4625-5GReagente
TiminaSigmaT1895-1GBioReagente
Solfato di magnesio eptaidratoSigmaM1880-1KGMgSO4, Reagente
Grado Sodio Fosfato, bibasico, anidroFisherBP332-500GNa2HPO4
Fosfato di potassio, monobasicoSigmaP5379-500GKH2PO4
Cloruro di ammonioSigmaA4514-500GNH4Cl, reagente più
agar batteriologicoUS BiologicalC13071058
cloruro di calcio diidratoSigmaC3881-500GCaCl
LB Brodo (Miller)SigmaL3522-1KGUsato a 25g/L
LevamisoleSigmaL9756-5G0.241g/10ml
Soluzione salina tamponata con fosfatoCalbiochem Omnipur6506fatto in casa PBS funziona altrettanto bene
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% Paraformaldeide, ampolle di grado EM MicroscopiaelettronicaSciences 15710fiale da 10 ml
100% metanoloThermo Fisher ScientificA454-1LGold label è fondamentale per la corretta morfologia con alcuni anticorpi
Siero di capraGibco16210-072Lotto 1671330
coniglio-anti-WAPL-1Novus biologici49300002Lotto G3048-179A02, utilizzato in 1:2000
clone di topo anti-pH3 3H10Millipore05-806Lot#2680533, utilizzato in 1:500
capra-anti-coniglio IgG-coniugato Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lotto 1256147, utilizzato in 1:400
capra-anti-topo IgG-coniugato Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lotto 1511347, utilizzato in 1:400
Vectashield antifade supporto di montaggio contenente 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo Dicloridrato (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200il mezzo di montaggio senza DAPI può essere utilizzato invece, dopo un'incubazione DAPI separata
unghieWet n WildDTC450Bqualsiasi smalto trasparente dovrebbe funzionare
S-mediumvarivedere wormbook.org per il protocollo
M9 buffervarivedere wormbook.org per il protocollo
M9 agarvaristessa ricetta del tampone M9, ma aggiungere l'1,7% di agar
Nematode Growth Mediumvarivedere wormbook.org per il
protocollo di dissezione del vetro dell'orologioCarolina Biological42300
Parafilm film da laboratorioPechiney Imballaggio in plasticaPM-996pollici di larghezza film da laboratorio
piastre60 mm di
Provette da centrifuga da 1 mlPuntali MidSci Avant2926
Pipette
sierologiche
500 ml Pallone
Foglio
25G Aghi da 5/8"BD PrecisionGlide 
provetta da centrifuga in vetro da 5 mlPyrex 
Tubi in vetro borosilicato 1ml
vetrini
in vetro n. 1 vetrini coprioggetti 22 x 40 mmn. 1,5 può funzionare, anche
37 ° C Incubatore
Centrifuga da tavolo Centrifuga
clinicaIEC428con rotore a 6 secchi oscillanti
Mini centrifuga
20 ... C incubatore
4 gradi C frigorifero-20
gradi Microscopio C freezer
Observer Z1Obiettivo a immersione in olio Zeiss
Plan Apo 63X 1.4Sistema confocale
Ultraview VoxPerkinElmerIl sistema confocale a disco rotante Nikon funziona molto bene, anche, come descritto qui: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
<Il metanolo smalto per 4 di Petri diametro Pipette Pasteur in vetro lungoErlenmyerdi alluminio305122con agitatore a disco rotante Zeiss

Riferimenti

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