È descritto un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per identificare la fase S e analizzare le dinamiche del ciclo cellulare in c. elegans ermafrodita germinale utilizzando la timidina EdU analogico. Questo metodo non richiede nessun transgeni ed è compatibile con la macchiatura immunofluorescente.
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Articolo metodologico
Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU
In questo articolo
Sommario
Abstract
Analisi del ciclo cellulare negli eucarioti utilizza frequentemente la morfologia del cromosoma, espressione e/o localizzazione di prodotti genici necessari per le varie fasi del ciclo cellulare, o l'incorporazione di analoghi nucleosidici. Durante la fase S, polimerasi del DNA incorporare gli analoghi della timidina come EdU o BrdU nel DNA cromosomico, marcatura delle cellule per l'analisi. Per c. elegans, il nucleoside analogico EdU durante regolare cultura è alimentata con i vermi ed è compatibile con tecniche di immunofluorescenza. La linea germinale di c. elegans è un sistema potente modello per gli studi di segnalazione vie, cellule staminali, meiosi e ciclo cellulare perché è trasparente, geneticamente facile e Profase Meiotica e differenziazione cellulare/gametogenesi si verificano in un lineare Assemblea-come la moda. Queste caratteristiche rendono EdU un ottimo strumento per studiare aspetti dinamici delle cellule mitoticamente ciclismo e sviluppo di germline. Questo protocollo viene descritto come correttamente preparare EdU batteri, nutrirli wild-type c. elegans ermafroditi, sezionare la gonade ermafrodita, macchia per EdU incorporazione nel DNA, macchia con gli anticorpi per rilevare vari ciclo cellulare e gli indicatori dello sviluppo, la gonade di immagine e analizzare i risultati. Il protocollo descrive le variazioni nel metodo e nell'analisi per la misurazione della fase S indice, M-fase indice, G2 durata, durata del ciclo cellulare, tasso di entrata meiotica e tasso di progressione della Profase Meiotica. Questo metodo può essere adattato per studiare il ciclo cellulare o la storia di cella in altri tessuti, fasi, ambiti di provenienza genetici e condizioni fisiologiche.
Introduzione
Nello sviluppo animale, centinaia, migliaia, milioni, miliardi o anche migliaia di miliardi di divisioni cellulari è necessari per formare l'organismo adulto. Il ciclo cellulare, il set di eventi cellulari composto di G1 (gap), S (sintesi), G2 (gap), e M (mitosi) definire la serie di eventi che vengono eseguiti ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare è dinamico e meglio apprezzato in tempo reale, che può essere tecnicamente difficile. Le tecniche presentate in questo protocollo permettono di effettuare le misurazioni delle fasi e la tempistica del ciclo cellulare da immagini fisse.
Etichettatura con analoghi nucleosidici come 5-Etinil-....
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Protocollo
1. preparazione di EdU-identificati batteri
-
Crescere una coltura starter di MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) trasporta una mutazione in thyA.
- Striscia fuori MG1693 di Escherichia coli da uno stock di glicerolo congelato su un agar di brodo (LB) di 120 mm Lisogenesi di Petri. Coltura a 37 ° C durante la notte.
- Inoculare da due singoli e. coli MG1693 colonie in due duplicare 4 mL provette di coltura liquida lb a 37 ° C per ~ 16 h.
Nota: La MG1693 cresce bene in LB senza completare con timina o della timidina.
- Crescere e. coli MG1693 i....
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Risultati
Poiché per incorporare EdU sono necessaria la sintesi del DNA, si può concludere che EdU-identificati i nuclei hanno subito la fase S durante l'intervallo di tempo EdU-etichettatura. Si può interpretare i nuclei quell'etichetta in un'alimentazione di 30 min con EdU batteri identificati come appartenenti a nuclei in fase S al momento della dissezione. I nuclei che etichettare in un più EdU continuo esperimento di alimentazione possono avere etichettato presto nella finestra temporale e dal.......
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Discussione
Preparazione di EdU-identificati batteri (passaggio 1) è critica per questo protocollo e il primo punto della risoluzione dei problemi. Etichetta di selvaggio-tipo giovane adulto ermafroditi molto affidabile in un 4h EdU-impulso, rendendo questo un controllo utile per ogni nuovo lotto di EdU-identificati batteri. Inoltre, intatti EdU-etichetta per i batteri che entrano l'intestino (in più vecchi animali o alcuni mutanti difettosi faringe/smerigliatrice) verranno etichettare con clic chimica e appaiono come brillante punc.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati al centro stock di e. coli per MG1693; WormBase; il centro di genetica di Caenorhabditis che è finanziato dai nazionali istituti di salute di ricerca infrastrutture programmi di Office (P40OD010440) per i ceppi; Zach Pincus per consulenza statistica; Aiping Feng per reagenti; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner per formazione, consulenza, supporto e discussioni utili; e i laboratori Kornfeld e Schedl per feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 a KK, R01 GM100756 TS] e una borsa di dottorato National Science Foundation [DGE-1143954....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | cresce bene in LB |
| em>E. coli standard non integrato OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | o utilizzare l'EdU fornito nel kit |
| Glucosio | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Destrosio |
| Tiamina (Vitamina B1) | Sigma | T4625-5G | Reagente |
| Timina | Sigma | T1895-1G | BioReagente |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagente |
| Grado Sodio Fosfato, bibasico, anidro | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Fosfato di potassio, monobasico | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Cloruro di ammonio | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, reagente più |
| agar batteriologico | US Biological | C13071058 | |
| cloruro di calcio diidrato | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Brodo (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Usato a 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Calbiochem Omnipur | 6506 | fatto in casa PBS funziona altrettanto bene |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldeide, ampolle di grado EM Microscopia | elettronica | Sciences 15710 | fiale da 10 ml |
| 100% metanolo | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold label è fondamentale per la corretta morfologia con alcuni anticorpi |
| Siero di capra | Gibco | 16210-072 | Lotto 1671330 |
| coniglio-anti-WAPL-1 | Novus biologici | 49300002 | Lotto G3048-179A02, utilizzato in 1:2000 |
| clone di topo anti-pH3 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, utilizzato in 1:500 |
| capra-anti-coniglio IgG-coniugato Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lotto 1256147, utilizzato in 1:400 |
| capra-anti-topo IgG-coniugato Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lotto 1511347, utilizzato in 1:400 |
| Vectashield antifade supporto di montaggio contenente 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo Dicloridrato (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | il mezzo di montaggio senza DAPI può essere utilizzato invece, dopo un'incubazione DAPI separata |
| unghie | Wet n Wild | DTC450B | qualsiasi smalto trasparente dovrebbe funzionare |
| S-medium | vari | vedere wormbook.org per il protocollo | |
| M9 buffer | vari | vedere wormbook.org per il protocollo | |
| M9 agar | vari | stessa ricetta del tampone M9, ma aggiungere l'1,7% di agar | |
| Nematode Growth Medium | vari | vedere wormbook.org per il | |
| protocollo di dissezione del vetro dell'orologio | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm film da laboratorio | Pechiney Imballaggio in plastica | PM-996 | pollici di larghezza film da laboratorio |
| piastre | 60 mm di | ||
| Provette da centrifuga da 1 ml | Puntali MidSci Avant | 2926 | |
| Pipette | |||
| sierologiche | |||
| 500 ml Pallone | |||
| Foglio | |||
| 25G Aghi da 5/8" | BD PrecisionGlide | ||
| provetta da centrifuga in vetro da 5 ml | Pyrex | ||
| Tubi in vetro borosilicato 1ml | |||
| vetrini | |||
| in vetro n. 1 vetrini coprioggetti 22 x 40 mm | n. 1,5 può funzionare, anche | ||
| 37 ° C Incubatore | |||
| Centrifuga da tavolo Centrifuga | |||
| clinica | IEC | 428 | con rotore a 6 secchi oscillanti |
| Mini centrifuga | |||
| 20 ... C incubatore | |||
| 4 gradi C frigorifero-20 | |||
| gradi Microscopio C freezer | |||
| Observer Z1 | Obiettivo a immersione in olio Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 | Sistema confocale | ||
| Ultraview Vox | PerkinElmer | Il sistema confocale a disco rotante Nikon funziona molto bene, anche, come descritto qui: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Riferimenti
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J.
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Ristampe e permessi
