Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attività elettrica delle cellule nei tessuti può essere monitorata da tecniche elettrofisiologiche, ma questi sono solitamente limitati all'analisi delle singole celle. Poiché un aumento di calcio intracellulare (Ca2 +) nel citosol si verifica spesso a causa dell'attività elettrica, o in risposta ad una miriade di altri stimoli, questo processo può essere monitorato dall'imaging delle cellule caricati con fluorescente calcio sensibili coloranti. Tuttavia, è difficile per questa risposta in un tipo di cella singola all'interno di intero tessuto di immagine perché questi coloranti sono presi da tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto. Al contrario, codificato geneticamente calcio indicatori (GECIs) possono essere espresso da un tipo di cella singola e reagiscono in risposta ad un aumento di Ca intracellulare2 +, permettendo così l'imaging del Ca2 + segnalazione in intere popolazioni di tipi di cellule singole. Qui, applichiamo l'uso di GECIs GCaMP3/6 alla giunzione neuromuscolare del mouse, un tripartito sinapsi tra i neuroni di motore, muscolo scheletrico e terminal/perisinaptici in cellule di Schwann. Dimostriamo l'utilità di questa tecnica nelle preparazioni di tessuto classico ex vivo . Utilizzando un separatore ottico, eseguiamo imaging di doppio-lunghezza d'onda di Ca2 + segnali dinamici e un'etichetta statica della giunzione neuromuscolare (NMJ) in un approccio che può essere facilmente adattato per monitorare due cellula-specifico GECI o tensione codificato geneticamente indicatori (GEVI) contemporaneamente. Infine, si discutono la routine utilizzate per acquisire mappe spaziali di intensità di fluorescenza. Insieme, queste tecniche ottiche, transgeniche e analitiche possono essere impiegate per studiare l'attività biologica delle sottopopolazioni distinte delle cellule alle NMJ in un'ampia varietà di contesti.
Introduzione
La giunzione neuromuscolare, come tutte le sinapsi, è composto da tre elementi: un terminale presinaptico derivato da un neurone, una cellula postsynaptic neurone/effettrici, e un perisinaptici glial cell1,2. Mentre gli aspetti fondamentali della trasmissione sinaptica in primo luogo sono stati dimostrati a questa sinapsi3, molti aspetti di questo processo rimangano sconosciuti, in parte a causa dell'espressione delle molecole stesse di distinti elementi cellulari di questa sinapsi. Ad esempio, ricevitori per sia l'acetilcolina (ACh) e del purina adenina nucleotide ATP che co-sono rilas....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Zootecnia e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente alla istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e il IACUC presso l'Università del Nevada.
1. preparazione dei diaframmi e nervi frenici da topi transgenici
- Acquisto di topi transgenici e iniettori del oligonucleotide di genotipo questi topi.
Nota: Gli iniettori sono elencati nella pagina "Informazioni" per ciascuno di questi topi.- Allevare un mouse di 3-6 mesi esprimendo una copia dell'allele appropriato transgenici/knock-in Cre-driver e zero copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale con un secondo mouse della ste....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Diversi esempi di cambiamenti di intensità di fluorescenza, mediate da un aumento di Ca intracellulare2 + all'interno di tipi di cella definita della giunzione neuromuscolare, dimostrano l'utilità di questo approccio. Questi risultati sono presentati come mappe di intensità di fluorescenza spaziale, che forniscono la posizione delle cellule risponde, così come l'intensità delle loro risposte, consentendo in tal modo la valutazione di quante cellule rispondono e quanto ogni cell.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui forniamo alcuni esempi di Ca2 + risposte in celle specifiche in tessuto neuromuscolare intatto facendo uso dei topi che esprimono GECI di misura. Per eseguire correttamente questi esperimenti, è imperativo di non ferire il nervo frenico durante la dissezione. Per realizzare l'immagine Ca2 + risposte in cellule di Schwann a potenza alto o basso (cioè, X 20 o 60 X), è necessario utilizzare BHC o µ-conotossina al blocco movimento. Per l'imaging di bassa potenza di Ca2 + risposte.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto con fondi del National Institutes of Health (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e dal centro nazionale per le risorse di ricerca 5P20RR018751 e il National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (per G.W.H.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Myf5-Cre topi | Jax | #007893 | Guida l'espressione delle cellule muscolari già a E136 |
| Wnt1-Cre topi | Jax | #003829 | Guida l'espressione in tutti Cellule di Schwann a E13 ma non P209 |
| Sox10-Cre topi | Jax | #025807 | Guida l'espressione delle cellule di Schwann in età avanzata |
| Topi GCaMP3 condizionali | Jax | #029043 | Esprime GCaMP3 in modo cellulo-specifico |
| Topi GCaMP6f condizionale | Jax | #024105 | Esprime GCaMP6f in modo |
| cellulo-specificoBHC (3-(N-butiletanimidoil)-4-idrossi-2H-cromon-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocca la miosina del muscolo scheletrico ma non la neurotrasmissione6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Etichetta i cluster del recettore dell'acetilcolina a NMJ |
| µ-conotossina GIIIb | Peptidi Int'l | #CONO20-01000 | Blocca Nav1.4 canale del sodio voltaggio-dipendente8 |
| Gel dielettrico siliconico; alias Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Consente l'immobilizzazione del diaframma tramite perni minuziosi |
| Perni minuziosi (diametro 0,1 mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizza il diaframma su gel dielettrico in silicone |
| Microscopio verticale Eclipse FN1 | Nikon | MBA74100 | Consente la stadiazione e l'osservazione del campione |
| Piattaforma per microscopio fisso di base con traslatore manuale per microscopio XY | Autom8 | MXMScr | Consente il movimento del campione |
| Micromanipolatore manuale | Narishige | M-152 | Contiene elettrodi di registrazione e stimolazione |
| Amplificatore a microelettrodi | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Consente la registrazione elettrofisiologica intracellulare con elettrodi affilati |
| Sistema di acquisizione dati a basso rumore con microelettrodo | Molecular Devices | Digidata 1550 | Consente l'acquisizione di dati elettrofisiologici |
| Sistema di analisi dei dati dei microelettrodi | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Esegue l'analisi dei dati elettrofisiologici |
| Stimolatore a onda quadra | Grass | S48 | Stimola il nervo ad eccitare il muscolo |
| Unità di isolamento dello stimolo | Grass | PSIU6 | Riduce gli artefatti di stimolazione |
| Filamenti borosilicati, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,5 mm | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impala, e registra i potenziali muscolari evocati dai nervi |
| filamenti borosilicati, diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 1,17 mm. | Sutter | BF150-117-15 | Allungato e utilizzato per elettrodo di aspirazione |
| Estrattore per micropipette | Sutter | P-97 | Estrae e prepara gli elettrodi di registrazione |
| 1200x1200 pixel, fotocamera cMOS retroilluminata | Photometrics | Prime 95b | Telecamera sensibile che consente immagini ad alta risoluzione e ad alta velocità |
| Sorgente luminosa | Lumencor | Spectra X | Fornisce l'illuminazione dai LED per l'osservazione della fluorescenza |
| Obiettivi fluorescenti ad immersione in acqua corretti all'infinito, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Fornisce lunghe distanze di lavoro per la visualizzazione del campione |
| Illuminatore a fibre ottiche con lampada alogena | Sumita | LS-DWL-N | Fornisce illuminazione per l'osservazione in campo chiaro |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Proietta 1 coppia di immagini a doppia lunghezza d'onda separate da un dicroico a una singola fotocamera |
| Filtri passa-banda a banda singola (512/25-25 e 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Consente l'imaging a doppia banda |
| 560 nm Splitter dicroico a bordo singolo | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Specchio dicroico che separa i fasci di luce per consentire l'imaging a doppia lunghezza d'onda |
| Sistema di acquisizione dati di imaging | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Consente l'acquisizione dei dati |
| imaging Modulo di controllo della lunghezza d'onda | Modulo | MQS41220 | Nikon per i dati di imaging acqusiition |
| Modulo hardware splitter di emissione | Modulo MQS41410 Nikon | per l'acquisizione dei dati di imaging | |
| Sistema di analisi dei dati di imaging | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Consente l'analisi dell'intensità della fluorescenza e di altri dati di imaging |
Riferimenti
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple func....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
