In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.
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Articolo metodologico
La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi della cellula-cellula o cellula-patogeno interazione in vivo è uno strumento importante per capire la dinamica della risposta immunitaria all'infezione. Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) permette l'osservazione delle interazioni cellula nei tessuti profondi in animali viventi, riducendo al minimo il photobleaching generati durante l'acquisizione di immagini. Ad oggi, sono stati descritti diversi modelli per 2P-IVM degli organi linfoidi e non linfoidi. Tuttavia, la formazione immagine degli organi respiratori rimane una sfida a causa del movimento associata al ciclo di respirazione dell'animale.
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare in vivo delle cellule immuni interazioni nella trachea di topi infettati con il virus dell'influenza utilizzando 2P-IVM. A questo scopo, abbiamo sviluppato una piattaforma di formazione immagine personalizzata, che comprendeva l'esposizione chirurgica e intubazione della trachea, seguita dall'acquisizione di immagini dinamiche dei neutrofili e cellule dendritiche (DC) nell'epitelio mucoso. Inoltre, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per eseguire l'influenza intranasale infezione e flusso cytometric analisi delle cellule immuni nella trachea. Infine, abbiamo analizzato il neutrofilo e motilità DC così come le loro interazioni nel corso di un film. Questo protocollo permette per la generazione di immagini 4D stabile e luminose necessario per la valutazione delle interazioni cellula-cellula nella trachea.
Introduzione
Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) è una tecnica efficace per l'imaging di tempo reale delle interazioni cellula-cellula che si verificano nel loro ambiente naturale1. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette lo studio di processi cellulari, a una maggiore profondità di campione (500 µm a 1 mm), rispetto ad altri di tecniche di imaging tradizionale2. Allo stesso tempo, l'uso di due fotoni di bassa energia generata dal laser del due-fotone minimizza il foto-danno di tessuto tipicamente associato con il processo di acquisizione immagine2. Durante l'ultimo decennio, 2P-IVM ....
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Protocollo
Tutte le procedure di animale che coinvolgono topi sono stati eseguiti secondo l'Ufficio federale di veterinaria indirizzi e protocolli animale sono state approvate dalle autorità veterinario locale.
1. influenza infezione dei topi CD11c-YFP
- Biosicurezza
Nota: Il ceppo del mouse adattato di influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) è stato coltivato in uova fecondate, purificato e titolato come descritto in precedenza21. Tutti i passaggi che coinvolgono gli animali infetti o campioni biologici sono stati effettuati sotto una cappa di biosicurezza in base al livello di biosicurezza (BSL) 2 ....
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Risultati
In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per studiare in vivo la motilità e le interazioni tra neutrofili e DC durante l'infezione di influenza nella trachea murina (Figura 3A). A questo scopo, abbiamo isolato i neutrofili PCP+ (92% di purezza; Figura 3B) da CK6-ECFP topi e abbiamo passivamente trasferiti li in un mouse CD11c-YFP infettato con la riossidazione. Dopo di che, abbiamo effettu.......
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Discussione
Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per la generazione di immagini 4D che mostrano la migrazione dei neutrofili passivamente trasferiti e loro interazioni con DC durante un'infezione influenzale nella trachea del mouse. Il modello descritto 2P-IVM saranno rilevante per studiare la dinamica delle cellule immuni durante un'infezione delle vie aeree.
Recentemente, diversi modelli basati sulla visualizzazione delle dinamiche delle cellule delle vie aeree sono stati sviluppati
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzero (SNF) (176124, 145038 e 148183), l'europeo Commissione Marie Curie per il reinserimento (612742) e il SystemsX.ch una sovvenzione di D.U.P (2013/124).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü lke & Mayr GmbH | 4% soluzione | |
| CD11c-YFP topi | Laboratories | 008829 | topi sono stati allevati internamente |
| topi CK6-ECFP | Jackson Laboratories | 004218 | topi sono stati allevati internamente |
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco modificata senza couro di calcio e cloruro di magnesio | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco modificata senza coruro di calcio e cloruro di magnesio | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Conservare a 4 gradi; C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store presso RT, negozio a 4 ° C quando in soluzione di miscela ket/xyl |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Conservare a RT, conservare a 4 ° C quando in soluzione di miscela ket/xyl |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0,3 mL BD Siringhe da insulina micro-fine | BD 324826 | ||
| Falcon 40 µ m Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Siringhe da 2 mL BD | Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 aghi da 18 G | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catetere) | Braun | 4251652.01 | |
| Cluster di coltura cellulare a 6 pozzetti | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Negozio a 4 gradi C |
| Liberase TL Research Grade Roche | 5401020001 | Store a -20 gradi C / collagenasi (I e II) miscela | |
| DNAsi I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Conservare a -20 ° C |
| CellTrace Colorazione viola | ThermoFisher Scientific | C34557 | Conservare a -20 C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | Conservare a -20 ° C |
| PE-10 Micro Tubo Medico | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Nastro Chirurgico in Plastica M | Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store presso RT | |
| Plastilina | Ohropax | ||
| Vetrino coprioggetti in vetro ad alta tolleranza 15 mm rotondo | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Sistema portatile per anestesia animale | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (anestesia gassosa e banco riscaldante) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | Università di Berna | ||
| TrimScope II Microscopio a due fotoni | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa laser | Coherent Inc. | ||
| Obiettivo ad immersione in acqua 25X NA 1.05 | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube& La camera di incubazione e il regolatore di temperatura The Box | Life imaging Services | ||
| imaging | Bitplane | Imaris 9.1.0 | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Software statistico |
Riferimenti
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
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Ristampe e permessi
Tag
Imaging della mucosa trachealeinterazione tra neutrofili e cellule dendriticheanalisi tramite citometria a flussoesposizione chirurgica della tracheainfezione intranasale da influenzaisolamento dei neutrofili dal midollo osseogradiente di densità Percollanalisi della motilità delle cellule immunitarie
