La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Summary

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

Abstract

L'analisi della cellula-cellula o cellula-patogeno interazione in vivo è uno strumento importante per capire la dinamica della risposta immunitaria all'infezione. Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) permette l'osservazione delle interazioni cellula nei tessuti profondi in animali viventi, riducendo al minimo il photobleaching generati durante l'acquisizione di immagini. Ad oggi, sono stati descritti diversi modelli per 2P-IVM degli organi linfoidi e non linfoidi. Tuttavia, la formazione immagine degli organi respiratori rimane una sfida a causa del movimento associata al ciclo di respirazione dell'animale.

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare in vivo delle cellule immuni interazioni nella trachea di topi infettati con il virus dell'influenza utilizzando 2P-IVM. A questo scopo, abbiamo sviluppato una piattaforma di formazione immagine personalizzata, che comprendeva l'esposizione chirurgica e intubazione della trachea, seguita dall'acquisizione di immagini dinamiche dei neutrofili e cellule dendritiche (DC) nell'epitelio mucoso. Inoltre, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per eseguire l'influenza intranasale infezione e flusso cytometric analisi delle cellule immuni nella trachea. Infine, abbiamo analizzato il neutrofilo e motilità DC così come le loro interazioni nel corso di un film. Questo protocollo permette per la generazione di immagini 4D stabile e luminose necessario per la valutazione delle interazioni cellula-cellula nella trachea.

Introduction

Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) è una tecnica efficace per l'imaging di tempo reale delle interazioni cellula-cellula che si verificano nel loro ambiente naturale¹. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette lo studio di processi cellulari, a una maggiore profondità di campione (500 µm a 1 mm), rispetto ad altri di tecniche di imaging tradizionale². Allo stesso tempo, l'uso di due fotoni di bassa energia generata dal laser del due-fotone minimizza il foto-danno di tessuto tipicamente associato con il processo di acquisizione immagine². Durante l'ultimo decennio, 2P-IVM ....

Protocol

Tutte le procedure di animale che coinvolgono topi sono stati eseguiti secondo l'Ufficio federale di veterinaria indirizzi e protocolli animale sono state approvate dalle autorità veterinario locale.

1. influenza infezione dei topi CD11c-YFP

1. Biosicurezza
   Nota: Il ceppo del mouse adattato di influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) è stato coltivato in uova fecondate, purificato e titolato come descritto in precedenza²¹. Tutti i passaggi che coinvolgono gli animali infetti o campioni biologici sono stati effettuati sotto una cappa di biosicurezza in base al livello di biosicurezza (BSL) 2 ....

Results

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per studiare in vivo la motilità e le interazioni tra neutrofili e DC durante l'infezione di influenza nella trachea murina (Figura 3A). A questo scopo, abbiamo isolato i neutrofili PCP⁺ (92% di purezza; Figura 3B) da CK6-ECFP topi e abbiamo passivamente trasferiti li in un mouse CD11c-YFP infettato con la riossidazione. Dopo di che, abbiamo effettu.......

Discussion

Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per la generazione di immagini 4D che mostrano la migrazione dei neutrofili passivamente trasferiti e loro interazioni con DC durante un'infezione influenzale nella trachea del mouse. Il modello descritto 2P-IVM saranno rilevante per studiare la dinamica delle cellule immuni durante un'infezione delle vie aeree.

Recentemente, diversi modelli basati sulla visualizzazione delle dinamiche delle cellule delle vie aeree sono stati sviluppati

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gigasept instru AF	Schü lke & Mayr GmbH		4% soluzione
CD11c-YFP topi	Laboratories	008829	topi sono stati allevati internamente
topi CK6-ECFP	Jackson Laboratories	004218	topi sono stati allevati internamente
1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco modificata senza couro di calcio e cloruro di magnesio	Sigma	D8537-500ML
10x Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco modificata senza coruro di calcio e cloruro di magnesio	Sigma	D1408-500ML
Percoll PLUS	Sigma	E0414-1L	Conservare a 4 gradi; C
Ketamin Labatec	Labatec Pharma	7680632310024	Store presso RT, negozio a 4 ° C quando in soluzione di miscela ket/xyl
Rompun 2% (Xylazin)	Bayer	6293841.00.00	Conservare a RT, conservare a 4 ° C quando in soluzione di miscela ket/xyl
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak	BD Plastipak	305501
30 G, 0,3 mL BD Siringhe da insulina micro-fine	BD 324826
Falcon 40 µ m Cell Strainer	Corning	352340
Siringhe da 2 mL BD	Plastipak	300185
Microlance 3 aghi da 18 G	BD	304622
Introcan Safety 20 G (catetere)	Braun	4251652.01
Cluster di coltura cellulare a 6 pozzetti	Costar	3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)	ThermoFisher Scientific	42401-018	Negozio a 4 gradi C
Liberase TL Research Grade Roche		5401020001	Store a -20 gradi C / collagenasi (I e II) miscela
DNAsi I	Amresco (VWR)	0649-50KU	Conservare a -20 ° C
CellTrace Colorazione viola	ThermoFisher Scientific	C34557	Conservare a -20 C
EDTA	Sigma	EDS-500G
Siero fetale bovino	Gibco	10270-106	Conservare a -20 ° C
PE-10 Micro Tubo Medico	2Biological Instruments SNC	#BB31695-PE/1
Nastro Chirurgico in Plastica M	Plast
Viscotears	Bausch & Lomb		Store presso RT
Plastilina	Ohropax
Vetrino coprioggetti in vetro ad alta tolleranza 15 mm rotondo	Warner Instruments	64-0733
SomnoSuite Sistema portatile per anestesia animale	Kent Scientific	SS-01
Nuvo Lite mark 5	GCE medline	14111211
MiniTag (anestesia gassosa e banco riscaldante)	Tem Sega
SURGICAL BOARD	Università di Berna
TrimScope II Microscopio a due fotoni	LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa laser	Coherent Inc.
Obiettivo ad immersione in acqua 25X NA 1.05	Olympus	XLPLN25XWMP2
The Cube& La camera di incubazione e il regolatore di temperatura The Box	Life imaging Services
imaging	Bitplane		Imaris 9.1.0
GraphPad Prism 7	GraphPad		Software statistico