Articolo metodologico

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

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DOI:

10.3791/58368

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2 ottobre 2018

 ,  ,  , 
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

* These authors contributed equally

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Sommario

Ricche di cisteina peptidi piegare in strutture tridimensionali distinte a seconda della loro connettività di bisolfuro. Sintesi mirata di isomeri di bisolfuro individuali sono necessaria quando ossidazione buffer non comporta la connettività di bisolfuro desiderata. Il protocollo riguarda la sintesi selettiva dei peptidi 3-bisolfuro-legato e loro analisi strutturale mediante studi NMR e MS/MS.

Abstract

Peptidi con un elevato numero di cisteine sono influenzati solitamente per quanto riguarda la struttura tridimensionale di loro connettività di bisolfuro. Così è molto importante per evitare la formazione di legami disolfuro indesiderati durante la sintesi del peptide, perché può provocare una struttura completamente diversa del peptide e alterato di conseguenza bioattività. Tuttavia, la corretta formazione di ponti disolfuro multiple in un peptide è difficile da ottenere utilizzando metodi di auto-pieghevoli standard quali i protocolli di ossidazione convenzionale buffer, perché diverse connettività disolfuro può essere formato. Questo protocollo rappresenta una strategia avanzata necessaria per la sintesi mirata di più peptidi a ponte disolfuro che non possono essere sintetizzati tramite ossidazione di buffer in alta qualità e quantità. Lo studio dimostra l'applicazione di una strategia di gruppo protezione distinte per la sintesi di tutti gli isomeri possibili peptide 3-bisolfuro-legato di µ-conotossina PIIIA in modo mirato. I peptidi sono preparati di sintesi del peptide di fase solida Fmoc-based utilizzando una strategia di gruppo protezione per formazione di legami disolfuro definiti. Le rispettive coppie di cisteine sono protetti con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) e tert-butilico (tBu) proteggere gruppi per assicurarsi che in ogni fase di ossidazione solo le cisteine richieste sono deprotetti e collegate. Oltre la sintesi mirata, una combinazione di diversi metodi analitici è utilizzata per chiarire il corretto folding e la generazione delle strutture del peptide desiderato. Indica il confronto tra i diversi isomeri 3-bisolfuro-legato l'importanza della determinazione accurata e conoscenza della connettività disolfuro per il calcolo della struttura tridimensionale e interpretazione del biologico attività degli isomeri del peptide. La caratterizzazione analitica comprende la delucidazione di legame disolfuro esatta tramite analisi di spettrometria di massa (MS/MS) tandem che viene eseguita con derivati parzialmente ridotti e alchilati di isomero peptide intatto prodotto da un protocollo adattato. Inoltre, le strutture del peptide sono determinate utilizzando esperimenti 2D a risonanza magnetica nucleare (NMR) e le conoscenze ottenute da analisi MS/MS.

Introduzione

L'uso di peptidi bioattivi in farmaceutica ricerca e sviluppo è altamente riconosciuta, perché essi rappresentano composti potente e altamente selettivi per specifici bersagli biologici1. Per loro bioattività, tuttavia, la struttura tridimensionale è di grande importanza al fine di eseguire il rapporto struttura-attività studi2,3,4. A parte la sequenza di amminoacido primaria che influenza la conformazione generale, legami bisolfurico significativamente stabilizzano la struttura dei peptidi ricchi di cisteina5. Più peptidi a ponte disolfuro includono conotossine come µ-PIIIA da Conus purpurascens che contiene sei cisteine nella relativa sequenza. Questo contenuto di cisteina alta teoricamente permette la formazione di 15 isomeri di bisolfuro. La connettività di bisolfuro corretta è molto importante per l'attività biologica6,7. Tuttavia, la domanda che si pone è se c'è più di una conformazione bioattiva di peptidi naturali e se così, quale di questi isomeri possiede il più alta attività biologica? Nel caso di µ-conotossine, i bersagli biologici sono canali ionici voltaggio-dipendenti del sodio e µ-PIIIA, in particolare, è più potente per sottotipi NaV1.2, NaV1.4 e NaV1.73.

Sintesi di peptidi a ponte disolfuro può essere raggiunto utilizzando vari metodi. Il metodo più conveniente per la formazione di ponti disolfuro all'interno di un peptide è il cosiddetto approccio auto-folding ossidativo. Qui, il lineare precursore del peptide ciclico desiderato è sintetizzato utilizzando prima sintesi del peptide di fase solida, che è dopo la scissione dal supporto polimerico sottoposto ad ossidazione in un sistema tampone. Agenti redox-attivo come glutatione ridotto e ossidato (GSH/GSSG) vengono spesso aggiunti per promuovere la formazione dei legami disolfuro. Lo svantaggio principale di auto-buffer-supportato pieghevoli è che i legami disolfuro non si formano in modo selettivo ad un modo graduale. Rispetto al peptide nativo, per cui spesso isomero di un solo specifico disolfuro è descritto, è possibile ottenere numerosi altri isomeri con questo approccio8. µ-PIIIA ha già dimostrato di provocare almeno tre isomeri diversamente piegati su self-pieghevole in un precedente studio3. La separazione di una miscela di isomeri è piuttosto difficile a causa di tempi di ritenzione simili se utilizza metodi di purificazione cromatografica9. La sintesi mirata di un isomero specifico è pertanto vantaggiosa. A specificamente producono che un isomero con connettività di bisolfuro definiti, una strategia speciale è necessaria in cui obbligazioni al bisolfuro successivamente vengono chiusi. Pertanto, il precursore lineare che trasportano gruppi distinti di protezione presso le coppie singoli cisteina è sintetizzato il supporto di polimero. Dopo l'eliminazione, le coppie di cisteina sono individualmente e successivamente deprotetti e collegati in una reazione di ossidazione per produrre il desiderato bisolfuro obbligazioni10,11,12,13, 14 , 15 , 16. dopo la sintesi e la purificazione del prodotto di reazione, è necessario confermare l'identità e la connettività di bisolfuro di metodi analitici adatti. Numerosi metodi analitici sono disponibili per la delucidazione della sequenza primaria dell'amminoacido, ad es., MS/MS, mentre la determinazione della connettività bisolfuro rimane ancora molto meno studiata. A parte la complessità di tali peptidi multipli di bisolfuro-legato, impurità relative ai prodotti (ad es., da bisolfuro scrambling), a causa del campione preparazione e work-up può complicare ulteriormente analisi. In questa carta, indichiamo che l'uso di una combinazione di diverse tecniche analitiche è necessario chiarire in modo inequivocabile l'identità dei legami disolfuro negli isomeri µ-PIIIA. Abbiamo combinato i metodi cromatografici con spettrometria di massa e fornito gli stessi campioni di spettroscopia NMR. In matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) analisi MS/MS, abbiamo identificato i legami disolfuro con riduzione parziale e iodoacetamide derivatizzazione in quanto analisi top-down non sono possibile per questo peptide. 2D NMR esperimenti sono stati eseguiti al fine di ottenere una struttura tridimensionale di ogni isomero. Così, combinando metodi analitici sofisticati distinti, è possibile chiarire correttamente la connettività di bisolfuro e la struttura tridimensionale del complesso più peptidi bisolfuro-legato7.

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Protocollo

Nota: Tutti gli amminoacidi utilizzati nel presente documento sono stati nella L-configurazione. Le abbreviazioni di aminoacidi e derivati di aminoacidi sono state utilizzate secondo le raccomandazioni del Comitato di IUB la nomenclatura e la Commissione congiunta di IUPAC-IUB sulla nomenclatura biochimica.

1. fase solida del Peptide sintesi (SPPS)

Nota: Eseguire la sintesi con un sintetizzatore del peptide di fase solida. Eseguire la sintesi dei precursori del peptide lineare della sequenza generale ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 utilizzando un protocollo standard per la chimica 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). Applicare i seguenti aminoacidi protetti: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) e il suo (Trt). Proteggere le coppie di cisteina con Trt-, Acm- o tBu-gruppi secondo la connettività previsto disolfuro.

  1. Preparazione
    1. Asciugare la resina Fmoc Rink-ammide (caricamento: 0,28 mmol/g) utilizzando un liofilizzatori durante la notte.
    2. Inserire la sequenza del peptide desiderato (1-lettera codice) nel programma del sintetizzatore. Il programma calcola la quantità necessaria per ogni singolo reagente e indica la quantità di solvente.
    3. Pesare i singoli reagenti (aminoacidi, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Esafluorofosfato)) secondo il protocollo e scioglierli in dimetilformammide (DMF) ad una concentrazione finale di 2,4 M (aminoacidi) e 0,6 M ( HBTU), rispettivamente.
    4. Trasferire i reagenti differenti (aminoacidi, HBTU, N-metilmorpholin-(NMM, 50% in DMF), piperidina (20% in DMF), DMF, diclorometano (DCM)) ai vasi corrispondenti e metterli nel racket della appropriata del sintetizzatore del peptide di fase solida.
    5. Aggiungere 100 mg di resina secca per le colonne di reazione e metterli nella racchetta del sintetizzatore. Iniziare la sintesi peptidica in fase solida.
  2. SPPS-protocollo (fornito dal sintetizzatore)
    Nota: Il protocollo si applica a 100 mg di resina (caricamento: 0,28 mmol/g) aggiunto alla colonna uno reazione per 28 µmol scala.
    1. Preparazione della resina
      1. Sciacquare la resina con 2500 µ l di DMF, 1400 µ l di DCM e 1400 µ l di DMF.
      2. Lavare la resina con aria fino a quando il solvente viene rimosso e sciacquare la resina con 2500 µ l di DMF.
    2. Fenditura di Fmoc protezione gruppo
      1. Aggiungere 20% piperidina in DMF (1000 µ l) per la resina e l'attesa per un minimo di 6 Rimuovere la soluzione dalla resina. Ripetere il passaggio 1.2.2.1.
      2. Sciacquare due volte con DMF (1st 4000 µ l, 2nd1400 µ l), lavare la resina con aria fino a quando il solvente viene rimosso e lavare due volte con 2000 µ l di DMF.
    3. Reazione di accoppiamento
      1. Mescolare i seguenti reagenti in un flaconcino separato: HBTU (450 µ l; 0,6 M in DMF; 270 µmol; 9,6 EQ.), NMM (125 µ l, 50% in DMF; 568 µmol; 20 EQ.), Fmoc-amminoacido (µ l 420; 2,4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 EQ.). Aggiungere la miscela di resina e attendere per un minimo di 13 Rimuovi la soluzione dalla resina. Ripetere il passaggio 1.2.3.1.
      2. Lavare con 3000 µ l di DMF. Lavare due volte con 1400 µ l di DMF. Lavare due volte con 2000 µ l di DMF.
      3. Ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 secondo il numero di aminoacidi nella sequenza del peptide.
    4. Lavaggio finale del clivaggio e resina di Fmoc
      1. Aggiungere 20% piperidina in DMF (1000 µ l) per la resina e l'attesa per un minimo di 6 Rimuovere la soluzione dalla resina. Ripetere il passaggio 1.2.4.1.
      2. Sciacquare due volte con DMF (1st 4000 µ l, 2nd 1400 µ l) e lavare la resina con aria. Sciacquare due volte con 2000 µ l di DMF, 4 volte con 1400 µ l di DCM e lavare due volte con aria.
  3. Il work-up
    1. Lyophilize la resina dalla reazione di colonne durante la notte dopo la sintesi è completa.

2. peptide scissione dalla resina (Figura 1A)

Nota: Durante la procedura di scissione, saranno deprotetto tutte le catene laterali di aminoacidi ad eccezione di Cys(Acm) e Cys (tBu). Il protocollo si applica a 100 mg di resina.

  1. Combinare la resina liofilizzata in un tubo di 12 ml e raffreddarlo a 0 ° C sul ghiaccio.
  2. Aggiungere 150 µ l di una miscela di scavenger (preparato da fenolo g 0,75, 0,5 mL thioanisole, etanditiolo 0,25 mL) e 1 mL di acido trifluoroacetico (TFA, 95% in acqua (H2O)) su ghiaccio alla resina. Lasciare scuotendo delicatamente per 3 h a temperatura ambiente.
  3. Filtrare la miscela attraverso un setto di vetro e raccogliere il filtrato in tubi pieni individualmente ghiacciata dietil etere (1 mL di miscela di fenditura per 8-10 mL di etere etilico). Il peptide precipita come solido bianco.
  4. Sciacquare il panello con ulteriore TFA (95% in H2O, circa 1-3 mL).
  5. Chiudere le provette contenenti il precipitato e centrifugare (3400 x g) le sospensioni per 1 min, decantare il supernatante e lavare il pellet con 8-10 mL di etere etilico ghiacciata. Ripetere l'operazione 3 volte.
  6. Lasciare il pellet in piedi senza tappo per 5 min per rimuovere le tracce rimanenti di etere etilico. Sciogliere il pellet prodotto grezzo in 1 mL di tert-butanolico (80% in H2O). Liofilizzare i peptidi (-80 ° C).

3. purificazione del precursore lineare con semi-preparatorio alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)

Nota: Purificare i peptidi greggi di semi-preparatorio fase inversa (RP) HPLC dotato di una colonna C18 (5 µm granulometria, 100 Å dimensione dei pori, 250 x 32 mm) e un ciclo di iniezione 3,6 mL. Utilizzare un sistema di eluizione di pendenza di 0,1% TFA in H2O (eluente A) e 0,1% TFA in acetonitrile (MeCN) / h2O (9:1, eluente B). Rilevare i picchi a 220 nm.

  1. Aggiungere circa 70 mg del peptide grezzo in una provetta da 15 mL e sciogliere il peptide solido nel volume del ciclo campione HPLC (ad es., 3,6 mL). Utilizzare una miscela di 0,1% TFA in MeCN/H2O (1:1). Vortice fino a completa dissoluzione e centrifugare (3400 x g) la soluzione per 1 min.
  2. Redigere il campione (3,6 mL) in una siringa da 5 mL e iniettare il campione senza bolle d'aria per il ciclo di iniezione. Iniettare nel sistema HPLC. Separare la miscela peptidica utilizzando un gradiente di 0-50% eluente B oltre 120 min con una portata di 10 mL/min.
  3. Raccogliere le frazioni in singole provette come appaiono. Dopo che viene completata l'esecuzione, preparazione delle frazioni selezionate per l'analisi HPLC (passo 6.1-6.2) e spettrometria di massa (MS). Liofilizzare le frazioni e conservarli a-20 ° C.
  4. Dopo l'analisi MS e HPLC, combinare le frazioni pure di peptide lineare e preparazione dei campioni per l'ossidazione prima.

4. selettivo formazione dei legami disolfuro

  1. 1 st ossidazione (Figura 1B)
    Nota: Durante la scissione del peptide dalla resina, i Cys(Trt) sono deprotetti, che conduce ai due residui di Cys non protetti che sono successivamente sottoposti ad ossidazione per formare il primo legame disolfuro. Il seguente protocollo si applica a 15 mg di peptide purificato lineare (2864.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 EQ.).
    1. Sciogliere il peptide lineare (15 mg) in 105 mL di un isopropanolo/H2O-miscela (1:2; 0,05 mM, pH 8.5 regolato con idrossido di sodio (NaOH)) e lasciare delicatamente agitando in aria in condizioni di base per 12-48 h.
    2. Monitorare la reazione di ossidazione tramite HPLC e MS. Confirm la formazione del primo ponte di derivatizzazione iodoacetamide (IAA) (passaggio 6).
    3. Liofilizzare il peptide e utilizzarlo senza ulteriore purificazione per l'ossidazione 2nd .
  2. 2nd ossidazione (Figura 1C)
    Nota: Durante l'ossidazione di seconda, la deprotezione delle cisteine Acm-protetto e la formazione del secondo ponte vengono catalizzate da iodio. Il protocollo si applica a 15 mg di peptide dopo l'ossidazione dist 1 (2862.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 EQ.)
    1. Sciogliere il peptide (15mg; concentrazione finale pari a 0,05 mM) in 105 mL di un isopropanolo/H2M O/1 miscela di acido cloridrico (HCl) (80:12.5:7.5).
    2. Aggiungere 158 µ l di una soluzione di iodio 0,1 M in metanolo (MeOH) (µmol 15,7; 3 EQ.) alla soluzione. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 3-52 h, vale a dire., finché non viene completata l'ossidazione.
    3. Monitorare la reazione di ossidazione tramite HPLC e MS. Confirm la formazione del legame disolfuro secondo iodoacetamide (IAA) derivatizzazione (passaggio 6).
    4. Fermare la reazione aggiungendo 79 µ l di una soluzione di acido ascorbico 1 M in H2O (78,8 µmol; 15 EQ.). Liofilizzare la miscela di reazione e usare la polvere per l'ossidazione 3rd .
  3. 3rd ossidazione (Figura 1D)
    Nota: L'ultimo ossidazione conduce per la deprotezione delle cisteine tBu-protetto e per la formazione del terzo ponte disolfuro. Il protocollo si applica a 15 mg di peptide dopo l'ossidazione 2nd (2718.3 g/mol; 5,5 µmol; 1 EQ.).
    1. Sciogliere il peptide (15 mg, la concentrazione finale di 1 mM) in 5,5 mL di TFA. Contiene una miscela di scavenger composto da 11,2 mg di diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 EQ.), 60,2 µ l di anisolo (0,6 mmol; 100 EQ.) e 97,2 µ l di trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 EQ.). Mescolare il composto per 3-5 h a temperatura ambiente.
    2. Monitorare la reazione di ossidazione tramite HPLC e MS. Confirm la formazione del legame disolfuro terzo iodoacetamide (IAA) derivatizzazione (passaggio 6).
    3. Precipitare il peptide nei tubi contenenti freddo dietil etere (0 ° C, 1 mL di soluzione di reazione per 8-10 mL di etere etilico).
    4. Centrifugare le sospensioni (3400 x g, 1 min), decantare il supernatante e lavare il pellet più volte (4 volte) con 8-10 mL di etere etilico freddo (0 ° C). Asciugare il pellet in onda (3 min).
    5. Sciogliere il pellet in 1 mL di 80% terz-butanolo (in H2O), liofilizzare il peptide e conservare a-20 ° C.

5. peptide purificazione

Nota: Purificare i peptidi ossidati di semi-preparative RP HPLC dotato di una colonna C18 (10 µm granulometria, 300 Å dimensione dei pori, 250 x 22 mm) e un ciclo di iniezione 3,6 mL. Utilizzare un sistema di eluizione di pendenza di 0,1% TFA in H2O (eluente A) e 0,1% TFA in MeCN/H2O (9:1, eluente B). Rilevare i picchi a 220 nm.

  1. Aggiungere 15 mg di liofilizzato prodotto grezzo dal punto 4.3.5 per un tubo da 15 mL. Sciogliere il prodotto grezzo nel volume del ciclo campione HPLC (ad es., 3,6 mL). Utilizzare una miscela di 0,1% TFA in MeCN/H2O (1:1). Vortice fino a completa dissoluzione e centrifugare (3400 x g) la soluzione per 1 min.
  2. Redigere il 3,6 mL di miscela in una siringa da 5 mL e iniettare il campione senza bolle d'aria per il ciclo di iniezione. Avviare l'iniezione nel sistema HPLC. Purificare la miscela peptidica utilizzando un gradiente di 0-50% eluente B oltre 120 min con una portata di 10 mL/min.
  3. Raccogliere le frazioni in singole provette come appaiono. Dopo che viene completata l'esecuzione, è possibile preparare frazioni selezionate per l'analisi di MS e HPLC (passo 6.1-6.2). Liofilizzare tutte le frazioni e conservarli a-20 ° C.
  4. Dopo che viene completata l'esecuzione, è possibile preparare frazioni selezionate per l'analisi di MS e HPLC (passo 6.1-6.2). Liofilizzare tutte le frazioni e conservarli a-20 ° C.

6. peptide Analitica

  1. Analitiche per HPLC
    Nota: Verificare la purezza di un peptide di analitica RP HPLC, dotato di una colonna C18 (5 µm granulometria, 300 Å dimensione dei pori, 250 x 4,6 mm) e un ciclo di iniezione 500 µ l. Utilizzare un sistema di eluizione di pendenza di 0,1% TFA in H2O (eluente A) e 0,1% TFA in MeCN (eluente B). Rilevare i picchi a 220 nm.
    1. Trasferire un campione delle frazioni del peptide o controlli di reazione in un HPLC fiala e scioglierla in una miscela di 0,1% TFA in MeCN/H2O (1:1, 300-500 µ l). Collocare il flaconcino HPLC nell'autocampionatore di RP HPLC analitica.
    2. Iniettare 250 µ l di ciascun campione. Utilizzare un sistema di eluizione di pendenza di 0,1% TFA in H2O (eluente A) e 0,1% TFA in MeCN (eluente B). Purificare il peptide utilizzando un gradiente di 10-40% eluente B oltre 30 min ad una portata di 1,0 mL/min.
  2. Spettrometria di massa MALDI TOF
    Nota: Confermare l'identità di un peptide di spettrometria di massa MALDI TOF (tempo di volo) utilizzando l'acido α- ciano-4-idrossicinnamico come matrice.
    1. Trasferire una quantità visibile del peptide in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e dissolverlo in 10 µ l di una soluzione di acido di 37mm α- ciano-4-idrossicinnamico in una miscela di 0,1% TFA in H2O/MeCN (1:1).
    2. Vortice la soluzione per 10 s, applicare 2 µ l di campione a una destinazione in acciaio rettificato e asciugare il campione.
    3. Utilizzare la modalità di reflector per le misurazioni e una taratura di peptide standard per masse molari inferiori a 6000 g/mol.
  3. Derivatizzazione iodoacetamide
    Nota: Come iodoacetamide reagisce con gruppi tiolici, iodoacetamide derivatizzazione dei peptidi indica gruppi tiolici liberi. Quindi, l'assenza dei gruppi tiolici liberi serve come un controllo di reazione tramite MS durante l'ossidazione dist 1.
    1. Sciogliere il peptide in tampone fosfato 10 mM (100 µ l; 0,05 mM; pH 7,8) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 100 µ l di iodoacetamide in tampone fosfato 10 mM (4 mM) per la soluzione del peptide e agitare delicatamente la reazione per 2 h a temperatura ambiente al buio. Liofilizzare la miscela di reazione e conservare a-20 ° C.
    2. Utilizzare la punta di una pipetta di filtro C18-concentrazione e condizionare la punta con 10 µ l di 80% (3 volte), 50% (3 volte), 30% (3 volte) e 0% MeCN (3 volte) in H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Sciogliere il campione dal punto 6.3.1 in 1 µ l di 0,1% TFA in H2O e aggiungere la soluzione alla punta della pipetta di filtro. Pipettare attentamente su e giù così che il peptide si lega per il tallone. Rimuovere l' H2O fuori la punta della pipetta e risciacquare la punta della pipetta filtro con 10 µ l di 0,1% TFA in H2O.
    4. Aggiungere 2 µ l di 0,1% TFA in H2O/MeCN (1:1) con un'altra punta della pipetta (senza filtro) sulla parte superiore del tallone che contiene il peptide. Applicare il filtrato alla destinazione in acciaio rettificato e asciugare il campione.
    5. Applicare 1 µ l di una soluzione di acido α-ciano-4-idrossicinnamico 37 mM in una miscela di 0,1% TFA in H2O/MeCN (1:1) per l'acciaio di terra bersaglio con il campione e asciugare il campione.
    6. Utilizzare la modalità di reflector per le misurazioni e una taratura di peptide standard per masse molari inferiori a 6000 g/mol.
  4. Analisi dell'amminoacido
    Nota: Analizzare la concentrazione esatta del peptide, nonché la composizione aminoacidica del peptide usando un analizzatore dell'amminoacido.
    1. Trasferire 100 µ g del peptide puro (2604 g/mol; 0.04 µmol) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e sciogliere la polvere in 200 µ l di 6 M HCl.
    2. Trasferire 200 µ l della soluzione in una fiala di vetro e sciacquare il tubo del microcentrifuge 1.5 mL due volte con 200 µ l di 6 M HCl. trasferire la soluzione di risciacquo nella fiala di vetro pure.
    3. Chiudere la fiala riscaldando il collo della fiala con una fiamma di bruciatore di Bunsen. Mettere la fiala in una provetta di vetro. Posto in un blocco di riscaldamento per 24 h a 110 ° C per idrolisi.
    4. Aprire la fiala e trasferire la soluzione in un tubo del microcentrifuge 2 mL. Lavare l'Ampolla (3 x 200 µ l) e il tappo (3 x 100 µ l) con bidistillata H2O e trasferirlo nel tubo del microcentrifuge.
    5. Centrifugare la soluzione per 6 h a 60 ° C e 210 x g in un concentratore a vuoto rotazionale. Sciogliere il prodotto idrolizzato in 192 µ l di tampone di diluizione del campione (200 µM) e trasferire la soluzione in un filtro micro-centrifuga.
    6. Centrifugare il campione per 1 min a 2300 x g e trasferire 100 µ l del filtrato in una provetta del campione di analisi dell'amminoacido. Collocare la provetta nell'analizzatore dell'amminoacido e avviare l'analisi. Uno standard di aminoacido viene utilizzato per la calibrazione.

7. MS/MS analisi della connettività bisolfuro

  1. Parziale riduzione e alchilazione17
    1. Sciogliere 600 µ g del peptide puro (2604 g/mol; 0,23 µmol) in 1,2 mL di tampone citrato 0.05 M (pH 3.0; concentrazione nel peptide di 0,14 mM) contiene 7,5 mg di tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP; M 0,02 0,03 mmol).
    2. Incubare la miscela a temperatura ambiente e prendere reazione diversi campioni di controllo (100 µ l) che vanno da 0 min a 30 min.
    3. Mescolare i campioni in una microcentrifuga da 1,5 mL con 300 µ l di tampone di alchilazione (0.5 M tris-acetato; pH 8.0; acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed); 1,1 M iodoacetamide) per fermare la reazione ed eseguire carbamidomethylation dei gruppi tiolici liberi.
    4. Arrestare la reazione dopo 5 min aggiungendo 100 µ l di 10% TFA (in H2O) e archivio dei campioni su ghiaccio secco. Preparare i campioni HPLC come descritto al punto 6.1.2 ed iniettare 400 µ l. (Figura 2A)
    5. Utilizzare un sistema di eluizione di pendenza di 0,1% TFA in H2O (eluente A) e 0,1% TFA in MeCN (eluente B). Analizzare i peptidi utilizzando la combinazione di una separazione isocratica (10% eluente B per 15 min) e poi un gradiente successivo di 10-35% eluente B oltre 25 min ad una portata di 10 mL/min. rilevare i picchi a 220 nm.
    6. Raccogliere le frazioni in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e liofilizzare i peptidi. (Figura 2B)
    7. Trasferire una piccola quantità di ciascuna frazione di una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per analisi di MS/MS delle forme ossidate (continuare a passo 7.1.12).
    8. Sciogliere il restante peptide (10-100 µ g) nello 0,1% TFA in H2O (10-50 µ l) e aggiungere un volume appropriato di soluzione TCEP 100mm (in H2O) per ottenere una concentrazione finale di TCEP di 10 mM.
    9. Incubare la reazione per 1h a 37 ° C (Figura 2C). Liofilizzare la miscela di reazione e conservare a-20 ° C.
    10. Preparare i campioni di MS/MS come descritto nel passo 6.3.2-6.3.5.
    11. Eseguire le misure di MS/MS su uno spettrometro di massa MALDI-TOF/TOF. Utilizzare il coperchio MS/MS (indotta da laser decadimento) per frammentazione del peptide e selezionare le masse di precursore delle specie carbamidomethylated 2 e 4 volte. Elaborare e valutare i dati MALDI per verificare la connettività di bisolfuro desiderata.

8. NMR esperimenti e analisi della struttura

  1. Sciogliere circa 0,3-2 mg di prodotto puro del peptide in 500 µ l di H2o/d2O (90: 10) e trasferire la miscela in una microprovetta NMR.
  2. Preparare il campione per misurazioni a uno spettrometro NMR
  3. Record 2-dimensionale [1H,1H] - DQF - COSY (doppio spettroscopia di correlazione quantistica filtrata), [1H,1H] - TOCSY (totale correlata spettroscopia), [1H,1H] - NOESY (nucleare Overhauser enhancement spettroscopia) e [1H,13C]-spettri HSQC (coerenza di singolo quantum eteronucleari) utilizzando acqua soppressione.
  4. Assegnare le risonanze del protone di spettri registrati e creare l'assegnazione di atomo da spettri NOESY. Confrontare le intensità negli spettri NOESY per impostare i vincoli di limite superiore distanza tra atomi diversi nel peptide. Usare l'intensità dei protoni germinali per la calibrazione di intensità di picco.
  5. Eseguire il calcolo della struttura e della raffinatezza con un programma per computer per la visualizzazione molecolare e utilizzare la connettività identificati bisolfuro di Step 7 come ulteriori vincoli (Figura 3).
  6. Selezionare le strutture con le energie più basse e utilizzarlo per simulazioni di dinamica molecolare (MD).

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Risultati

15 diversi isomeri a ponte disolfuro di PIIIA il µ-conotossina sono sintetizzati e caratterizzati in dettaglio (Figura 1). I legami bisolfurico sono identificati da riduzione parziale e successiva analisi di MS/MS (Figura 2). Analisi NMR degli isomeri differenti avviene (Figura 3) per rivelare le strutture individuali del peptide. In particolare, una combinazione di RP HPLC, frammentazione MS/MS e NM...

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Discussione

Il metodo descritto nel presente documento per la sintesi di peptidi ricchi di cisteina come µ-PIIIA rappresenta una possibilità di produrre in modo selettivo gli isomeri bisolfuro-legato dalla stessa sequenza dell'amminoacido. Di conseguenza, stabilire metodi come solida base di Fmoc fase peptide sintesi18 e una strategia di gruppo protezione definita per la formazione regioselettiva di legami bisolfurico erano usati16. La sintesi peptidica in fase solida può produrre sequ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare r. Resemann, F. J. Mayer e D. Suckau da Bruker Daltonics GmbH di Brema; D. Tietze, r. r. Tietze, V. Schmidts e C. Thiele dal Politecnico di Darmstadt; O. Ohlenschläger dal FLI Jena, M. Engeser all'Università di Bonn; K. Kramer, r. Vortrieb e H. Nakagami dal Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Colonia; Susanne Neupert dell'Istituto di zoologia, Colonia; e le strutture di spettroscopia di risonanza magnetica biomolecolari dell'Università di Francoforte per tecnico sostegno, moduli, di formazione e accesso agli strumenti. Sostegno finanziario all'Università di Bonn a D.I. si ringraziano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide resinaVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr (Boc)BachemA-3850
Arg (Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn (Trt)BachemB-1785
Asp (tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp (tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys (Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronioesafluorfosfatoSigma Aldrich8510060infiammabile
DMFFisher ScientificD119Infiammabile, tossico
DCMFisher ScientificD37Cancerogeno
PiperidinaAlfa AesarA12442Infiammabile, tossico, corrosivo
N-metil-morfelinaSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
acido trifluoruaceticoSigma Aldrich74564Tossico, fenolo corrosivo
Merck1002060tossico
tioanisoloAlfa AesarA14846
etanedithiolFluka Analytical2390
etere etilicoVWR100,921
Terz-butanoloAlfa AesarL12338Acetonitrile infiammabile
Fisher ScientificA998Acqua infiammabile
Fisher ScientificW5
isopropanoloVWRACRO42383
Idrossido di sodioAppliChemA6579,1000
IodoacetammideSigma AldrichI6125
iodioSigma AldrichI0385
Acido cloridricoMerck110165
Acido ascorbicoSigma AldrichA4403
difenilsolfossidoSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109
TriclorometilsilanoSigma AldrichM85301Tampone
di diluizione del campioneLaborservice Onken
sodio diidrogeno fosfatoSigma Aldrich106370
fosfato acido disodicoSigma Aldrich795410
(2-carbossietil)fosfina cloridratoSigma AldrichC4706
acido citricoSigma Aldrich251275
citrato di sodio diidratoSigma AldrichW302600
tris-acetatoCarl Roth, 7125
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma AldrichE26282 
standard di calibrazione dei peptidi IIBruker Daltonics GmbH8222570
Nome dell'apparecchiaturaAzienda
sintetizzatore di peptidi in fase solidaIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
liofilizzatore Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparativo HPLCJascocolonna PV-987
Eurospher 100 C18 (RP, 5 &; m granulometria, 100 & Aring; dimensione dei pori, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Jpurificazione del peptide lineare
Vydac 218TP1022 colonna (RP C18, 10 &; m granulometria, 300 & Aring; dimensione dei pori, 250 x 22 mm)Hichrom-VWR HICH218TP1022purificazione del peptide ossidato analitico
HPLC Sistema ShimadzuLC-20AD
Vydac 218TP54 colonna (C18 RP, 5 µ m granulometria, 300 & Aring; dimensione dei pori, 250 x 4,6 mm) Colonna analiticaHichrom-VWRHICH218TP54
bersaglio in acciaio rettificato (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI preparazione 
Filtro di concentrazione C18 (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI preparato 
Spettrometro di massa MALDIBruker Daltonics GmbHTOF/TOF
Eppendorf-Biotronik GmbHSistema LC 3000
Spettrometro NMR Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
Programma informatico per la visualizzazione molecolareYASARA Biosciences GmbHYasara struttureCalcolo della struttura NMR
programma informatico per la valutazione dei dati MALDI Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioTools
Miscelatore a vortice analogicoVWRVM 3000
MicrocentrifugaEppendorf5410
CentrifugaHettichEBA 20
Concentratore rotazionale sottovuotoChrist2-18 Cdplus
Bilancia analiticaA& D InstrumentsGR-202-EC
infiammabile infiammabile corrosivo corrosivo infiammabile infiammabile Ultraflex III Analizzatore di amminoacidi a frammentazione MS/MS

Riferimenti

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  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
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Ristampe e permessi

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Errata corrige


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Tag

Formazione di legami disolfurosintesi peptidicasintesi in fase solidaspettrometria di massa tandemrisonanza magnetica nucleareossidazione selettivapurificazione HPLCanalisi degli amminoacidicaratterizzazione dei peptidi

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