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Articolo metodologico

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

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⸱

DOI:

10.3791/58373

⸱

26 agosto 2018

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) dei ROS (specie reattive dell'ossigeno) lo scavenging in vivo, nanoceria imaging nei tessuti vegetali e microscopia confocale in vivo monitoraggio di nanoceria ROS scavenging mediante microscopia confocale.

Abstract

L'accumulo di ossigeno reattivo specie (ROS) è un marchio di garanzia di risposta piante a stress abiotici. ROS giocano un duplice ruolo nelle piante agendo come molecole a bassi livelli di segnalazione e molecole ad alti livelli dannosi. Accumulo di ROS in piante stressati può danneggiare metaboliti, enzimi, lipidi e DNA, causando una riduzione della crescita delle piante e la resa. La capacità di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) di pulire cataliticamente ROS in vivo fornisce un unico strumento per comprendere e bioingegnere pianta stress abiotici tolleranza. Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare e caratterizzare poli (acrilico) acido nanoceria rivestito (PNC), le nanoparticelle con piante tramite infiltrazione della lamina foglia di interfaccia e monitorare la loro distribuzione e ROS lo scavenging in vivo mediante confocale microscopia. Corrente strumenti molecolari per la manipolazione di accumulo di ROS nelle piante sono limitati a specie modello e richiedono metodi di trasformazione laboriosa. Questo protocollo per in vivo lo scavenging ROS ha il potenziale per essere applicato a tipo selvaggio piante con foglie larghe e struttura foglia come Arabidopsis thaliana.

Introduzione

Nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) sono ampiamente usate negli organismi viventi, dalla ricerca di base alla bioingegneria, dovuto la loro specie distinte catalitica reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging capacità1,2,3. Nanoceria avere ROS scavenging capacità a causa di un gran numero di posti vacanti di superficie ossigeno che si alternano tra due ossidazione stati (Ce3 + e Ce4 +) 4,5,6. I legami pendenti Ce3 + puliscono efficacemente ROS mentre i ceppi della grata su nanoscala promuovono la rigenerazione di questi siti difetto via redox che ciclano reazioni7. Nanoceria sono stati recentemente utilizzati anche per lo studio e ingegneria impianto funzione8,9. Piante sotto stress abiotici verificano accumulo di ROS, causando il danno ossidativo dei lipidi, proteine e DNA10. In impianti di a. thaliana , nanoceria catalitica scavenging dei ROS in vivo conduce alla fotosintesi delle piante migliorate sotto alta luce, calore e agghiacciante sottolinea8. Nanoceria l'applicazione al suolo anche aumenti sparare resa biomassa e grano di frumento (Triticum aestivum)11; piante di colza (Brassica napus) trattate con nanoceria hanno maggiore biomassa vegetale sotto stress sale12.

Nanoceria offrire bioingegneri e pianta biologi uno strumento basato su nanotecnologie per comprendere le risposte di stress abiotici e migliorare la tolleranza di pianta stress abiotici. In vivo ROS scavenging funzionalità di Nanoceria sono indipendenti di specie vegetali, e la consegna facile nei tessuti vegetali ha il potenziale per consentire ampia applicazione all'esterno di organismi modello. A differenza di altri metodi basati su geneticamente, nanoceria non richiedono generatrici che pianta con la sovraespressione di enzimi antiossidanti per maggiore ROS scavenging capacità13. Infiltrazione della lamina foglia di nanoceria alle piante è un approccio pratico per ricerche di laboratorio.

L'obiettivo generale del presente protocollo è per descrivere 1) la sintesi e caratterizzazione di carica negativa poli (acrilico) acido nanoceria (PNC), 2) la consegna e il rilevamento di PNC in tutto cellule di foglia e 3) il monitoraggio del PNC-attivata ROS scavenging in vivo. In questo protocollo, caricate negativamente poli (acrilico) acido nanoceria (PNC) vengono sintetizzati e caratterizzati da loro spettro di assorbimento, diametro idrodinamico e potenziale zeta. Descriviamo un metodo di infiltrazione della lamina semplice foglia per consegnare PNC in pianta tessuti fogliari. Per l'imaging in vivo della distribuzione delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo, un colorante fluorescente (DiI) è stato utilizzato per etichettare PNC (DiI-PNC) e osservare le nanoparticelle tramite microscopia a fluorescenza confocale. Infine, spieghiamo come monitorare in vivo PNC ROS scavenging attraverso microscopia confocale.

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Protocollo

1. coltivazione di piante di a. thaliana

  1. Seminare i semi di a. thaliana in vasi monouso 5 cm x 5 cm, riempito con miscela di suolo standard. Mettere 32 di questi vasi in un vassoio di plastica riempito con acqua (~ 0,5 cm di profondità) e trasferire il vassoio di plastica con le piante in una camera di crescita della pianta.
    1. Impostare la crescita camera impostazioni come segue: 200 µmol/ms radiazione fotosintetica attiva (PAR), 24 ± 1 ° C giorno e notte di ± 1 ° C 21, 60% di umidità e regime di luce giorno/notte 14/10 h, rispettivamente.
  2. Sottile ogni pentola per lasciare solo un singolo impianto dopo una settimana di germinazione. Prendere nota per mantenere le piantine con dimensioni simili in ogni pentola.
  3. Acqua i vasi versando dell'acqua di rubinetto direttamente sul vassoio di plastica una volta ogni due giorni. Coltivare le piante per quattro settimane. A. thaliana piante sono pronte per un ulteriore uso.

2. sintesi e caratterizzazione di PNC

  1. Pesare 1,08 g di nitrato di cerio (III) e dissolverlo in 2,5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.
  2. Pesare 4,5 g di acido poli (acrilico) e scioglierla in 5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.
  3. Mescolare le due soluzioni accuratamente a 2.000 rpm per 15 min usando un miscelatore vortex digital.
  4. Trasferimento di 15 mL di soluzione di idrossido di ammonio (7,2 M) in un becher di vetro di 50 mL.
  5. Mescolando a 500 giri/min, aggiungere la miscela da Step 2.3 goccia a goccia la soluzione di idrossido di ammonio e mescolare a 500 giri/min a temperatura ambiente per 24 ore in una cappa aspirante.
  6. Coprire il becher con un pezzo di carta per evitare la perdita sostanziale di soluzione durante la reazione durante la notte.
  7. Dopo 24 h, trasferire la soluzione risultante in una provetta conica da 50 mL e centrifugare esso a 3.900 x g per 1 h rimuovere eventuali residui possibili e grandi agglomerati.
  8. Trasferire questo 22,5 mL della soluzione surnatante in tre filtri di kDa 15 mL 10 e riempire il resto del filtro con acqua grado molecolare per fare una diluizione totale di 45 mL.
  9. Purificare il supernatante da polimeri gratis e altri reagenti con una centrifuga da banco aggiungendo il surnatante di un filtro di 15ml 10 kDa e centrifugare a 3.900 x g per 15 min. Ripetere questo passaggio almeno sei volte.
  10. Misurare l'assorbanza di eluente in ogni ciclo con uno spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm per non garantire polimeri gratis e altri reagenti sono presenti nella soluzione finale PNC.
  11. Prelevare la soluzione PNC raccolta nella siringa da 5 mL e filtrarlo contro un 20 nm siringa filtrante di porosità. Raccogliere la soluzione filtrata PNC in una provetta conica da 50 mL.
  12. Prendere una soluzione diluita di PNC finale in una cuvetta di plastica e misurare l'assorbanza con lo spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm. Picco di assorbanza PNC è a 271 nm.
  13. Calcolare la sua concentrazione utilizzando la legge di Lambert-Beer: A = εCL. A è l'assorbanza del valore di picco per un dato campione, ɛ è il coefficiente di assorbimento molare di PNC (cm-1 M-1), L è la lunghezza del cammino ottico (larghezza cuvette, 1cm in questo metodo), e C è la concentrazione molare di nanoparticelle misurate.
  14. Misurare il diametro idrodinamico e potenziale zeta del PNC sintetizzato utilizzando una particella dimensione e zeta potenziale analyzer (Figura 1).
  15. Conservare la soluzione finale di PNC in frigorifero (4 ° C) fino al successivo utilizzo.
    Nota: Fare riferimento a Wu et al. 8 per ulteriori dettagli di protocollo sulla caratterizzazione di PNC.

3. etichettatura PNC con colorante fluorescente DiI

  1. Mescolare 0,4 mL di 5 mM (58 mg/L) PNC con 3,6 mL di biologia molecolare acqua di grado in un flaconcino di vetro da 20 mL e mescolare a 500 giri/min.
  2. Aggiungere 24 µ l 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine soluzione di perclorato colorante (DiI, 2,5 mg/mL; diluito in DMSO) in 176 µ l di DMSO (dimetilsolfossido) per rendere la soluzione di colorante DiI.
  3. Aggiungere il colorante DiI goccia a goccia la soluzione PNC, mescolando a 1.000 giri/min per 1 min a temperatura ambiente.
  4. Trasferire la miscela risultante in un filtro di kDa 15 mL 10 e riempire il tubo verso l'alto con acqua di grado di biologia molecolare per rendere la diluizione totale 15 mL.
  5. Purificare i DiI etichettati soluzione PNC (DiI-PNC) da DMSO e qualsiasi possibile libero DiI tintura da una centrifugazione di benchtop con il filtro di kDa 15 mL 10 a 3.900 x g per 5 min.
    1. Ripetere passo 3.5 almeno cinque volte.
  6. Filtrare le soluzioni DiI-PNC finale attraverso una siringa filtro dimensione di poro 20 nm.
  7. Misurare l'assorbanza di finale DiI-PNC mediante spettrofotometria UV-VIS e calcolare la sua concentrazione secondo la legge di Lambert-Beer (Figura 2). Per ulteriori informazioni, vedere passaggio 2.13.
  8. Conservare in frigorifero a 4 ° C per un ulteriore uso.

4. infiltrazione di pianta lascia con PNC

  1. Aggiungere 0,1 mL di infiltrazione (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl) del buffer in 0,9 mL di soluzione PNC o DiI-PNC di 0,5 mM e vortice si. Utilizzare una soluzione di tampone 10 mM TES infiltrazione come controllo negativo.
  2. Trasferire 0,2 mL di soluzione di infiltrazione PNC o DiI-PNC a una siringa senza ago sterile da 1 mL. Toccare per rimuovere eventuali bolle d'aria possibile.
  3. Recuperare la pianta dalla camera di crescita poco prima di infiltrazione con nanoparticelle per evitare possibili stomi chiusura in condizioni di luce di camera.
  4. Prima di infiltrazione, è possibile misurare il contenuto di clorofilla da foglie di a. thaliana con dimensioni simili utilizzando un misuratore di clorofilla. Misurare ogni foglia con tre repliche (ogni replica che consiste di almeno tre misurazioni)14. Scegliere che fogli di a. thaliana con simile contenuto di clorofilla per l'esperimento di infiltrazione.
  5. Si infiltrano le foglie lentamente con la soluzione preparata di PNC o DiI-PNC premendo delicatamente la punta della siringa senza ago contro il fondo della lamina foglia (abbagliai lato) e premere il pistone (Figura 3A).
  6. Delicatamente pulire fuori la soluzione in eccesso che rimane sulla superficie della lamina foglia (Figura 3B) utilizzando un pulitore delicato compito (Figura 3C) e l'etichetta della pianta. Utilizzare nuovo delicato compito salviette per ogni gruppo di foglie.
  7. Tenere l' infiltrato a. thaliana piante in panchina per l'adattamento di foglia e incubazione con PNC o DiI-PNC per 3 h.
    Nota: Infiltrati a. thaliana piante sono quindi pronti per un ulteriore uso (Figura 3D).

5. preparazione dei campioni di foglia per microscopia confocale

  1. Rotolo è un pisello di dimensioni quantità di osservazione del gel per circa un raggio di 1 cm (Figura 4A) e poi stenderlo fino a 1 mm sottile su un vetrino (Figura 4B).
  2. Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,3 cm) per tagliare una sezione circolare al centro del gel osservazione su vetrino (Figura 4C).
  3. Riempire il taglio ben interamente con perfluorodecalina (PFD) per la risoluzione di imaging più profonda e meglio confocale nei tessuti fogliari.
  4. Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dall'adattato DiI-PNC infiltrato a. thaliana pianteD(Figura 4).
  5. Montare il disco di foglia in PFD riempito bene; affrontare l'infiltrato (abbagliai) lato della foglia.
  6. Mettere un coprioggetto quadrato sopra il disco di foglia e premere delicatamente il vetrino coprioggetti diapositiva in modo uniforme a sigillare con il pozzo del gel di osservazione e garantire che bolle d'aria non rimangano intrappolati (Figura 4E).

6. imaging DiI-PNC nei tessuti fogliari di microscopia confocale

  1. Utilizzare un obiettivo obiettivo 40 X in un laser invertito microscopio confocale a scansione.
  2. Goccia di due a tre gocce di ddH2O nella parte superiore della lente dell'obiettivo X 40.
  3. Posizionare il vetrino preparato di DiI-PNC infiltrato foglia campione in cima l'invertito 40x lente obiettiva.
    1. Assicurarsi che il lato del vetrino coprioggetto ma non il vetro in contatto direttamente con il ddH2O di scivolare sulla lente.
  4. Trovare un'area di interesse nel campione al microscopio con luce laser o campo luminoso.
  5. Avviare il software di microscopio e accendere il laser di Argon (fissato al 20%).
  6. Impostare il foro stenopeico per raccogliere una fetta ottico a meno di 2 µm e una media di linea di 4.
  7. Immagine per il campione con le impostazioni al microscopio confocale: eccitazione di 514 nm laser (30%); Spessore della sezione Z-Stack: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (per l'imaging di DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (per l'imaging del cloroplasto).
  8. Prendere immagini confocal rappresentativi di campioni di foglia da individui differenti, un minimo di tre replicati biologici.

7. imaging PNC in vivo ROS Scavenging mediante microscopia confocale

  1. Preparare 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, un colorante per indicare un generale ROS) e 10 µM diidroetidio (DHE, un colorante per indicare l'anione superossido) coloranti nel buffer di infiltrazione di TES (pH 7,5) in provette microcentrifuga da 1,5 mL, separatamente.
  2. Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dal PNC adattato infiltrato piante di a. thaliana .
    1. Utilizzare la punta tagliente delle pinze per fare tre o quattro fori sui dischi foglia per accelerare il processo di caricamento di tintura.
  3. Trasferimento la foglia dischi per microcentrifuga con H2DCFDA e DHE separatamente ed incubare per 30 min sotto buio.
  4. Dopo l'incubazione, sciacquare la foglia dischi con ddH2O tre volte e Monte nel bicchiere scivolare con osservazione gel (Vedi protocollo sezione 5).
  5. Mettere il vetrino sul microscopio confocale e mettere a fuoco manualmente a un'area di celle mesofillo foglia. Per dettagli, vedere la sezione protocollo 6.
  6. Esporre i dischi di foglia per i raggi UV-A (405 nm) laser per 3 min generare ROS e registrare il cambiamento di intensità del segnale ROS in serie temporali ("xyt") per disco foglia.
  7. Il disco di foglia con impostazioni di microscopio confocale immagine: 40 X acqua obiettivo; eccitazione di laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (per DHE e DCFDA tintura rilevamento); PMT2: 700-800 nm (per il rilevamento di cloroplasti). Utilizzare un impianto infiltrato con solo soluzione tampone di infiltrazione come controllo negativo.

8. PNC Scavenging di H2O2in vitro

  1. Condurre le attività mimetica CAT (catalasi) sintetizzato PNC in vitro di seguendo i metodi in precedenti pubblicazioni3,8,15
  2. Aggiungere 45,4 µ l di 1 x TES infiltrazione tampone (10 mM TES, 10mm MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) in un pozzo (piastra di fondo tondo bianco 96 bene) e mescolare delicatamente pipettando.
  3. Aggiungere 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine (lavoro concentrazione 100 µM, 0,5 µ l) e perossidasi di rafano (HRP; concentrazione di lavoro 0.2 U/mL, 0,1 µ l) nel pozzo, delicatamente mescolare pipettando e incubare per 30 min. 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagisce con H2O2 e viene convertito in Resorufina in presenza di HRP.
    1. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce durante l'incubazione.
    2. Preparare un controllo negativo con tampone di reazione o acqua per sostituire H2O2.
    3. Fatta eccezione per la soluzione di riserva, preparare tutte le altre soluzioni a temperatura ambiente.
  4. Dopo l'incubazione, con un lettore di piastra, monitorare l'assorbanza a 560 nm a utilizzare Resorufina per indicare il livello di H2O2. Regime di tempo impostato a 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.

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Risultati

Caratterizzazione e sintesi PNC .
PNC sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati seguendo il metodo descritto nel protocollo sezione 2. Figura 1 A Mostra la colorazione delle soluzioni di nitrato di cerio, PAA, la miscela di nitrato di cerio e PAA e PNC. Un cambiamento di colore da bianco a giallo chiaro è visto dopo PNC è sintetizzato. Dopo la purificazione con un filtro 10 kDa, PNC son...

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Discussione

In questo protocollo, descriviamo PNC sintesi, caratterizzazione, colorante fluorescente etichettatura e la formazione immagine confocal delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo di pianta per esibire la loro attività lavaggio in vivo ROS. PNC sono sintetizzati da una miscela di nitrato di cerio e PAA soluzione in idrossido di ammonio. PNC sono caratterizzati da spectrophotomery di assorbimento e la concentrazione determinata usando la legge di Lambert-Beer. Misure di potenziale Zeta ha confer...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla University of California, Riverside e USDA National Institute of Food e agricoltura, progetto portello 1009710 a J.P.G. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant n. 1817363 per J.P.G.

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Materiali

Acqua di grado di biologia molecolare
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sigma-Aldrich238538-100Gnitrato di cerio (III
), CorningVWR45001-044 
Falcon 50 mL Provette Centrifughe ConicheVWR14-959-49A
Poly (acido acrilico) 1.800 MwSigma-Aldrich323667-100G
Fisherbrand Miscelatore Vortex DigitaleFisher Scientific02-215-370
Fisherbrand Miscelatore Vortex Digitale Accessorio, FermoInserto Fisher Scientific02-215-391
Fisherbrand Miscelatore digitale a vortice Accessori: Set di inserti in schiumaFisher Scientific02-215-395
Soluzione di idrossido di ammonioSigma-Aldrich05002-1L
PYREX Bicchieri di grifone, graduati, CorningVWR13912-149 
RCT basicIKA3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424VWR80094-126
Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifugheMillipore-SigmaUFC901024
Allegra serie X-30 Centrifuga da bancoBeckman CoulterB06314
UV-2600 SptecrofotometroShimadzuUV-2600 120V
Filtro per siringa Whatman Anotop 10Siringhe monouso Sigma-AldrichWHA68091102
BD con punte Luer-LokFisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina percloratoSigma-Aldrich42364-100MG
Dimetilsolfossido, ACSVWRBDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 GreenIsland Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES, >99% (titolazioneSigma-AldrichT1375-100G
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266-1KG
Air-Tite Siringa Norm-Ject interamente in plasticaFisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per compiti delicatiFisher Scientific06-666A
Carolina Observation GelCarolina132700
Vetrini per microscopio Corning, smerigliati su un lato, un'estremitàSigma-AldrichCLS294875X25-72EA
Cork Borer Set con maniciFisher ScientificS50166A
PerfluorodecalinaSigma-AldrichP9900-25G
Micro Cover Glasses, quadrato, n. 1VWR48366-045
Leica Microscopio confocale a scansione laser TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2′,7′-diclorofluorescina diacetatoSigma-AldrichD6883-250MG
DiidroetidioSigma-AldrichD7008-10MG
Fisherbrand Provette per microcentrifuga premium: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Cuvette Eppendorf UvetteSigma-AldrichZ605050-80EA
Misuratore di clorofilla Konica MinoltaSPAD-502

Riferimenti

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