Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) dei ROS (specie reattive dell'ossigeno) lo scavenging in vivo, nanoceria imaging nei tessuti vegetali e microscopia confocale in vivo monitoraggio di nanoceria ROS scavenging mediante microscopia confocale.
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Articolo metodologico
Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'accumulo di ossigeno reattivo specie (ROS) è un marchio di garanzia di risposta piante a stress abiotici. ROS giocano un duplice ruolo nelle piante agendo come molecole a bassi livelli di segnalazione e molecole ad alti livelli dannosi. Accumulo di ROS in piante stressati può danneggiare metaboliti, enzimi, lipidi e DNA, causando una riduzione della crescita delle piante e la resa. La capacità di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) di pulire cataliticamente ROS in vivo fornisce un unico strumento per comprendere e bioingegnere pianta stress abiotici tolleranza. Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare e caratterizzare poli (acrilico) acido nanoceria rivestito (PNC), le nanoparticelle con piante tramite infiltrazione della lamina foglia di interfaccia e monitorare la loro distribuzione e ROS lo scavenging in vivo mediante confocale microscopia. Corrente strumenti molecolari per la manipolazione di accumulo di ROS nelle piante sono limitati a specie modello e richiedono metodi di trasformazione laboriosa. Questo protocollo per in vivo lo scavenging ROS ha il potenziale per essere applicato a tipo selvaggio piante con foglie larghe e struttura foglia come Arabidopsis thaliana.
Introduzione
Nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) sono ampiamente usate negli organismi viventi, dalla ricerca di base alla bioingegneria, dovuto la loro specie distinte catalitica reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging capacità1,2,3. Nanoceria avere ROS scavenging capacità a causa di un gran numero di posti vacanti di superficie ossigeno che si alternano tra due ossidazione stati (Ce3 + e Ce4 +) 4,5,6. I legami pendenti Ce3 + puliscono efficacemente ....
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Protocollo
1. coltivazione di piante di a. thaliana
- Seminare i semi di a. thaliana in vasi monouso 5 cm x 5 cm, riempito con miscela di suolo standard. Mettere 32 di questi vasi in un vassoio di plastica riempito con acqua (~ 0,5 cm di profondità) e trasferire il vassoio di plastica con le piante in una camera di crescita della pianta.
- Impostare la crescita camera impostazioni come segue: 200 µmol/ms radiazione fotosintetica attiva (PAR), 24 ± 1 ° C giorno e notte di ± 1 ° C 21, 60% di umidità e regime di luce giorno/notte 14/10 h, rispettivamente.
- Sottile ogni pentola per lasciare solo un singolo impianto dopo una setti....
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Risultati
Caratterizzazione e sintesi PNC .
PNC sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati seguendo il metodo descritto nel protocollo sezione 2. Figura 1 A Mostra la colorazione delle soluzioni di nitrato di cerio, PAA, la miscela di nitrato di cerio e PAA e PNC. Un cambiamento di colore da bianco a giallo chiaro è visto dopo PNC è sintetizzato. Dopo la purificazione con un filtro 10 kDa, PNC son.......
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Discussione
In questo protocollo, descriviamo PNC sintesi, caratterizzazione, colorante fluorescente etichettatura e la formazione immagine confocal delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo di pianta per esibire la loro attività lavaggio in vivo ROS. PNC sono sintetizzati da una miscela di nitrato di cerio e PAA soluzione in idrossido di ammonio. PNC sono caratterizzati da spectrophotomery di assorbimento e la concentrazione determinata usando la legge di Lambert-Beer. Misure di potenziale Zeta ha confer.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla University of California, Riverside e USDA National Institute of Food e agricoltura, progetto portello 1009710 a J.P.G. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant n. 1817363 per J.P.G.
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Materiali
Acqua di grado di biologia molecolare
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | 238538-100G | nitrato di cerio (III | |
| ), Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Provette Centrifughe Coniche | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acido acrilico) 1.800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Miscelatore Vortex Digitale | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Miscelatore Vortex Digitale Accessorio, Fermo | Inserto Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Miscelatore digitale a vortice Accessori: Set di inserti in schiuma | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Soluzione di idrossido di ammonio | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Bicchieri di grifone, graduati, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifughe | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra serie X-30 Centrifuga da banco | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrofotometro | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Filtro per siringa Whatman Anotop 10 | Siringhe monouso Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD con punte Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimetilsolfossido, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 Green | Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titolazione | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite Siringa Norm-Ject interamente in plastica | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per compiti delicati | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Vetrini per microscopio Corning, smerigliati su un lato, un'estremità | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Set con manici | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalina | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, quadrato, n. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Microscopio confocale a scansione laser TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-diclorofluorescina diacetato | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Diidroetidio | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Provette per microcentrifuga premium: 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cuvette Eppendorf Uvette | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Misuratore di clorofilla | Konica Minolta | SPAD-502 |
Riferimenti
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15(2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S.
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Ristampe e permessi
