Articolo metodologico

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

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DOI:

10.3791/58379

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2 ottobre 2018

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1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Abstract

Iperandrogenismo svolge un ruolo critico nella funzione riproduttiva e metabolica nelle femmine ed è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico. Lo sviluppo di un modello di topo PCOS-come magro che imita le donne con PCOS è clinicamente significativo. In questo protocollo, descriviamo un tale modello. Con l'inserimento di una lunghezza di 4 mm di pellet di polvere DHT (diidrotestosterone) cristallo (lunghezza totale di pellet è di 8 mm), e sostituirlo ogni mese, siamo in grado di produrre un modello del mouse di PCOS-come con piega di 2 livelli DHT siero superiore rispetto ai topi non impiantati con DHT (no-DHT). Abbiamo osservato la disfunzione metabolica e riproduttiva senza modificare il peso corporeo e la composizione corporea. Mentre che esibiscono un alto grado di sterilità, un piccolo sottoinsieme di questi topi femminili PCOS-come può rimanere incinto e la loro prole pubertà ritardata e testosterone aumentato di adulti. Questo modello di mouse magra PCOS-come è uno strumento utile per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Introduzione

Iperandrogenismo è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) secondo criteri NIH e dell'eccesso dell'androgeno e della società PCOS (AE-PCOS). Le donne con PCOS hanno difficoltà a rimanere incinta e hanno un aumentato rischio di complicazioni di gravidanza1. Anche se sono incinta, loro prole femminile hanno un2,di esiti negativi per la salute3. Modelli animali sono stati sviluppati utilizzando varie strategie4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e che esibiscono molte caratteristiche di PCOS (anovulazione, e o alterata tolleranza al glucosio e insulina) con aumento del peso corporeo e l'obesità associata con ingrossamento degli adipociti dimensioni e il peso maggiore del adipocyte. Esistono due strategie principali per produrre modelli animali che vengono utilizzati per studiare la PCOS. Uno è il trattamento con alti livelli di androgeni direttamente (androgeni esogeni iniezione/inserimento) o indirettamente (ad esempio bloccando la conversione di androgeni in estrogeni con inibitore dell'aromatasi) dopo nascita13. Un altro è di hyperexposure fetale di androgeni durante gestazione14,15 per studiare la prole. Ad esempio, prole femminile da scimmia rhesus16,17, pecore18e roditori esposti a maschi livelli di androgeni durante il periodo intrauterino sviluppare tratti di PCOS-come più tardi nella vita. Questi modelli significativamente migliorato la nostra comprensione degli effetti androgeni e programmazione fetale e uterini effetti ambientali. Tuttavia, questi modelli hanno i loro limiti: 1) gli animali sviluppano obesità e pertanto risulta difficile separare gli effetti di iperandrogenismo da obesità indotta riproduttivo e disfunzione metabolica; 2) prima della gravidanza, le donne con PCOS presentano già alti livelli di androgeni, così gli ovociti sono stati esposti agli androgeni in eccesso prima della fecondazione; 3) le dosi farmacologiche di testosterone (T) o diidrotestosterone (DHT) utilizzato dopo la nascita o durante la gestazione potrebbero non riflettere l'ambiente dell'androgeno di PCOS. Livelli di testosterone e DHT sono stati misurati nel fluido follicolare ovarico e/o del siero, e testosterone ed i livelli di DHT sono 1.5 a 3,9 volte superiore nelle donne con PCOS5,19,20,21 ,22,23 rispetto alle donne inalterate. Abbiamo creato un topo adulto modello23,24,25 che si sviluppa la disfunzione metabolica e riproduttiva entro due settimane dall'inizio dell'esposizione cronica di DHT dall'inserimento di una pallina con lunghezza di 4 mm polvere di cristallo DHT (lunghezza totale di pellet è di 8mm). Questo modello produce livelli DHT del siero che sono circa 2 volte superiore (denominato 2xDHT) di quella dei topi di controllo senza trattamento DHT. I topi di 2xDHT non presentano alterazioni di basale del siero, testosterone, LH e non sviluppare l'obesità e mostrare peso ovarico simile, i livelli sierici di colesterolo, acidi grassi liberi, leptina, TNFα e IL-623,24, 25 relativi a controlli anche fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24,25. Inoltre, con l'accoppiamento le femmine che hanno già sviluppato caratteristiche di PCOS, possiamo studiare l'impatto di un ambiente materno iperandrogenica sulla salute metabolica e riproduttiva della prole15.

Questo nuovo paradigma (pertinente ai criteri NIH e società AE-PCOS) modella la malattia producendo relativamente simili livelli di androgeni a quelli delle donne con PCOS 2 - 3 volte più alto testosterone o i livelli di DHT rispetto alle donne inalterate. Tuttavia, questo modello è garantito dal continuo DHT esogeno e non da iperandrogenismo endogeno programmato una volta DHT è ritirato. L'obiettivo generale di questo articolo è di concentrarsi su 1) come fare il pellet DHT; 2) come generare un lean-PCOS come modello murino; 3) strategie per valutare la prole femminile da queste dighe. Altre misure e la valutazione di fenotipi non vengono affrontati in questo manoscritto, ma possono essere trovati in5,15,23,24,25,26.

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Protocollo

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per inserimento e DHT pellet preparazione e per test riproduttivi e metabolici. I topi utilizzati in questo studio erano un fondo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e sono stati mantenuti con cibo e acqua ad libitum in un ciclo luce/buio 14/10 h a 24 ° C nella struttura animale Broadway Research Building presso la Johns Hopkins University School of Medicina. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di Johns Hopkins University.

1. creare il modello del topo PCOS-come

  1. Preparazione di pellet DHT
    1. Tubi di silastic autoclave per sterilizzare. Tagliare tubi di silastic per una lunghezza di 15 mm con una lama di rasoio;
    2. Sigillare un lato con l'iniezione di silicone adesivo medico nel tubo con un ago smussato 20 G collegato ad una siringa da 3 mL. Stantuffo dovrebbe essere ritirato dalla siringa e poi adesivo inserito nel serbatoio. Lo stantuffo viene reinserito e adesivo spinto verso il basso fino a quando non comincia ad emergere dall'ago. L'ago blunted fatta dal lato punta tagliente dell'ago 20 G di taglio con le forbici forte. La lunghezza del silicio nel tubo dovrebbe essere più di 2 mm consentono un taglio di post-produzione;
    3. Asciugare durante la notte; Verifica per le bolle d'aria sul lato sigillato. Quelli senza bolle d'aria sono usati per pellet di DHT. Gli altri può essere utilizzati per il no-DHT controllo pellet.
    4. Indossare guanti, maschera, occhiali e camice da laboratorio prima di effettuare il DHT-pellet in un cappuccio per evitare l'esposizione DHT per la pelle.
    5. Polvere DHT di versare in una plastica pesare barca e premere il lato aperto dell'adesivo ricoperto di tubi (prodotte in a 1.1) alla polvere di DHT.
    6. Polvere DHT possa essere pestata con una graffetta che viene raddrizzata.  Proseguire fino a DHT raggiunge un'altezza di 4 mm (o la lunghezza desiderata). Controllare la lunghezza di DHT con un righello e sigillare il lato aperto con silicio, asciutto durante la notte.
    7. Tagliare ogni lato sigillato per rendere la lunghezza di silicio 2 mm di lunghezza. La lunghezza totale del pellet sarà 8 mm.
    8. Guarnizione di entrambi i lati del tubo di silastic vuota come pellet di controllo (n-DHT).
    9. Mantenere il pellet in una provetta conica 50 mL avvolta con foglio (per evitare l'esposizione alla luce) a temperatura ambiente fino all'utilizzo. I pellet DHT mantengono piena efficacia per almeno 3 mesi di deposito.
  2. Sostituzione e inserimento di DHT
    1. Fino a 20 DHT pellet o pellet di controllo sono sommerse separatamente in una provetta conica da 50 mL con 30 mL di soluzione sterile salina 0,9% per 24 h a 37 °C di equilibramento appena prima dell'inserimento.
    2. Prima dell'intervento, le superfici e i guanti vengono disinfettati con clidox e le superfici di lavoro sono coperti con carta assorbente sostenuto plastica pulito (tampone chirurgico).  Tutti gli strumenti che vengono a contatto con animali sono decontaminati prima di entrare la struttura animale in autoclave.  Gli strumenti potranno asciutto e fresco prima dell'uso.
    3. 2-mese-vecchi topi femminili sono utilizzati (4 – 5 topi/gabbia). I topi sono iniettati intraperitonealmente con xilazina (3,5 mg/kg bw) e ketamina (78,8 mg/kg bw) utilizzando una siringa da insulina. Calcoli per miscelazione e dosaggio di anestesia è nella tabella 1.
    4. Dopo un'anestesia adeguata è raggiunto, come misurato dalla perdita del riflesso di punta e rallentato la respirazione, il mouse sarà essere preparato per la chirurgia.
    5. Disinfettare la pelle della zona con betadine con garza sterile e pulire con etanolo al 70%.  L'area sarà ancora dipinto con betadine.
    6. Tagliare un foro di circa 5 mm lunghezza con forbici sotto la pelle vicino al collo. Utilizzando un trochar 10 G, fare un piccolo tunnel (15 mm) in direzione rostrale. Il pellet viene inserito dorsalmente con il trochar.
    7. L'apertura viene quindi sigillato con adesivo chirurgico. Manualmente approssimativo la ferita bordi con forcipe e tratti delicate spazzolatura per applicare un sottile strato di adesivo liquido per i bordi della ferita approssimata. Strati sottili di accumulo 3 di adesivo per garantire che l'adesivo è distribuito uniformemente sopra la ferita. L'adesivo deve estendersi di 1 cm su ogni lato dei bordi della ferita apposed. Sutura o clip chirurgiche utilizzabile anche per chiudere il foro. Rimettere topi in gabbia, alloggiato individualmente, con una piastra di calore per il recupero. Sostituire il pellet ogni 4 settimane per mantenere costante il livello di esposizione dell'androgeno. Il pellet originale verrà rimosso e verrà inserito nuovo pellet come descritto in A1.15 in posizione simile.
    8. Prova ciclicità estro dopo 3 giorni di inserimento di DHT. Fase del ciclo estrale è valutata tramite citologia vaginale.  Le cellule vaginali sono raccolti per 16 giorni consecutivi utilizzando una pipetta p10 a schizzare (circa 10 µ l) di soluzione salina sterile nella cavità vaginale e poi ritirare la soluzione fisiologica con la stessa pipetta sterile.  Le cellule vaginali sloughed da parete vaginale mescolano con soluzione fisiologica e sono raccolte.
    9. Diffondere la soluzione fisiologica con cellule su un vetrino con etichetta. Ogni diapositiva può contenere sei campioni. Diapositive sono etichettati per notare quale campione viene messo in ognuna delle sei location.
    10. Dopo la soluzione salina è completamente asciugato sulla diapositiva, mettere le diapositive in un contenitore con etanolo al 100% per fissare le cellule. Diapositive è opportuno fissare per almeno 5 min, ma possono rimanere in fissativo indefinitamente fino al successivo utilizzo.
    11. Inserire diapositive in colorazione soluzioni per 1 minuto ogni buffer B e diapositive C. Wash con acqua di rubinetto e asciugare a temperatura ambiente.
    12. Esaminare la morfologia delle cellule sotto un microscopio chiaro obiettivo di 10 X.  Morfologia delle cellule per distinguere proestro (P), estro (E), Metaestro (M) e diestro (D) è descritto in riferimenti27,28,29.
    13. Conteggio i giorni in ogni fase e dividono per il numero totale di giorni per calcolare la percentuale di tempo in ogni fase.
    14. Test tolleranza al glucosio in 21 giorni dopo l'inserimento di DHT di digiuno durante la notte i topi (16h) e iniettare 2 g/kg di peso corporeo di destrosio 20% intraperitonealmente. Ad esempio, se un peso corporeo di mouse è di 25 g, questo mouse sarà iniettato con 250 µ l di destrosio 20% con una siringa da insulina 50 cc (0,5 mL). I livelli del glucosio sono valutati da strisce glucometer e test mediante un campione di sangue dalla vena di coda a 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Questo è descritto dettagliatamente altrove30.
  3. Raccolta del sangue
    1. Raccogliere il sangue ai vari giorni dopo l'inserimento di DHT (limitiamo il volume di raccolta da 100 µ l per steroidi e 30ul per dosaggio di LH/FSH) tra il 9 e 10 dalla vena sottomandibolare sanguinamento con la lancetta. Questo è descritto in11.
    2. Centrifugare il sangue a 6.000 x g a 4 ˚C per 10 min e raccogliere il livello del siero in un'altra provetta da 1,5 mL che possa essere conservata a-80 °C fino al dosaggio.

2. valutare riproduttiva profili della prole femminile da cronicamente DHT inserito dighe

  1. Accoppiamento
    1. Nella gabbia con un maschio fertile provata (che in precedenza ha avuto cuccioli con un topo femmina) viene spostato il mouse femminile da sottoporre alle 15 giorni dopo l'inserzione della pallina.
    2. Documento di peso corporeo di diga ogni settimana per determinare se il mouse è incinto. Diga aumenti di peso di oltre 3 g in una settimana indica gravidanza.
    3. Raccogliere il sangue delle dighe, la seconda settimana dopo osserviamo il peso corporeo aumentato delle dighe superiori a 3 g dalla settimana prima.
  2. Pubertà valutata dall'apertura vaginale e primo estro
    1. Verifica apertura vaginale mediante ispezione visiva ogni giorno dopo i cuccioli sono svezzati a 21 giorno postnatale (PND), misurare la distanza anogenital e registrare l'età dell'apertura vaginale.
    2. Una volta che si apre la vagina, raccogliere le cellule vaginali al giorno, come descritto in 1.2.8–1.2.11 per verificare ciclicità estro.
    3. Osservare la morfologia delle cellule come descritto 1.2.12, e il primo estro è definita come la data che tutte le cellule sono cellule epiteliali cornificate.
  3. Pugno dell'orecchio e del peso del corpo
    1. Immergere la lancetta punta nella pasta tatuaggio e contrassegnare ogni cucciolo con il tatuaggio sulla punta, come descritto nel riferimento12 alle 7 PND e pesare topi ogni 7 giorni fino a 70 giorni di età.
    2. Topi di pugno di orecchio di numerarli utilizzando il sistema in Figura 1 tra 12 e 16 PND. Per distinguere il sesso, esaminare il lato ventrale del corpo, le femmine avranno capezzoli visibili.
    3. Raccogliere il sangue alle 21, 26, 70 PND dopo la nascita come descritto sopra in 1.3.1
  4. Analisi ormonale
    1. I livelli di DHT in siero di anima sono misurati da entrambi analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e di cromatografia liquida tandem mass spettrometria (LC-MS)23,24,31,32. T è misurata da LC-MS, o un ratto/topo ELISA che è stato convalidato dal Università di Virginia Ligand Assay nucleo nel centro di ricerca in riproduzione23,24.

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Risultati

Livelli sierici di DHT e test di tolleranza al glucosio

I livelli di DHT sono stati misurati dal siero raccolto da entrambi ELISA e mediante LC-MS secondo protocollo 1,24-1,25 e 2.9, 3.0. I valori assoluti DHT sono diversi tra spettrometria di massa ed ELISA, tuttavia, la relativa piega (circa 2 volte) di DHT vs no-DHT inserimento è simile in entrambe le analisi e attraverso esperimenti15,

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Discussione

Iperandrogenismo è una caratteristica fondamentale di PCOS. I livelli del siero DHT (due volte più alto nei topi DHT che nei topi no-DHT) utilizzati in questo protocollo sono inferiori a quelli riportati da altri ricercatori in studi precedenti e sono calibrati per imitare proporzionalmente le donne con PCOS5,19, 20,21. A differenza di altri modelli, questo modello DHT 2 volte non altera il pe...

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Dichiarazioni

Nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (sovvenzioni R00-HD068130 a S.W.) e il centro di ricerca del diabete di Baltimora: piloti e fattibilità Grant (a S.W.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polvere cristallina 5&alfa;-DHTSigma-AldrichA8380-1G
Dow Corning Tubi SilasticFisher Scientific11-189-15D0,04 pollici / 1 mm diametro interno x0,085 pollici / 2,15 mm diametro esterno
Silicone adesivo medicoFattore II, InC.A-100
Occhiali, camici da laboratorio, guanti e maschere.
10 µ L puntali per pipette senza filtroUSA Scientific11113700
Vetrino per striscioFisher Scientific12-550-003
Diff Quik per colorazione di celluleFisher ScientificNC9979740
LancetFisher ScientificNC9416572
3 mL SyringBecton, Dickinson and Company (BD),30985
ago attaccato: 20 GBD305176
Righello: qualsiasi lunghezza superiore a 10 cm con scala millimetrica.
XilazinaVet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
Ketamina cloridratoHospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
Graffe chirurgicheAutoClip® Sistema, Fine Science Tool12020-00
Siringa da insulinaBD3294611/2 CC, siringa da insulina U-100 a basso dosaggio
TrocarInnovative Research of AmericaMP-182
MicroscopioCarl Zeiss Primo Star415500-0010-001Germania
Punzone per l'orecchioFisher Scientific13-812-201
Testosterone ELISA per ratto/topo kitIBLB79174
Kit ELISA DHTAlpha Diagnostic International1940
Ultra glucometro One touchLife Scan, Inc.
Strisce di prova ultra con un solo toccoLife Scan, Inc.
Eppendorf tuboFisher Scientific05-402-18
Lama di rasoioFisher Scientific12-640
ClidoxFisher ScientificNC0089321
sottopiede chirurgicoFisher Scientific 50587953Produttore: Andwin Scientific 56616018
Betadine Soluzione antisetticaWalgreens
3M Vetbond (n-butil cianoacrilato)3M Scienza. Applicato alla vita

Riferimenti

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