Le espressioni facciali sono una modalità di comunicazione visiva prodotta dai muscoli mimetici. Qui, presentiamo i protocolli per le nuove tecniche della dissezione inversa e DiceCT completamente visualizzare e valutare i muscoli mimetici. Queste tecniche combinate possono esaminare aspetti sia morfologici e fisiologici della muscolatura mimetico per determinare gli aspetti funzionali.
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Articolo metodologico
Invertire la dissezione e dati DiceCT Reveal altrimenti nascosti nell'evoluzione del Primate viso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le espressioni facciali, o schermi facciali, di intenti sociali o impressionabili sono prodotte da molti taxa mammiferi come mezzo per comunicare visivamente con i conspecifici a una distanza ravvicinata. Questi display sono raggiunti dalla contrazione dei muscoli mimetici, che sono attaccato al derma del viso del muscolo scheletrico. Invertire la dissezione, rimuovendo la maschera pieno facciale dal cranio e avvicinando i muscoli mimetici in senso inverso, è un efficace ma distruttivo modo di rivelare la morfologia dei muscoli mimetici, ma esso è distruttivo. DiceCT è un nuovo meccanismo per visualizzare i muscoli scheletrici, compresi muscoli mimetici e isolando i fasci muscolari individuali per misurazione quantitativa. DiceCT fornisce inoltre un meccanismo non-distruttivo per la visualizzazione di muscoli. Tecniche combinate di dissezione inversa e DiceCT possono essere utilizzate per valutare la morfologia evolutiva della muscolatura mimetica così come potenziale forza di contrazione e velocità in questi muscoli. Questo studio ulteriore dimostra che DiceCT può essere utilizzato per esattamente ed attendibilmente visualizzare mimetici muscoli così come invertire la dissezione e fornire un metodo non distruttivo per il campionamento muscoli mimetici.
Introduzione
Mimetico muscolatura, o muscolatura di espressione facciale, è muscolo scheletrico ed è trovato in tutto Mammalia1. Mentre più mammifero muscolo scheletrico attribuisce ai punti di riferimento ossute discreti, muscolatura mimetico è unico nella relativi allegati principalmente nella pelle del viso, cuoio capelluto e la funzione ventrale del collo1,2,3, 4. Contrazione della muscolatura mimetica si deforma la "maschera facciale" in espressioni o facciale Mostra d'intenti sociali ed emotivo, cambia la dimensione e la forma degli sfinteri dell'occhio, cavità nasale e cavità orale utilizzato in alimentazione, respirazione e vocalizzazioni, ed è parte del meccanismo di comunicazione visiva nel complesso accostamento trovato tra la maggior parte mammiferi2,3,4,5. Attraverso Mammalia, gli schermi facciali generati dai muscoli mimetici assistono nella regolazione e mantenimento di confini territoriali, legami sociali e il gruppo sociale inserente conspecifici sulle intenzioni del mittente2, emotive e comportamentale 5.
Tra i mammiferi, primati sono caratterizzati in parte quanto impiegano un alto livello di comportamento sociale in tutto il ciclo di vita con tutte le specie viventi in un gruppo sociale2,5. Mentre alcuni taxa, come i galagoni nocturnal e Lori, possono vivere in gruppi costituiti solo da una madre e prole, altri taxa, come i macachi diurni e babbuini, possono vivere in gruppi di oltre 100 persone6. Non importa la dimensione del gruppo sociale, primati utilizzano spesso i comportamenti stereotipati sociali associati al grado e territorialità e questi comportamenti includono in genere un componente di visualizzazione del viso. Display del viso sono parte del processo di mantenere legami tra membri di gruppi sociali, gerarchie di dominanza, riproduzione e la comunicazione che fa parte della vita quotidiana, soprattutto nelle specie diurne2,5,7 . Mentre è stato chiaro per qualche tempo quello muscolatura facciale viene utilizzato per creare questi schermi facciali, solo recentemente è diventato apparente che la fisiologia e la muscolatura facciale forma sono associati con le esigenze funzionali di variabili sociali2, 8. Precedenti studi su filogeneticamente e comportamentale diverse gamme di primati hanno dimostrato che specie diurne vivono in grande, gruppi sociali complessi tendono ad avere un elevato numero di schermi facciali discreti che si concentrano il movimento delle labbra, sopracciglia, palpebre e con un elevato numero di muscoli facciali raggruppati attorno alle labbra e la regione orbitale9. Al contrario, ci sono stati pochi studi sulla specie notturne che vivono in piccoli gruppi, ma queste specie hanno un elevato numero di muscoli facciali discreti con allegati intorno l'orecchio esterno e labbra, che possono essere associate con i movimenti dell'orecchio e labbra (che sono stati documentati in alcune specie notturne negli incontri agonistici con i conspecifici e l'individuazione di suoni)2,9,10,11. Inoltre, gli esseri umani hanno una percentuale relativamente più alta delle fibre di miosina contrazione lenta nella muscolatura mimetica rispetto macaques del reso o gli scimpanzé, che possono essere correlati al "rallentamento" nella contrazione della muscolatura umana mimetico intorno alle labbra usato durante la produzione di suoni vocali o alla capacità di resistenza di affaticamento generale dei muscoli8.
Gli esseri umani sono, senza dubbio, il più sociale di tutti i primati e hanno sviluppato il linguaggio come una componente di comunicazione sociale. Ancora, però, gli esseri umani utilizzano espressione facciale come mezzo di comunicazione visiva e hanno il più grande repertorio di schermo facciale noto tra i primati. Nel tentativo di capire più completamente le variabili che circondano l'evoluzione del comportamento sociale umano e generale dei primati, una maggiore comprensione della morfologia e della fisiologia della muscolatura mimetico primate è altamente desiderabile. Perché muscolatura mimetico è attaccato alla pelle stessa e, in alcune specie, possono eccezionalmente sottile e difficile da visualizzare, abbiamo sviluppato un metodo unico di visualizzare questa muscolatura per entrambi i processi di registrazione lordo presenza/assenza e gli allegati così come campionamento per elaborazione microanatomical.
"Reverse dissezione" è un metodo per preservare la muscolatura mimetica rimuovendo la maschera facciale intera dalla testa e aumentando la visibilità dei muscoli anche piccoli. Perché la dissezione inversa è un processo distruttivo, possono non essere sempre disponibili per questa metodologia esemplari rari e preziosi. DiceCT è un metodo efficace che può visualizzare molti dei muscoli mimetici in specie anche piccolissimi12,13,14. Questo metodo può essere utilizzato in concerto con la dissezione inversa o in casi in cui gli esemplari rari, preziosi non possono essere sezionati e possono fornire molte informazioni senza dover rimuovere la maschera facciale "inversa dissezione"12,13, 14. Il presente protocollo descrive un insieme di metodi per la combinazione inversa dissezione con DiceCT al fine di esaminare la muscolatura mimetico primate.
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Protocollo
Perché queste procedure utilizzano animali che sono morti per cause naturali a giardini zoologici o sono stati sacrificati in laboratori di ricerca dove facevano parte di studi indipendenti, questi protocolli non richiedono omologazioni IACUC.
1. invertire la dissezione
Nota: Il protocollo per dissezione inversa è efficace per molto piccoli mammiferi, come topi di laboratorio, fino a grandi mammiferi, come il cavallo domestico. I muscoli mimetici sono spesso meglio conservati e visualizzati meglio quando lasciato con il derma sovrastante invece di lasciarli il cranio. Vedere la Figura 1-3.
- Disarticulate testa da parte cervicale della colonna vertebrale prima le procedure di dissezione. Se il cadavere è congelato, lasciarlo scongelare completamente prima di procedere con questo passaggio.
- Indipendentemente dallo stato di conservazione, palpare la regione occipitale del cranio e il processo spinous della seconda vertebra cervicale (C2). Si noti che la prima vertebra cervicale (C1) manca un processo spinous, così palpazione C2 e la regione occipitale del cranio vi darà una posizione approssimativa di C1.
- Usando un bisturi, fare tagli orizzontali tra C2 e la regione occipitale del cranio al fine di iniziare a separare il cranio dalla colonna vertebrale al C1. Continuare a fare tagli fino a quando il teschio è disarticolato dalla colonna vertebrale.
- Se il campione è fresco e non fissato, 1.1.2-1.2 passaggi devono essere eseguiti in un lasso di tempo relativamente breve. Inoltre, se il cervello rimane intatto all'interno della cavità cranica, necrosi del tessuto neurale può procedere rapidamente, quindi è altamente raccomandato che il cervello essere rimosso dal cadavere se l'esemplare deve rimanere non fissati.
Nota: Come un passaggio facoltativo, il campione può essere immerso in formalina 10% tamponata per 24 ore al fine di fissare il campione. Questo vi permetterà una procedura di raccolta di dati senza fretta. - Se il provino è già fissato con alcol etilico o tamponata 10% formalina, sciacquare per diverse ore con acqua fresca.
- Fare delle incisioni per rilasciare la maschera da teschio. Se il cervello e sovrastante calvaria sono stati rimossi durante l'autopsia, fare una piccola incisione vicino alla regione glabellar del cranio e un altro lungo la faccia caudale del cranio dove l'osso cranico è intatto.
- Una volta che l'esemplare è stato sciacquato per diverse ore, asciugare tamponando con carta assorbente e trasferimento al lavoro stazione.
- Palpare per la protuberanza occipitale esterna al bordo caudale (o posteriore) del cranio. Questo segna la zona dove il cranio incontra la colonna vertebrale. Usando un bisturi #4 per campioni di grandi dimensioni o con un bisturi #3 per piccoli esemplari, praticare un'incisione di linea mediana iniziando la protuberanza occipitale esterna e venendo rostralmente (o avanti) sopra la regione parietale e frontale del cranio, la regione orbitale e fra gli occhi, giù la regione nasale, tutto il percorso attraverso l'area nasale esterna tra le narici.
- Fare un taglio sulla mandibola fra gli incisivi inferiori, centrale e spostamento caudale (o viceversa) verso la clavicola.
- Scegli un lato della maschera viso per rimuovere e lasciare l'altro lato sul posto.
- Rilasciare un lato della maschera facciale dal cranio.
- A partire della regione occipitale, usare il bisturi per tagliare la maschera facciale, tra cui muscolatura mimetico, dall'osso occipitale del cranio, tirando la maschera rostralmente (o avanti) e lateralmente (a lato). Tagliare il muscolo occipitale dal cranio, lasciando una piccola quantità di muscolo dietro sul cranio, in modo che suo attaccamento possa essere visualizzato ancora una volta la maschera facciale è stato rimosso. Lasciando qualche porzione del muscolo dietro il cranio ossuto/cartilaginosi, allegati possono essere conservati per la registrazione in un secondo momento.
- Una volta che è colpito l'orecchio esterno, individuare i muscoli auricolari. Tagliare attraverso questi modo che una piccola porzione di ogni rimane con il cranio. Tagliare attraverso la cartilagine elastica, allegando l'orecchio esterno al cranio.
- Continuare a tirare la maschera rostralmente e rilasciare ogni muscolo mimetico dal cranio lasciando una piccola porzione di ciascun muscolo dietro il cranio.
- Una volta che c'è una maschera facciale intatta da un lato del cranio, lasciarla sedersi fuori, esposti all'aria, per un'ora (per piccoli campioni come un topo da laboratorio) fino a tre ore (per un esemplare grande come un cavallo domestico), con il lato di muscolatura rivolto verso l'alto. Questo passaggio inaridisce alcuni del tessuto connettivo la maschera viso e aumenta il contrasto di colore tra il muscolo e del tessuto connettivo.
- Rimuovere il tessuto connettivo sufficiente per visualizzare la muscolatura.
- Utilizzando un #3 bisturi, pinze e microforbici, strappare via il tessuto connettivo che separa la muscolatura mimetica uno da altro.
- Per accedere lo strato superficiale della muscolatura mimetico in questa "dissezione inversa", sollevare delicatamente e separare lo strato profondo della muscolatura dello strato superficiale e rimuovere il tessuto connettivo che circonda la muscolatura superficiale. La maschera risultante può essere restituita a formalina, e la procedura può essere messo in pausa qui prima di passare alla ulteriore dissezione o alla colorazione (passaggio 2). A ogni passaggio intermedio in ulteriore dissezione, consentire la maschera facciale asciugare abbastanza così che il tessuto connettivo può essere facilmente individuabile dal tessuto muscolare.
2. processo di colorazione per DiceCT
Nota: I campioni devono essere fissati in formalina 10% tamponata se DiceCT deve essere utilizzato al fine di preservare il tessuto durante la lunga procedura di colorazione. Se l'esemplare non è ancora stato risolto, è possibile inserirlo in un contenitore con abbastanza Formalina 10% tamponata per sommergere tutto il tessuto e lasciare per 48 ore.
- Rendere l'1,75% (m/v) di Lugol (ho2KI) per la macchiatura maschera viso.
Nota: Basta fare2soluzione KI a immergere completamente la maschera all'interno del contenitore scelto. Rendere più o meno soluzione ridimensionando i valori di entrambi i soluti e solvente ugualmente ai punti 2.1.1 e 2.1.2.- Sotto cappa aspirante, aggiungere 3,50 g di ioduro di potassio (KI) per 200 mL di acqua distillata in un becher di vetro di grandi dimensioni. Mescolare con il vetro bacchetta fino a quando completamente sciolto.
Attenzione: ioduro di potassio (KI) può causare degli occhi, della pelle e irritazione delle vie respiratorie o danni. Indossare occhiali protettivi e gestire sotto cappa aspirante. - Lentamente aggiungere 1,75 g di cristalli di iodio (I2), mescolando fino a quando completamente sciolto. Questo richiederà alcuni minuti.
Attenzione: Cristalli di iodio (ho2) può causare degli occhi, della pelle e irritazione delle vie respiratorie o danni. Indossare la protezione degli occhi e della pelle e lavorare sotto cappa aspirante durante la manipolazione di questa sostanza chimica. - Filtro soluzione in flacone di vetro ambrato utilizzando carta da filtro con pori di 11 micron per rimuovere tutti i cristalli non disciolti che potrebbero produrre la macchiatura incoerente.
Attenzione: Questa soluzione è altamente tossica per gli organismi acquatici. Non smaltire la soluzione giù scarico. In caso di fuoriuscita, neutralizzare acquosa Triioduro (ho3–) in ioduro (I–) con 5% (m/v) di tiosolfato di sodio (Na2S2O3). Controllare di conseguenza le norme istituzionali allo smaltimento dei rifiuti di ioduro e smaltire tali rifiuti.
- Sotto cappa aspirante, aggiungere 3,50 g di ioduro di potassio (KI) per 200 mL di acqua distillata in un becher di vetro di grandi dimensioni. Mescolare con il vetro bacchetta fino a quando completamente sciolto.
- Macchia la maschera del viso.
- Posizionare la maschera viso, tagli il lato giù in un vetro ambrato o oscurati contenitore (per tenere fuori luce) abbastanza grande da permettere la maschera per riposare in una forma naturale e di essere completamente sommerso.
- Versare la soluzione di Lugol sopra la maschera viso finché non è completamente sommerso. Un peso è necessario per mantenere la maschera del viso completamente sommersa e impedirne il galleggiante verso l'alto della soluzione. Sigillare il contenitore per evitare l'evaporazione e tenere fuori la luce.
- Agitare il contenitore continuamente su un attuatore elettrico o regolarmente a mano per facilitare anche la macchiatura e impedire la sedimentazione per almeno due settimane di cristalli. Se un tempo più lungo è necessario per macchiare adeguatamente fasci del muscolo, sostituire la soluzione di Lugol con soluzione fresca.
- Dopo due settimane, è necessario rimuovere la maschera dalla soluzione. Versare una piccola quantità di acqua distillata sopra entrambe le superfici della maschera viso per sciacquare. Avvolgete la maschera del viso in tovaglioli di carta umidi e in un sacchetto di plastica per almeno 24 ore consentire leggero appassimento prima di passare al passaggio successivo.
Nota: Il protocollo può essere sospeso per fino ad una settimana. Assicurarsi che la maschera rimane leggermente umida durante questo periodo.
3. DiceCT scansione
- Preparare la maschera per l'esame di CT.
- Montare le maschere su un materiale a bassa densità, come schiuma floreale, per eliminare eventuali grinze nella maschera e limitare il movimento della maschera mentre la maschera si asciuga leggermente durante la scansione. Fissare la maschera alla schiuma con stuzzicadenti di legno.
- Impostazione dei parametri di esplorazione di CT e la scansione.
- Utilizzare una risoluzione elevata per queste scansioni, come i piccoli fasci verranno oscurati a risoluzione inferiore. Usare una spaziatura inter-fetta e inter distanza pixel circa 0,05 mm.
- Scansione la maschera montato su uno Scanner di tomografia computata ad alta risoluzione dei raggi x.
- Se i fasci sono in grado di essere visualizzato completamente, a causa di sovra-macchiatura, posto maschera viso in soluzione di formalina al 10% o 5% sodio tiosolfato di rimuovere alcuni della macchia. Se i fasci non sono sufficientemente macchiati, tornare alla soluzione di Lugol. Dopo aver regolato la macchiatura, scansione di nuovo la maschera del viso. Continuare ad apportare le modifiche necessarie ed eseguire la scansione fino a quando i fasci sono in grado di essere completamente visualizzato.
4. preparare la maschera facciale per la conservazione a lungo termine.
- Chimicamente e neutralizzare la macchia di iodio nella maschera viso, rimozione di decolorazione dal processo di colorazione.
- Posto macchiato maschera viso in soluzione di tiosolfato di sodio 5% (m/v) per neutralizzare chimicamente esemplare. Questo potrebbe richiedere diverse ore o giorni. Agitare regolarmente durante il decolorante.
- Tornare destained maschera alla soluzione di formalina al 10% per la conservazione. Se macchia continua a lisciviare fuori dei campioni in soluzione, sostituire scolorito formalina con formalina fresco fino a quando rimane chiaro per conservazione a lungo termine.
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Risultati
Questa sezione presenta esempi di risultati sul modulo muscolatura facciale che può essere raggiunto utilizzando "dissezione inversa" in concerto con DiceCT scansione. Utilizzando "dissezione inversa" per creare una maschera facciale, una rappresentazione più completa del muscolo (facciale) mimetico può talvolta essere visto che nella metodologia tradizionale dissezione. Questo metodo funziona su una gamma di dimensioni del corpo da piccoli, piccoli-bodied primati, ad esempio il comune ui...
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Discussione
Seguendo i passi per la dissezione"inversa" protocollo produce in genere una maschera facciale che può essere sezionata, lentamente e metodicamente, per rivelare la muscolatura mimetico, indipendentemente dalle dimensioni della testa. È particolarmente importante spostare lentamente e continuamente valutare se i muscoli sono stati completamente tagliati attraverso inavvertitamente, particolarmente in più piccole specie di corposo.
Al fine di determinare dove si trova la muscolatura, è particol...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere Yerkes National Primate Research Center per accedere a scimpanzé e gli esemplari di macaco rhesus e Chris Vinyard (Northeast Ohio Medical University) per l'accesso ai comuni esemplari di uistitì. Ringraziamo Marissa Boettcher, Kaitlyn Leonard e Antonia Meza presso la University of North Carolina per assistenza con il processo di scansione. Quest'opera è stata eseguita in parte presso la Duke University ha condiviso materiali strumentazione Facility (SMIF), un membro della Carolina del Nord ricerca triangolo nanotecnologia Network (RTNN), che è sostenuto dalla National Science Foundation (Grant ECCS-1542015) nell'ambito della nanotecnologia nazionale infrastrutture di coordinata (NNCI). Si tratta di Duke Lemur Center pubblicazione numero 1405.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nikon XTH 225 ST | Nikon | senza numeri di catalogo | |
| 10% formalina tamponata | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Iodio, ACS Grade | Lab Chem, Inc. | ||
| tiosolfato di sodio | Acros Organics | AC450620010 | |
| ioduro di potassio | Alfa Aesar | A1270430 |
Riferimenti
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