Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Summary

Topi geneticamente modificati sono modelli utili per studiare i meccanismi di carcinoma della prostata. Qui presentiamo un protocollo per identificare e sezionare i lobi della prostata da un sistema urogenitale del mouse, differenziarli basato sull'istologia e isolare e coltura primaria di cellule della prostata in vitro come sferoidi per analisi successive.

Abstract

Modelli murini geneticamente (GEMM) fungono da efficace modelli pre-clinici per indagare la maggior parte dei tipi di cancri umani, compreso il carcinoma della prostata (PCa). Comprendere l'anatomia e istologia della prostata del mouse è importante per l'uso efficiente e corretta caratterizzazione di tali modelli animali. La prostata del topo ha distinto quattro paia di lobi, ciascuno con le proprie caratteristiche. Questo articolo viene illustrato il metodo corretto di dissezione e identificazione dei lobi della prostata del mouse per l'analisi di malattia. Post-dissezione, le cellule della prostata possono essere ulteriormente coltivate in vitro per la comprensione meccanicistica. Dal mouse cellule primarie della prostata tendono a perdere le loro caratteristiche normali quando coltivate in vitro, descriviamo qui un metodo per isolare le cellule e loro coltivazione come culture sferoide 3D, che è efficace per preservare la fisiologica caratteristiche delle cellule. Queste culture 3D possono essere utilizzate per analizzare la morfologia delle cellule e comportamento in condizioni di quasi-fisiologiche, indagando alterato livelli e localizzazioni di proteine chiave e pathways coinvolti nello sviluppo e progressione di una malattia e guardando risposte ai trattamenti farmacologici.

Introduction

La comunità scientifica ha cercato di chiarire il meccanismo complesso di sviluppo umano del cancro per decenni. Considerando che l'identificazione di potenziali giocatori chiavi e bersagli farmacologici inizia con le cellule pazienti e gli studi del tessuto, l'applicazione traslazionale di tali risultati spesso richiede l'uso di modelli animali preclinici. L'uso di topi geneticamente ingegnerizzati modelli (GEMM) ai cancri umani modello è sempre aumentata dall'istituzione del Mouse modelli di umano cancri Consorzio (NCI-MMHCC), un comitato che ha cercato di descrivere e unificare caratteristiche del cancro del mouse modelli per gli scienziati in tutto il mondo

Protocol

Tutti gli esperimenti del mouse descritti qui sono stati eseguiti secondo le linee guida delineate nei protocolli approvati IACUC istituzionali presso SUNY Upstate Medical University.

1. la dissezione del sistema urogenitale (UGS)

Nota: Lo schema è presentato nella Figura 1.

1. Eutanasia di un 3-mese-vecchio maschio C57BL/6 del mouse utilizzando il metodo di eutanasia da inalazione di CO₂ o un'altra tecnica approvata.
   Nota: I topi di età compresa tra i 3 e 12 mesi possono essere utilizzati con successo per l'esperimento. Più vecchi topi (> 6 mesi) molto probabilm....

Results

I lobi della prostata del mouse possono essere identificati e sezionato utilizzando le loro posizioni per quanto riguarda le vescicole seminali e l'uretra. La prostata del topo è composto da 4 paia di lobi situati dorsalmente e ventralmente alle vescicole seminali e uretra. Figura 4a e 4b (in alto) mostrano la vista dorsale e ventrale della prostata intatta, insieme con le vescicole seminali e l'uretra. I pannelli di fondo (

Discussion

Questa carta descrive i metodi per la dissezione della prostata del mouse e l'identificazione dei singoli lobi. È anche descritto il protocollo per coltura in una cultura 3D per l'analisi in vitro delle cellule della prostata del mouse.

Un passo fondamentale nel protocollo di dissezione è raccolta l'intera UGS fuori il mouse (1) e separando i singoli organi sotto un microscopio di dissezione. Il tessuto della prostata è molto piccola e circondata dal resto del UGS; così, è praticament.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strumenti chirurgici per topi (Kit per la dissezione del topo)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Microscopio
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Medium per dissezione (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Siero fetale bovino	Thermofisher Scientific
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenasi	Thermofisher Scientific 17018029		Produrre 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filtrare, sterilizzare, aliquotare e conservare a -20 gradi; C
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNasi I	Sigma-Aldrich	10104159001  ROCHE
Siringhe e aghi	Fisher Scientific
Fisherbran Filtri per cellule sterili, 40μ m	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Aggiungere tutti i componenti, aliquotare e conservare a -20 °C.
Matrice a membrana Matrigel	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II polvere	Thermofisher Scientific	17105041	Produrre 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filtrare sterilizzare, aliquotare e conservare a -20 ° E