Questo protocollo è destinato per descrivere la consegna di porcino dell'epatocita isolamento ed ex vivo del gene per curare modelli di malattie metaboliche tramite trapianto autologous della cellula. Anche se questo particolare modello gode di vantaggi unici che favoriscono la riuscita terapia, l'applicazione è una Fondazione pertinente all'indirizzo di indicazioni e altre malattie.
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Articolo metodologico
Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia genica è una scelta ideale per curare molti errori congeniti del metabolismo del fegato. Ex-vivo, vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nel trattamento di molte malattie ematopoietiche in esseri umani, come il loro utilizzo offre l'espressione del transgene stabile grazie alla capacità del vettore di integrare nel genoma ospite. Questo metodo viene illustrata l'applicazione di ex vivo terapia genica degli epatociti a un grande modello animale della tirosinemia ereditaria di tipo I. Questo processo è costituito da 1) isolamento di epatociti primari dall'animale autologo donatore/ricevente, 2) ex vivo consegna del gene tramite trasduzione degli epatociti con un vettore lentivirale e 3) autologo trapianto di epatociti corretti tramite portale della vena di iniezione. Successo del metodo si basa generalmente su rimozione efficiente e sterile della resezione epatica, un'attenta gestione dell'esemplare asportato per l'isolamento degli epatociti vitali sufficienti per trasduzione del ri-innesto, ad alta percentuale di cellule isolate, e procedure chirurgiche asettiche in tutto per prevenire l'infezione. Guasto tecnico presso uno di questi passaggi si tradurrà in basso rendimento degli epatociti trasdotte praticabili per trapianto autologo o infezione dell'animale donatore/ricevente. Il modello di maiale di tirosinemia ereditaria di tipo 1 umano (HT-1) scelto per questo approccio è unicamente suscettibile di tale metodo, come anche una piccola percentuale di attecchimento di cellule corrette porterà alla ripopolazione del fegato con le cellule sane, basate su un potente vantaggio selettivo negli epatociti nativo-malato. Anche se questa selezione di crescita non sarà vera per tutte le indicazioni, questo approccio è una Fondazione per l'espansione in altre indicazioni e permette per la manipolazione di questo ambiente di affrontare ulteriori malattie, sia all'interno del fegato e oltre, controllo per l'esposizione al vettore virale e opportunità per fuori bersaglio tossicità e carcinogenicità.
Introduzione
Errori congeniti del metabolismo del fegato sono una famiglia di malattie genetiche che colpiscono collettivamente altretanto come 1 in 800 nati vivi1. Molte di queste malattie sono singolo gene difetti2 e può essere curate in modo funzionale con l'introduzione di una singola copia corretta del gene interessato in un numero sufficiente di epatociti3. La percentuale effettiva di epatociti che deve essere corretto varia a seconda della malattia4 e dipende in larga misura la natura della proteina che codifica, ad esempio, viene escreta proteine contro citoplasmico. Nella maggi....
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Protocollo
Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali ed erano esaminate e approvate dal istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) prima di studio condotta. Le procedure descritte qui sono state effettuate su maschio e femmina grande bianco allevamento di maiali (background genetico di 50% Landrace/50% Large White) fino a 3 mesi di età che sono ritenuti sani e adatti per la chirurgia. Gli animali sono alloggiati socialmente se non considerato incompatibile dal personale istituzionale cure veterinarie. Gli animali sono alimentati livelli appropriati di chow due volte quotidiane e osservati per segni clinici di cura per....
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Risultati
La resezione epatica e trapianto autologo sono rappresentati schematicamente in Figura 1. In un gruppo rappresentativo di 5 maiali che hanno subito la resezione epatica, la maggior parte avevano rendimenti di > 1 x 109 epatociti con circa 80% di vitalità (tabella 2), fornendo un sacco di cellule per qualsiasi tipo di desiderato manipolazioni, tra cui gene terapia. Successiva cultura della parte non sottoposti a trapianto di epat.......
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Discussione
Questo rapporto descrive un ex vivo autologo approccio di terapia genica per curare un modello porcino di HT-1. Si tratta di un'epatectomia parziale, seguita da ex vivo dell'epatocita isolamento e trasduzione di epatociti isolati con lenti virus che trasportano il transgene correttivo. Corretti gli epatociti autologhi sono poi trapiantati torna all'animale carente di FAH attraverso la vena porta8. Anche se il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con alc.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Duane Meixner per competenza nell'eseguire l'iniezione della vena portale, Steve Krage, Joanne Pederson e Lori Hillin per assistenza durante le procedure chirurgiche. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione dell'ospedale del Minnesota Minnesota di medicina rigenerativa e dei bambini. R.D.H. è stato finanziato attraverso un premio NIH K01 DK106056 e un Mayo Clinic Center per medicina rigenerativa Career Development Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3-cicloesandione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Succatrice chirurgica 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catchbag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Medicazione sterile |
| Williams'-E Polvere | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Penna/Streptococco | Gibco | 15140-122 | |
| Siero fetale bovino | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetil-L-cisteina | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenasi D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Desametasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Fattore di crescita epidermico | Gibco | PHG0314 |
Riferimenti
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in childr....
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Ristampe e permessi
