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Articolo metodologico

Sub-acuta microemorragie cerebrale indotta tramite l'iniezione del Lipopolysaccharide in ratti

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DOI:

10.3791/58423

⸱

17 ottobre 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per indurre e rilevare CMHs causato da iniezione dei LPS in ratti Sprague-Dawley, che può essere utilizzato in futuro le indagini di ricerca sulla patogenesi di CMHs.

Abstract

Microemorragie cerebrali (CMHs) sono comuni in pazienti invecchiati e sono correlati a vari disordini neuropsichiatrici. L'eziologia di CMHs è complessa e neuroinfiammazione è osservato spesso come un co-avvenimento. Qui, descriviamo una sub-acuta CMHs modello di ratto indotta dall'iniezione di lipopolisaccaride (LPS), come pure un metodo per la rilevazione di iniezione CMHs. sistemica LPS è relativamente semplice, economico e conveniente. Uno dei principali vantaggi di iniezione dei LPS è la sua stabilità per indurre l'infiammazione. CMHs causato da iniezione dei LPS potrebbe essere rilevata da osservazione lordo, ematossilina ed eosina (HE), di Perl macchiatura prussiano, doppia marcatura blu di Evans (EB) e tecnologia di imaging a risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI). Infine, altri metodi di sviluppare modelli animali CMHs, compresi i loro vantaggi e/o svantaggi, inoltre sono discussi in questo rapporto.

Introduzione

Microemorragie cerebrali classiche (CMHs) riferiscono a perivascolare piccoli depositi di prodotti di degradazione del sangue come emosiderina dai globuli rossi nel cervello1. Secondo lo studio di Rotterdam Scan, CMHs potrebbe essere trovato in quasi il 17,8% di persone di età 60-69 anni e 38,3% in quelli oltre 80 anni2. La prevalenza di CMHs negli anziani è relativamente alta, e una correlazione tra l'accumulo di CMHs e disfunzione conoscitiva e neuropsichiatrica è stata stabilita3,4. Diversi modelli animali di CMHs recentemente sono stati segnalati, tra cui modelli del roditore indotti dal tipo IV collagenosi iniezione stereotassica5, transgenici APP6, β-N-methylamino-L-alanina esposizione7e ipertensione8, con CMHs indotta da infiammazione sistemica come una delle scelte più ben accettate. Fisher et al. 9 in primo luogo usato LPS derivati da Salmonella typhimurium per sviluppare un modello di topo CMHs acuto. Successivamente, lo stesso gruppo segnalato lo sviluppo di un modello di topo CMHs sub-acuto utilizzando lo stesso approccio2.

LPS è considerato come un stimolo infiammatorio standardizzato tramite l'iniezione intraperitoneale. Precedenti studi hanno confermato che iniezione dei LPS potrebbe causare neuroinfiammazione come riflesso di grandi quantità di microglia e attivazione di astrociti in animale modelli2,10. Inoltre, una correlazione positiva tra l'attivazione del neuroinflammation attivazione e il numero di CMHs è stato stabilito2,10. Sulla base di questi studi precedenti ci hanno richiesto di sviluppare un modello di ratto CMHs tramite l'iniezione intraperitoneale di LPS.

I progressi nella rilevazione tecnologie hanno provocato un aumento del numero di ricerche su CMHs. Il più ampiamente riconosciuto di metodi di rilevazione CMHs includono il rilevamento dei globuli rossi di ematossilina ed eosina (HE), rilevazione di ferro ferrico di blu di Prussia macchiatura9, rilevamento di Evans blue deposizione (EB) mediante immunofluorescenza Imaging e 7,0 Tesla risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI)10. Il presente studio mira a sviluppare un metodo di screening per CMHs.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) dell'ospedale generale dell'esercito di PLA.

1. materiali

  1. Preparazione dell'iniezione dei LPS
    1. Aggiungere 25 mL di acqua distillata a 25 mg di polvere di LPS derivata da S. typhimurium ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. Memorizzare l'iniezione in una provetta sterile a 4 ° C.
      Attenzione: LPS è tossico.
    2. Preparare una soluzione EB 2% in soluzione fisiologica 0,9% normale per mantenere iniezione EB alla concentrazione di lavoro.

2. gli animali

  1. Amministrare i LPS a ratti maschii di Sprague-Dawley (deviazione standard), 10 settimane di età (peso medio: 280 ± 20 g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
    Attenzione: Se ratti vengono acquistati da un'altra organizzazione, quindi la fase adattiva dovrebbe non essere meno di 7 giorni.

3. LPS iniezioni

  1. Iniettare per via intraperitoneale LPS ogni ratto alla dose di 1 mg/kg e tornare i ratti alla loro gabbia a casa.
    Nota: L'anestesia non è necessaria.
  2. Sei ore più tardi, iniettare la stessa dose di iniezione dei LPS in ratti.
  3. Sedici ore dopo iniettare la stessa dose di LPS in ratti.
    Attenzione: L'iniezione ratti SD con LPS ad una dose di 1 mg/kg può provocare un tasso di mortalità del 5%. Il tasso di mortalità potrebbe aumentare ulteriormente in più giovani o più vecchi topi o ratti femminili incinto.
  4. Restituire i ratti nelle loro gabbie dopo iniezione dei LPS e fornire accesso ad libitum per cibo e bevande.
    Nota: Ratti esporrà una risposta infiammatoria sistemica distinta, e quindi è essenziale che le gabbie rimangono pulite in tutto l'esperimento. Ratti dovrebbero essere frequentemente (x 2 giorni) il monitoraggio per peso, aspetto generale e atteggiamento dopo la prima iniezione di LPS. Se i ratti iniziano ad esporre una postura ricurva, riluttanza a muoversi, perdita di peso significativa (> 20%), porfirina colorazione che umanamente essere euthanized prima del giorno 7 EB studio punto finale.

4. campionario

  1. Iniezione di EB
    1. Sette giorni dopo la prima iniezione, anestetizzare il ratto di intraperitonealmente secondo il protocollo approvato IACUC.
    2. I ratti non mostrano risposte riflesse corneale, attendere 1-2 min. Eseguire un 5-8 mm-puntura profonda cardiaca su ogni ratto; il punto di foratura deve essere 5 mm al margine sinistro dello sterno presso lo spazio di 3 ° e 4 ° intercostali.
    3. Attendere fino a quando il recupero sangue è osservato e poi iniettare EB alla dose di 0,2 mL/100 g di peso di corpo nel ventricolo di sinistra del cuore.
      Attenzione: Cardiaco puntura ed EB dell'iniezione deve essere eseguite con attenzione. EB può essere iniettato in cavità toracica o pericardio invece il ventricolo di sinistra del cuore.
      1. Succhiare indietro con una provetta vuota e sostituire questo volume con un tubo EB prima dell'iniezione per contribuire a ridurre il tasso di guasto (ad es., iniezione alla gabbia toracica di errore).
    4. Mantenere il ratto in posizione supina per 10 min.
      Nota: Se il campione non è usato per rilevare fughe di EB nell'imaging di immunofluorescenza, quindi questo passaggio può essere omesso.
  2. Osservazione lordo
    1. Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata 1m soluzione salina tampone fosfato (PBS) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.
      1. Usando un bisturi, fare un'incisione addominale attraverso l'intera lunghezza del diaframma.
      2. Taglio attraverso le costole appena a sinistra della linea mediana gabbia toracica.
      3. Aprire la cavità toracica. Utilizzare fascette per esporre il cuore e per facilitare il drenaggio del sangue e altri fluidi.
      4. Tenendo costantemente il cuore con il forcipe (cuore dovrebbe essere batte ancora), direttamente inserire un ago dentro la protrusione del ventricolo sinistro per estendere questo a circa 5 mm. Fissare l'ago in quella posizione di bloccaggio vicino al punto di entrata.
        Attenzione: Non estendere eccessivamente l'ago, come si può perforare la parete interna e la circolazione delle soluzioni di compromesso.
      5. Rilasciare la valvola per consentire la soluzione PBS ghiacciata di flusso (200 – 300 mL) ad un tasso lento e costante a circa 20 mL/min utilizzando una pompa di perfusione. Se gli animali richiedono fissazione invece di osservazione lordo, quindi utilizzare la stessa dose di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata.
      6. Utilizzando delle forbici affilate, praticare un'incisione nell'atrio, assicurando che la soluzione fluisce continuamente. Se il liquido non scorre liberamente o proviene da narici o la bocca dell'animale, riposizionare l'ago.
    2. Schermo per CMHs tramite osservazione lordo.
      Nota: Se il campione non viene utilizzato nel calcolo del numero di CMHs da osservazione lordo, quindi questo passaggio può essere omesso.
  3. Fissazione
    1. Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata soluzione fisiologica 0,9% (200 – 300 mL) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.
    2. Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata paraformaldeide al 4% per la fissazione.
    3. Decapitare il ratto, isolare il cervello e immergete il cervello in soluzione di saccarosio al 20% per almeno 6 ore.
    4. Cambiare la soluzione in 30% di saccarosio e fix per un altro 6 h.
  4. Preparare 10 sezioni di tessuti del cervello spessore mm utilizzando un criostato.

5. egli macchiatura

Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un lui Kit di colorazione.

  1. Lavare i vetrini in acqua distillata.
  2. Macchia in soluzione di ematossilina per 8 min. lavare in acqua corrente per 5 min.
  3. Differenziare in alcool acido 1% per 30 s. lavaggio in acqua corrente per 1 min.
  4. Macchia in 0,2% acqua ammoniacale (azzurrante) o saturato litio carbonato soluzione per 30 s a 1 min. lavare in acqua corrente per 5 min.
  5. Sciacquare in alcol al 95% (10 immersioni).
  6. Colorante di contrasto con soluzione di eosina per 30 s a 1 min.
  7. Disidratare attraverso alcol al 95%, due cambi di alcool assoluto, per 5 minuti ciascuno.
  8. Chiaro in xilene per 30 s.
  9. Montare utilizzando metodo9 di Liu.
  10. Analizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza campo chiaro.
    Nota: globuli rossi rilasciato da vasi sanguigni, che sono i componenti di CMHs, appaiono in rosso-arancio sotto Egli macchiatura.

6. blu di Prussia di Perl colorazione

Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un Kit di colorazione di Perls.

  1. Lavare i vetrini con acqua distillata.
  2. Macchia in soluzione di reazione con miscela parti uguali di ferrocianuro e acido cloridrico per 10 min.
  3. Disidratare, deselezionare, montare e analizzare le diapositive come descritto nei passaggi 5.7 – 5,10.

7. EB double-macchiatura

Nota: Questa procedura segue passo 4.1.3.

  1. Lavare i vetrini con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno.
  2. Incubare i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole soluzione di (DAPI) per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Lavare i vetrini con soluzione di PBS tre volte per 5 minuti ciascuno e montare i vetrini con la soluzione di PBS-glicerolo.
  4. Analizzare le immagini su un microscopio a fluorescenza. Deposizione di EB è indicato dalla fluorescenza rossa; i nuclei sono indicati da una fluorescenza blu.

8. MRI-SWI

  1. Eseguire risonanza magnetica su un magnete 7-T equipaggiato con un sistema di gradiente attivamente schermato (16cm di diametro interno).
  2. Sette giorni dopo il trattamento, anestetizzare i ratti per inalazione facemask di isoflurane 1,5 – 2,0% utilizzando un sistema di anestesia isoflurano.
  3. Applicare unguento veterinario sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  4. Tenere i ratti in posizione prona ed eseguire una scansione MRI-SWI.
  5. Ottenere scansioni SWI ponderata utilizzando una sequenza di fast spin echo utilizzando i seguenti parametri: echo tempo (TE) 8 ms, ripetizione del tempo (TR) 40 ms, angolo di vibrazione = 12°, campo visivo (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice di acquisizione 384 × 384, per acquisire fette di spessore mm 1.
  6. Identificare CMHs in MRI-SWI secondo Greenberg et al. 11, che comprendeva i seguenti criteri: (1) diametro ≤ 10 mm e macchie (2) circolare, isolato e segnale di bassa intensità.
  7. Alla fine dell'esperimento, eutanasia i ratti utilizzando il metodo di biossido di carbonio (un flusso di 6 L/min) o 30% del volume contenitore di sovradosaggio.

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Risultati

CMHs può essere rilevato utilizzando vari approcci. I metodi più ben accettati sono i seguenti: (1) lordo osservazione e valutazione della superficie CMHs (illustrato nella Figura 1, pannello superiore); (2) egli macchiando per la rilevazione di cellule di anima rosse (mostrato in Figura 2A, pannello superiore) o prussiano macchiatura rilevazione ferro ferrico derivato dalla lisi dei globuli rossi (Figura 2A<...

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Discussione

Studi di ricerca su CMHs sono aumentati negli ultimi anni. Tuttavia, il meccanismo di CMHs rimane poco chiaro, spingente gli scienziati a stabilire modelli animali che simulano questa particolare condizione. Per esempio, Hoffmann et al. sviluppato un modello di mouse CMHs indotta da ipossia che mostra che CMHs sono causati da ipossia e la rottura di autoregolamento cerebrovascolare12. Reuter et al. 5 hanno stabilito un modello CMHs in topi transgenici APP2...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo insegnante Jian Feng Lei e i colleghi di università medica di capitale per l'orientamento durante risonanza magnetica. Ringraziamo anche Jing Zeng dal dipartimento di neurologia, ospedale di Yichang del popolo secondo per la fornitura di supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LPSSigma-AldrichL-2630per l'induzione dell'infiammazione
EBSigma-aldrichE2129per il rilevamento di perdite EB
Soluzione di tintura DAPIServicbioG1012terreno di conteggio per IF
Perl' s Colorazione prussianaSolarbioG1424Kit per la colorazione prussiana
Colorazione HESolarbioG1120Kit per la colorazione HE
idrato di cloralioSigma-Aldrich47335UPer anestesia
tampone fosfato soluzione salina (PBS)SolarbioP1022un tipo di soluzione tampone comunemente usata nell'esperimento
Soluzionesalina allo 0,9%Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Cinasoluzione per
perfusione paraformaldeideSigma-Aldrich158127un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione
soluzione di saccarosio al 20%SolarbioG2461un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione
saccarosio al 30%SolarbioG2460un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione
unguento veterinarioSolcoseryl gel per gli occhi, Bacel, Svizzeraper la protezione degli occhi dei ratti
soluzione di

Riferimenti

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