Method Article

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

DOI:

10.3791/58429

⸱

October 18th, 2018

 , 
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

In This Article

Summary

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Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell'osso in esso.

Abstract

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Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l'amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell'osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell'osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l'effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell'osso. Qui, descriviamo l'uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell'osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l'uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell'immunità innata nel tessuto osseo.

Introduction

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Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un'elevata capacità rigenerativa in una varietà ....

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Landesdirektion di Dresda (permesso di numeri: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. preparazione dei materiali e delle soluzioni

Nota: Prednisolone, come altri glucocorticoidi, conduce all'immunosoppressione. Così, precauzione deve essere presa per prevenire l'infezione negli animali trattati durante l'esperimento. A tal fine, articoli di vetro di autoclave e 'acqua di pesce' (cioè, l'acqua che viene utilizzata per posteriore zebrafish adulto) prima di iniziare l'e....

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Results

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Il protocollo presentato qui è stato utilizzato ripetutamente per indurre la formazione rapida dell'osso nel corso della rigenerazione del zebrafish pinna e cranio10,11,16. In combinazione con il metodo di somministrazione di prednisolone, studi sugli effetti di prednisolone durante la rigenerazione dell'osso possono essere perseguiti. Ad esempio, studi sulla formazione dell'osso e mineralizzazio.......

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Discussion

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Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l'osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda ("Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell'osso indotta da glucocorticoidi") e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marc....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PrednisoloneSigma-AldrichP6004
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Etil-3-amminobenzoato metanosolfonato (MS-222)Sigma-AldrichA5040
Pinza smussataAesculapBD027R
Pinza fineDumont91150-20
BisturiAgo per iniezione 840004 Biozym 5518059
Agarose
Braun (0,3 mm x 13 mm)BD Beckton Dickinson30400
Micro drillCell Point Scientific67-1000distribuito es. da Harvard Apparatus
Frese in acciaio (0,5 µ m diametro)Strumenti per le scienze19007-05
Artemia ssp.Sanders425GR
Pipetta Pasteur (plastica, Pastette)Alpha LabsLW4111
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
Alizarina rosso S polvereSigma-AldrichA5533
Alcian blue 8 GXSigma-AldrichA5268
CalceinSigma-AldrichC0875
TripsinaSigma-AldrichT7409
StereomicroscopioLeicaMZ16 FAcon fotocamera QIMAGING RETIGA-SRV
StereomicroscopioOlympusMVX10con fotocamera Olympus DP71 o DP80

References

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  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols.

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Zebrafish Bone RegenerationPrednisolone TreatmentFin AmputationCalvarial TrepanationFin FractureAlizarin Red StainingImmunohistochemistryFluorescence MicroscopySystemic Drug ExposureBone Formation

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