Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per studiare simultaneamente il contributo di domini proteici specifici dei recettori di membrana plasmatica sia reclutamento degli enzimi e l'attività dell'enzima.

Abstract

Associata al recettore gli enzimi sono i principali mediatori di attivazione cellulare. Questi enzimi sono regolati, almeno in parte, da interazioni fisiche con le code citoplasmatiche dei recettori. Le interazioni si verificano attraverso domini proteici specifici spesso e provocare l'attivazione degli enzimi. Ci sono diversi metodi per studiare le interazioni tra proteine. Mentre co-immunoprecipitazione è comunemente utilizzato per lo studio di domini che sono necessari per le interazioni proteina-proteina, non ci sono nessun test che documentano il contributo di domini specifici all'attività degli enzimi reclutati allo stesso tempo. Di conseguenza, il metodo qui descritto combina co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per valutazione simultanea delle interazioni tra proteine e attivazione enzimatica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare i domini che sono critici per interazioni fisiche tra una proteina ed enzima e i domini che sono obbligatori per completare l'attivazione dell'enzima. L'importanza di questo test è dimostrata, come determinato ricevitore domini proteici contribuiscono all'associazione dell'enzima per la coda citoplasmatica del recettore, mentre altri domini sono necessari per regolare la funzione dell'enzima stesso.

Introduzione

Recettori catalitici e recettori tirosin chinasici sono proteine transmembrana, in cui il legame di un ligando extracellulare causa attività enzimatica sul lato intracellulare¹. Alcuni recettori possiedono recettori sia funzioni enzimatiche, mentre gli altri recluta enzimi specifici come chinasi e fosfatasi a loro code citoplasmatiche. Assunzione di un enzima alla coda del recettore e la conseguente azione catalitica di questo enzima sono due processi separati che non sono sempre disciplinati dalla stessa proteina domini². Purtroppo, non ci sono nessun strumenti specifici per valutare l'interazione e l'attività enzimatic....

Protocollo

1. transfezione delle celle

1. Le cellule HEK 293T del seme in dodici piatti da 10 cm (5 x 10⁶ cellule per piastra) il giorno prima di transfezione (Figura 1). Eseguire il conteggio delle cellule usando un emocitometro. Per ogni piastra, utilizzare 10 mL di DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO₂.
2. Una volta che le cellule sono 80-90% confluenti, transfect 5 piastre HEK 293T utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi con uno dei seguenti plasmidi: un vettore che esprime SHP2, un vettore di PD-1-GFP-esprimendo [una versione di....

Risultati

Mentre il contributo di ITSM di PD-1 a SHP2 associazione è stabilito, il ruolo della ITIM di PD-1 è meno chiaro. Perché SHP2 ha due domini SH2 che possono legarsi a due fosfotirosine sequenziale su PD-1 (una tirosina nell'ITSM) e un altro in ITIM, abbiamo supposto che l'ITSM di PD-1 ancore SHP2 e PD-1, mentre il ITIM di PD-1 facilita l'attività SHP2 stabilizzando la aprire stato conformazionale^11,14. Per eseguire questo test, abbi.......

Discussione

Interazioni del ricevitore-enzima sono cruciali per segnalazione intracellulare. Molti enzimi sono reclutati ai ricevitori attraverso domini SH2 associazione a tirosine fosforilate che decorano le code degli stessi recettori. Tuttavia, gli enzimi sono spesso piegati in conformazioni inattive chiuse e attivazione richiede un cambiamento conformazionale¹¹ che può essere mediato da altri domini del recettore stesso. Il test descritto qui misure le interazioni tra recettori e gli enzimi come pure l'at.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PBS	Lonza	17-516F	Microcentrifuga salina tamponata con fosfato
	Eppendorf	5424-R	1,5 mL
Tripsina-EDTA (0,25%) Fenolo Rosso	Gibco	25200114
Inattivato a caldo FBS	Denville	FB5001-H	Siero fetale bovino
Penicillina / Streptomicina	Fisher	BP295950
DMEM alto glucosio senza L-glutammina	Lonza	BE12-614F
SuperFect Reagente di trasfezione	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti– GFP-agarosio	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actina	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cellule	ATCC	CRL-1573
Ortovanadato	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Cocktail di inibitori della proteasi	Roche	11836170001
Tampone per campioni SDS senza EDTA senza EDTA (2x)	Invitrogen	LC2676	Tampone Laemmli modificato
4-20% Mini gel di tris-glicina	Invitrogen	XP04205BOX	15 pozzetti
	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium cloruro
HEPES	Gibco	15630080	N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano sulfonato
acido DTT	Invitrogen	D1532	Ditiotreitolo
pNPP	Sigma	20-106	p-nitrofenil fosfato
NaOH		Sigma S8045	Idrossido di sodio
BCA	Fisher	23225	Bi Saggio dell'acido cinconnico

membrane in nitrocellulosa a