L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.
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Articolo metodologico
Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Infarto miocardico (MI) è delle cause principali di morbilità e mortalità nel mondo. Degli obiettivi principali della medicina rigenerativa è per ricostituire il miocardio morto dopo MI. Anche se diverse strategie sono state utilizzate per rigenerare il miocardio, terapia con cellule staminali rimane un approccio importante per ricostituire il miocardio morto di un cuore MI. Raccogliendo la prova suggerisce la presenza di cellule staminali residenti cardiache (CSCs) nel cuore adulto e loro effetti endocrini o paracrino sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, CSC isolamento e loro caratterizzazione e differenziazione verso le cellule del miocardio, soprattutto cardiomiociti, rimane una sfida tecnica. Nello studio presente, abbiamo fornito un metodo semplice per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di CSCs dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo del gradiente di densità per l'isolamento delle CSCs, dove il cuore è digerito da una soluzione di 0,2% collagenosi II. Per caratterizzare le CSCs isolate, abbiamo valutato l'espressione di marcatori di CSCs/cardiaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcatori di pluripotenza/staminalità OCT4, SOX2 e Nanog. Inoltre abbiamo determinato il potenziale di proliferazione di CSCs isolato messa in coltura in una capsula di Petri e valutando l'espressione del marker di proliferazione Ki-67. Per valutare il potenziale di differenziazione delle CSCs, abbiamo selezionato sette - dieci - giorni coltivate CSCs. Li abbiamo trasferito in una nuova piastra con un mezzo di differenziazione dei cardiomiociti. Essi vengono incubati in un'incubatrice di coltura cellulare per 12 giorni, mentre il mezzo di differenziazione viene cambiato ogni tre giorni. Le CSCs differenziate esprimono marcatori del cardiomyocyte specifiche: actinina e troponina I. Così, CSCs isolato con questo protocollo dispone di staminalità e marcatori cardiaci, e hanno un potenziale di proliferazione e differenziazione verso cardiomyocyte lignaggio.
Introduzione
Cardiopatia ischemica, tra cui l'infarto miocardico (MI), è delle principali cause di morte intorno al mondo1. Terapia con cellule staminali per la rigenerazione del miocardio morto rimane un approccio importante per migliorare la funzione cardiaca di un MI cuore2,3,4,5. Diversi tipi di cellule staminali sono stati utilizzati per ricostituire il miocardio morto e migliorare la funzione cardiaca di un cuore MI. Essi possono essere categorizzati largamente in cellule staminali embrionali di6 e ad....
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Protocollo
L'alloggiamento, l'anestesia e sacrificio dei topi sono stati effettuati seguendo il protocollo approvato IACUC dell'University of Nebraska Medical Center.
1. materiali
- Uso 10 a 12-week-old C57BL/6J nero topi maschi, mantenuti in-House presso l'impianto istituzionale degli animali, per l'isolamento delle CSCs. CSCs possono anche essere isolate da topi femmine non gravide.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari, tra cui forbici chirurgiche, bene forbici chirurgiche, gambo curvo forcipe e una lama chirurgica, in autoclave prima l'eutanasia del mouse.
- Preparare il buffer di isolamento di CSC in una ....
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Risultati
Nello studio presente, abbiamo isolato il CSCs da cuori di topo maschio di 10 a 12-week-old C57BL/6J. Qui, abbiamo presentato un metodo semplice per CSC isolamento e caratterizzazione mediante marcatori di pluripotenza. Abbiamo anche presentato un metodo elegante per il differenziamento di CSC e la caratterizzazione delle CSCs che differenziati verso cardiomyocytes lignaggio. Abbiamo osservato una morfologia di forma dell'alberino di CSCs 2 - a 3-giorni-coltivati sotto un microscopio a co.......
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Discussione
I punti critici di questo protocollo di isolamento del CSC sono come segue. 1) una condizione sterilizzata deve essere mantenuta per l'estrazione dei cuori dai topi. Qualsiasi contaminazione durante l'estrazione del cuore può compromettere la qualità della CSC. 2) il sangue deve essere completamente rimosso prima di tritare il cuore, che è fatto da diversi lavaggi di tutto il cuore e il cuore a pezzi con soluzione HBSS. 3) i pezzi di cuore devono essere completamente lisati in sospensione unicellulare con soluzione della.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato, in parti, dalle sovvenzioni National Institutes of Health HL-113281 e HL116205 a. punti Kumar Mishra.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Codice 000664 | |
| Anticorpi: | |||
| OCT4-Abcam | ab18976 (policlonale di coniglio) | OCT4-Anticorpo primario - diluizione 1:100, anticorpo secondario - diluizione 1:200, in soluzione bloccante | |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (policlonale di coniglio) | SOX2-Anticorpo primario - Diluizione 1:100, Anticorpo secondario - Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| Nanog | Abcam | ab80892 (policlonale di coniglio) | Nanog-Anticorpo primario - Diluizione 1:100, Anticorpo secondario - Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (policlonale di coniglio) | Ki67 - Anticorpo primario - Diluizione 1:100, Anticorpo secondario - Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| Sca I | Millipore | AB4336 (policlonale di coniglio) | Sca I Anticorpo primario - diluizione 1:100, anticorpo secondario - diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (policlonale di capra) | NKX2-5 - anticorpo primario - diluizione 1:50, anticorpo secondario - diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (policlonale di coniglio) | GATA4-Anticorpo primario- Diluizione 1:100, Anticorpo secondario- Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (policlonale di capra) | MEF2C-Anticorpo primario- Diluizione 1:50, Anticorpo secondario- Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| Troponina I | Millipore | MAB1691 (monoclonale di topo) | Troponina I-Anticorpo primario- Diluizione 1:100, Anticorpo secondario - Diluizione 1:200, in soluzione |
| bloccanteActinin | Millipore | MAB1682 (monoclonale di topo) | Actinina-Anticorpo primario- Diluizione 1:100, Anticorpo secondario- Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| ANP | Millipore | AB5490 (policlonale di topo) | ANP-Anticorpo primario- Diluizione 1:100, Anticorpo secondario- Diluizione 1:200, in soluzione bloccante |
| Alex Fluor-488 checken anti-coniglio | Tecnologia Life | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 capra anti-coniglio | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 coniglio anti-capra | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-capra | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Terreno di coltura: | |||
| Terreno di mantenimento CSC | Millipore | SCM101 | Nota: Per la coltura CSC, è stato utilizzato PBS o terreno DMEM incompleto per il lavaggio delle cellule |
| Terreno di differenziazione dei cardiomiociti | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Nome | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Cell Isolation Buffer:soluzione di | |||
| polisaccarosio e diatrizoato di sodio (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenasi I | Sigma | C0130 | |
| Soluzione di dispasi | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Reagente di dissociazione cellulare | Thermoscientific | A1110501 | |
| Altri reagenti: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Siero di controllo normale | Laboratorio vettoriale | S3000 | |
| Soluzione DAPI | Applichem | A100,0010 | Dapi, concentrazione di lavoro-1 & micro; g/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Reagente di dissociazione cellulare | Thermo Fisher Scientific A1110501 | ||
| Formaldeide | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lotto n. 160170 | |
| Etanolo | Thermo Scientific | ||
| Name | >Company | >Numero di catalogo | Comments |
| Materiali per colture tissutali: | |||
| 100 mm piastra di Petri | Thermo Scientific | ||
| piastra a 6 pozzetti | Thermo Scientific | ||
| Piastra a 24 pozzetti | Thermo Scientific | ||
| Pallone T-25 | Thermo Scientific | ||
| Pallone T-75 | Thermo Scientific | ||
| Provetta conica da 15 ml | Thermo Scientific | ||
| Provetta conica da 50 ml | Thermo Scientific | ||
| 40 & micro; coloratore di cellule m | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µ coloratore di cellule m | Fisher Scientific 22363549 | ||
| 0.22 µ filtro m | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL siringa | BD | Ref n. 309604 | |
| 10 µ L, 200 & micro; L, 1000 & micro; Fisher | Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL pipetta monouso in plastica | Thermo Scientific | ||
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Instruments | |||
| Macchina centrufuga | Thermo Scientific | Centrifuga LEGEND X1R Microscopio | |
| EVOS | Tecnologia | ||
| Contatore cellulare automatizzato | Biorad | ||
| Vetrino per conteggio cellule | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipetta riempitrice | |
| Nome | < strong>Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Strumenti chirurgici: | |||
| Forbici chirurgiche | Strumento scientifico fine Forbici | ||
| chirurgiche fini | Strumento | ||
| Pinza con gambo curvo | Strumento scientifico fine Strumento scientifico fine | ||
| Lama chirurgica | Fine Scientific Tool |
Riferimenti
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. A....
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Ristampe e permessi
