Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Summary

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Abstract

Fattori secreti, recettori di membrana-tethered e loro interattori sono regolatori principali di comunicazione cellulare e l'inizio della cascata di segnalazione durante l'omeostasi e la malattia e come tali rappresentano bersagli terapeutici privilegiate. Nonostante la loro rilevanza, queste reti di interazione rimangono notevolmente sottorappresentate nei database correnti; di conseguenza, più proteine extracellulari non hanno documentato associazione partner. Questa discrepanza è principalmente dovuto le sfide connesse con lo studio delle proteine extracellulari, compreso l'espressione di proteine funzionali e la debole, bassa affinità, interazioni della proteina spesso stabiliti tra recettori di superficie. Lo scopo di questo metodo è di descrivere la stampa di una libreria di proteine extracellulari in un formato di microarray per lo screening delle interazioni proteina-proteina. Per attivare il rilevamento delle interazioni deboli, è descritto un metodo basato sul multimerization della proteina query in fase di studio. Accoppiato a questo approccio basato su Microperlina multimerization per maggiore multivalenza, il microarray di proteine permette di rilevamento affidabile delle interazioni proteina-proteina transitoria in elevato throughput. Questo metodo offre un campione rapidi e a basso consumo-approccio per l'identificazione di nuove interazioni applicabile a qualsiasi proteina extracellulare. Stampa di microarray della proteina ed il protocollo di screening sono descritti. Questa tecnologia sarà utile per gli investigatori che cercano un metodo affidabile per la scoperta delle interazioni della proteina nello spazio extracellulare.

Introduction

Il metodo Recensito qui descrive la stampa di un insieme di proteine extracellulari in un formato di microarray, seguita da un metodo per lo screening di un target di interesse nei confronti di questa libreria. Abbiamo identificato multimerization proteina come un passo fondamentale per il rilevamento delle interazioni caratterizzate da affinità di legame basso. Per migliorare la rilevazione di queste interazioni, descriviamo un protocollo basato su multimerization della proteina di interesse utilizzando microsfere query.

Secreto e superficie-espresse proteine della cellula (collettivamente denominate proteine extracellulari) insieme ai lor....

Protocol

1. generazione di una libreria di proteine umane extracellulare

1. Compilare un elenco di recettori di superficie o proteine secrete di interesse per generare la libreria di microarray della proteina. Le famiglie di proteine specifiche (ad esempio, superfamiglia delle immunoglobuline) o proteine selettivamente espresso in particolare cella tipi possono essere selezionati per lo studio.
2. Per recettori di superficie, è necessario determinare i limiti del dominio extracellulare (ECD) identificando il peptide segnale e regioni transmembrane utilizzando strumenti software. Alcuni dei pertinenti strumenti, disponibile gratuitamente on-line, si fa riferimento....

Results

Uno schema del flusso di lavoro per la tecnologia di microarray della proteina extracellulare è illustrato nella Figura 1. Una volta che le diapositive di microarray contenente la libreria di proteina extracellulare sono disponibili, lo screening della proteina di interesse e analisi dei dati può essere completato entro un giorno. Fisiologicamente rilevanti molte interazioni tra recettori di membrana incorporato sono caratterizzati da punti di forza molto deb.......

Discussion

Un numero significativo di recettori orfani rimanga nel genoma umano, e nuovi interattori continuano ad emergere per proteine extracellulari con ligandi precedentemente caratterizzati. Definizione delle interazioni recettore-ligando in umani e organismi modello è essenziale per comprendere i meccanismi che determinano la comunicazione cellulare durante l'omeostasi, come pure la disregolazione che conducono alla malattia e quindi informare nuovi o migliorati opzioni terapeutiche. Tuttavia, rilevamento delle interazioni pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glicerolo ultra puro MB Grade	USB Corporation	56-81-5	Tampone
di blocco SeptoMark per la conservazione delle proteine	Zeptosens	BB1, 90-40	Tampone di blocco per microarray vetrini
Albumina sierica bovina	Roche	03-117-957-001	Controllo del vetrino per il montaggio della maschera (opzionale)
Piastre multipozzetto in polipropilene	Greiner Bio One	82050-678	Conservazione delle proteine
Piastre multipozzetto in polipropilene	Arrayit	MMP384	Stampa di diapositive
NanoPrint LM60, o contatto simile microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, o microarrayer a contatto simile	Stampa di vetrini
Micro spille di puntamento	Arrayit	Micro spille di puntamento	Stampa di vetrini
Stazione di blocco ZeptoFOG	Zeptosens	ZeptoFOG, 1210	Blocco di vetrini dopo la stampa
Latte scremato in polvere	Thermo Fisher	LP0031	Soluzione
di bloccoVetrino in vetro rivestito con resina epossisilana	Nextrion Slide E	1064016	Vetrini per microarray Supporto
vetro e set di rack per vetrini	Wheaton	900303	Conservazione dei vetrini
Colorante monoreattivo Cy5 Etichettatura	dell'albumina	GE Healthcare	Colorante
monoreattivo Cy5 Etichettatura	IgG umane	GE Healthcare	PA25001
Colonna di desalinizzazione Pro-spin	Princeton Separazioni	CS-800	Rimozione del colorante libero
Guarnizione adesiva in foglio di alluminio	AlumaSeal	F-384-100	Sigillatura di piastre di stoccaggio
Fiale criogeniche	in polipropilene Corning	430658	Fiale Master per la conservazione della libreria di proteine
Microsfere di proteine A	Miltenyi	120-000-396	Interrogazione della multimerizzazione delle proteine
IgG umane	Jackson Immunoresearch	& nbsp; 009-000-003	IgG irrilevanti per la marcatura della proteina
A	Sigma	P7837	Blocco dei vetrini per microarray
Stazione di ibridazione, a-Hyb o simile	Miltenyi	, a-Hyb o simile	Elaborazione automatizzata di microarray (opzionale)
Scanner GenePix 4000B o dispositivi	molecolari	Scanner GenePix 4000B o simile	Scansione dei vetrini
GenePix Pro o software di estrazione dati equivalente	Molecular Devices	GenePix Pro o software equivalente per l'estrazione dei dati	Elaborazione dei dati
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Strumento di previsione per determinare la presenza e la posizione dei siti di scissione dei peptidi segnale
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Previsione delle eliche transmembrana nelle proteine
Phobius	Software online del Centro di Bioinformatica di Stoccolma		Una topologia transmembrana combinata e predittore di peptidi segnale
TOPCONS	Software online	dell'Università di Stoccolma	Previsione della topologia di membrana e dei peptidi segnale