È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Valutare gli effetti Neuroprotective di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma estrarre utilizzando un modello murino di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media

7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/58454

⸱

9 dicembre 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo studio, modifichiamo un metodo sperimentale esistente per ottenere più risultati riproducibili, stabilendo un modello murino di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. La somministrazione orale di Glycyrrhizae Radix et Estratto del metanolo di Rizoma (GR) (GRex), dopo induzione di colpo, diminuito significativamente il volume di infarto totale rispetto al gruppo di controllo non trattato.

Abstract

Ischemia seguita da riperfusione di flusso sanguigno cerebrale dopo un ictus conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Il modello animale più comunemente usato per lo studio di colpo è il modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. Precedenti studi di ricerca sono riportati dimensioni differenti infarto anche quando la stessa specie animale sperimentale è stato usato in condizioni simili di MCAO. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo sperimentale migliore per affrontare questa discrepanza. Topi sono stati sottoposti a MCAO utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione per simulare condizioni di colpo umano e lo spessore del filamento è stato ottimizzato per stabilire più volume di infarto riproducibile. Topi trattati con un metanolo Estratto di Glycyrrhizae Radix et Rizoma (GRex) dopo induzione di colpo ha mostrato un volume di infarto totale significativamente in diminuzione e aumento del numero di sopravvivere cellule riguardante il gruppo di controllo non trattato. Questo modificato protocollo sperimentale con successo e riproducibile ha dimostrato l'effetto benefico di GRex il colpo ischemico.

Introduzione

Danni al cervello causati da ischemia e riperfusione di flusso sanguigno cerebrale conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Questo tipo di danno cerebrale continua ad aumentare con la crescente prevalenza di malattie cerebrovascolari a causa della diffusione di malattie metaboliche come l'obesità, ipertensione e diabete mellito1,2. Il numero assoluto di pazienti anziani con ictus è aumentato drammaticamente in tutto il mondo, e il costo delle cure mediche per questi pazienti, che spesso sono lasciati con disabilità a lungo termine, è un grave onere della società. Di conseguenza, disabilità secondaria dovrebbe essere attenuato per quanto possibile per ridurre l'onere economico1,2.

Il modello di roditore più comunemente usato di infarto cerebrale è il modello di occlusione (MCAO) arteria cerebrale media (MCA), in cui il MCA è occluso con un filamento di sutura chirurgico silicio per bloccare il flusso sanguigno, causando ictus ischemico3, 4. utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione permette il controllo del tempo di occlusione e permanenza manipolando la durata dell'inserzione del filamento intra-luminale.

Gli studi precedenti hanno mostrato che anche quando viene utilizzato lo stesso modello MCAO roditore, il volume totale di infarto cerebrale varia tra esperimenti, causando scarsa riproducibilità degli studi. Per migliorare la riproducibilità, abbiamo ottimizzato lo spessore della zecca filamento usato nell'esperimento. I risultati di uno studio preliminare del periodo ischemico cerebrale e infarto indotto ha mostrato che un periodo ischemico più di 60 min ammessi regione volumetrica del danneggiato tessuto cerebrale per essere osservato e misurato.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), noto anche come liquirizia, è costituito da radici secche e rizomi di Glycyrrhiza uralensis e g. glabra. È stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese e coreana per vari scopi incluso come un additivo alimentare e medicinale5,6,7.

In un precedente studio8, pre-trattamento con l'Estratto del metanolo GR (GRex) ha mostrato un effetto anti-apoptotico in topi MCAO, tra cui la prevenzione significativa della diminuzione nell'espressione della proteina di linfoma della B-cellula 2 (Bcl-2) e Bcl extra-large (Bcl-xL). Questo studio è stato condotto per migliorare la riproducibilità del modello del topo MCAO convenzionale valutando la sua efficienza nel determinare se il trattamento post-infartuale con GRex efficacemente ridotto il volume di infarto nel danno cerebrale indotto da MCAO.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato etico dell'Università nazionale di Pusan (numero di omologazione, PNU-2016-1087). Una panoramica grafica di questo studio è illustrata nella Figura 1.

1. preparazione e somministrazione di GRex

Nota: Il GR utilizzato in questo studio è stato acquistato da una società farmaceutica commerciale.

  1. Mettere 200 g di GR in 2.000 mL di metanolo e incubare a temperatura ambiente (25 ° C) per 5 giorni.
  2. Filtrare la miscela utilizzando carta da filtro con spessore di 0,26 mm e porosità di 5 µm e quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 1.000 mL di metanolo al residuo GR e filtrare nuovamente.
  3. Combinare i due surnatanti, filtrare attraverso carta da filtro, concentrato sotto vuoto e quindi liofilizzare il residuo per produrre GRex.
  4. Sciogliere il GRex in dimetilsolfossido (DMSO), diluire con soluzione fisiologica 0,9% e filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,45 µm. Quindi, regolare la concentrazione finale di DMSO per < 5%.
  5. Amministrare GRex (300 mg/kg di peso corporeo) 1 h dopo la riperfusione di MCAO via orale mediante sonda gastrica. Amministrare il DMSO diluito in soluzione fisiologica (10 mL/kg di peso corporeo) solo al gruppo normale e gruppi di controllo, rispettivamente.
    Nota: La concentrazione di GRex utilizzati in questo esperimento è stata determinata secondo la concentrazione che è stata attiva attraverso il nostro precedente studio8.

2. Mouse modello di MCAO

  1. Uso di topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6 settimane e pesatura g. 22-25 fornire tutti gli animali con libero accesso al cibo standard, acqua e casa loro in un ambiente con temperatura controllata (22 ± 1 ° C) e un ciclo luce/buio di 12 h.
    1. Dividere i topi in gruppi di sei topi ciascuno, che dovrebbero consistere di falsità-azionati normale, controllo e gruppi di trattamento GRex.
    2. Eseguire un intervento chirurgico MCAO (modifica del metodo di Koizumi et al. 9) sul controllo e gruppi di trattamento GRex stereo-microscopio.
  2. Indurre l'anestesia per inalazione nei topi utilizzando 2% isoflurane in 70% N2O e 30% O2. L'anestesia è considerata sufficiente quando il mouse non risponde allo stimolo meccanico applicato alla sua coda. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ± 0,5 ° C, usando un corpo temperatura-tenuta coperta collegata ad un termometro.
  3. Rimuovere tutti i peli sul petto e collo dei topi da rasatura, seguita da uso di crema depilatoria, disinfezione il sito chirurgico della pelle con betadine scrub alternati con alcool per due volte e poi fare un'incisione di circa 2 cm lungo con chirurgica lama al centro del collo. Isolare accuratamente l'arteria carotide comune sinistra (LCCA), arteria carotide esterna e il ramo dell'arteria carotica interna dai tessuti connettivi circostanti.
  4. Legare l'arteria carotide esterna e l'arteria carotica comune con una sutura chirurgica (sutura seta 4-0, nodo mezzo collo) per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria carotica interna durante il funzionamento.
  5. Inserire un suturare di nylon di silicio (8-0 monofilamento, 11 mm di lunghezza) attraverso l'arteria carotica interna all'origine del MCA di sinistra. Regolare lo spessore della parte di silicio del filamento ad una gamma di 0,10-0,12 mm.
  6. Misurare la riduzione del flusso sanguigno cerebrale relativo (rCBF) nel MCA usando un flussometro Doppler laser. MCAO verrà confermato quando il rCBF è mantenuto a < 20% dei valori di condizione di riposo durante l'intero periodo ischemico.
  7. Difficoltà il filamento inserito per il vaso sanguigno per 2 h, mentre l'arteria cerebrale è occlusa e quindi estrarre delicatamente il filamento per ripristinare il flusso di sangue per 22 h di riperfusione. Suturare la pelle con una cucitura a 5 posti (sutura seta 3-0, due metà intoppi nodo) e consentire ogni mouse a risvegliarsi dall'anestesia.
  8. Nel gruppo normale, eseguire un'operazione finta seguendo la stessa procedura sopra (fino a 2.4), con la seguente eccezione. Legare l'arteria carotica comune e suturare il muscolo incisa e la pelle.

3. misurazione del Volume del tessuto cerebrale danneggiato

  1. Dopo l'eutanasia dei topi per la misura del danno cerebrale con inalazione di CO2 , accise il mouse cervelli 24 h dopo l'inizio di MCAO utilizzando forbici chirurgiche iris e forcipe angolato.
    1. Dopo aver rimosso la testa utilizzando le forbici, fare un'incisione nella pelle della linea mediana della testa per capovolgere la pelle dal cranio.
    2. Rompere le ossa parietali con forcipe angolato, staccava dura materia allo stesso tempo e quindi isolare il cervello con attenzione dal cranio.
  2. Taglia il tessuto asportato in sezioni (spessore 1 mm) utilizzando una matrice di cervello del mouse e quindi macchiare le sezioni per 17 min in una soluzione di 2% 2, 3,5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC).
  3. Fissare le sezioni in formalina al 10% per almeno 2 h e poi fotografarli utilizzando una fotocamera digitale. TTC sarà osservato a macchiare il tessuto vitale rosso mentre le zone necrotiche sarà bianche.
  4. Analizzare e quantificare l'area di infarto cerebrale di ogni sezione using ImageJ.

4. ematossilina ed eosina (H & E) e Cresyl Violet macchiatura delle sezioni istologiche

  1. Eutanasia i topi per esame istologico per inalazione di CO2 e irrorare loro via con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS), seguita da 10 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Isolare il cervello utilizzando la stessa procedura come sopra (3.1) e immergete il cervello in 10 mL di saccarosio 30% durante la notte.
  2. Incorporare il tessuto cerebrale in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e affettarlo coronalmente in sezioni di 15-µm di spessore utilizzando un criostato. Montare i profili sulle lastre di vetro, seguite da colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) o viola di cresyl.
  3. Immergere i vetrini in etanolo di 80% per 1 min seguita dalla macchiatura in soluzione di ematossilina per 5 min.
    1. Immergere i vetrini in alcool acido 1% due volte, immergere in soluzione satura di carbonato del litio per 30 s, lavare con acqua corrente per 30 s e poi il colorante di contrasto in soluzione di eosina per 30 s.
    2. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto, ammollo in 95% ed etanolo assoluto consecutivamente.
    3. Asciugare i vetrini, eliminarle in xilene per almeno 10 min e poi montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio.
  4. Posizionare i vetrini in una diapositiva più caldo per almeno 1 h, seguito da immersione in 50% etanolo diluito con cloroformio durante la notte.
    1. Colorare i vetrini con la viola di cresyl 0,1% per 10 min in forno secco a 40 ° C.
    2. Immergere in etanolo al 95% per 30 minuti, quindi disidratare in etanolo assoluto per 2 volte.
    3. Chiara 2 volte in xilene per 5 min, quindi montare con mezzo di montaggio dopo essiccazione all'aria.
  5. Utilizzando un microscopio, osservare i cambiamenti istologici che si sono verificati dopo il trauma cranico indotto da MCAO.

5. elaborazione statistica

  1. Esprimere i risultati sperimentali come mezzi ± deviazione standard e determinare la significatività statistica fra i gruppi utilizzando un unidirezionale analisi della varianza (ANOVA), seguita dall'analisi di post hoc di Tukey utilizzando un software di analisi dati.
  2. Impostare la significatività statistica a un p-value < 0.05.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Nel gruppo normale di falsità-azionati, nessun infarto cerebrale si osserva mentre nel gruppo di controllo, si osserva una gamma piuttosto ampia di aree danneggiate. Nei topi GRex amministrato 300 mg/kg nel gruppo modello MCAO, una riduzione statisticamente significativa nella zona danneggiata è osservato (Figura 2).

I cambiamenti istologici sono studiati dalla macchiatura sezioni di cervello ischem...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Con la crescente prevalenza di malattie metaboliche come l'ipertensione cronica, diabete ed iperlipidemia, che sono i principali fattori di rischio per l'ictus, il trattamento e la prevenzione del colpo sono diventati un'importante area di ricerca medica12, 13. i deficit nel linguaggio e movimento dopo un ictus sono fortemente correlati con il grado di danneggiamento del tessuto14 del cervello e provocare una scarsa qualità di vita per i p...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Non applicabile.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., KoreaGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
Carta da filtro qualitativaAdvantecCarta da filtro n. 2Carta da filtro qualitativa
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD8418-250MLDimetil solfossido (DMSO)
Filtro per siringa (0,45 &; m)SigmaCLS431220Filtro per siringa (0,45 &; micro; m)
Stereomicroscopio StereomicroscopioLeicaM50
StereomicroscopioNikonSMZ745Stereomicroscopio
Laser DopplerMoor StrumentomoorVMS-LDFLaser Doppler
Anestesia Staffa da tavolo con N2O & Sistema di flussimetro O2Harvard Appratus34-1352Staffa da tavolo per anestesia con N2O& Sistema di flussimetro O2 Sistema
monitoraggio omeoretermicoHarvard Appratus55-7020Sistema di monitoraggio omeoreo
Fotocamera digitaleCanonEos-M2Fotocamera digitale
CriostatoLeicaCM3050SMicroscopio Criostato
Carl ZeissZeiss Axio
Analisi dei datiSystat Software Inc.SigmaPlot versione 12Analisi dei
dati Analisi dei datiNIH ImageImageJAnalisi dei dati
Dieta del topoDoo Yeol Biotech Standardroditore chowDieta del topo
IsofluranoJOONGWAEA02104781Isoflurano
IsofluranoTROIKAA ISOTROY100Isoflurano
Sutura di seta (4-0 Seta nera) AILEESK47510Sutura di seta (4-0 Seta nera) 
Sutura di seta (3-0 Seta bianca) Baekjae57Sutura di seta (3-0 Seta bianca) 
Sutura in nylon (monofilamento 8-0) AILEENB825Sutura in nylon (monofilamento 8-0) 
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)SigmaT8877-25G2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)
Formalina (soluzione di formaldeide)JUNSEI69360-1263 20KGFormalina (soluzione di formaldeide)
Ematossilina (Harris Hematoxylin)YD DiagnosticsEasyStainEmatossilina (Harris Hematoxylin)
Eosina (1% Eosina Y soluzione)MUTO PURE CHEMICALS3200-2eosina (soluzione di eosina y all'1%)
Cresil viola (acetato)SigmaC5042-10GCresil viola (acetato)
Paraformaldeide Sigma-AldrichP6148-1KGParaformaldeide 
SaccarosioJUNSEI31365-0350 1KGSaccarosio
Temperatura di taglio ottimale (OCT) compostoScigen4583Temperatura di taglio ottimale (OCT)
composto Coltello da sezioneFine Science Tools10055-12Coltello da sezionamento
#4 ForcipeFine Science Tools11241-30#4 Forcipe
5 ForcipeFine Science Tools11254-20#5 Forcipe
# 6 ForcipeFine Science Tools11260-20# 6 Forcipe
# 7 Fine ForcepFine Science Tools11274-20# 7
Forbici chirurgicheFine Science Tools14001-12Forbici chirurgiche
Extra Fine Bonn Forbici Fine ScienceTools14084-08Extra Fine Bonn Forbici
Moria Pascheff-Wolff Spring ForbiciFine Science Tools15371-92Moria Pascheff-Wolff Forbici a molla
Vessel Dilating ForcepFine Science Tools18153-11Vessel Dilating Forcep
di del microscopio # Fine Forcep

Riferimenti

  1. Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
  2. Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
  3. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
  4. Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4 (1), 1-11 (2011).
  5. Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
  6. Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
  7. Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
  8. Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
  9. Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  10. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  11. Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
  12. Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
  13. Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
  14. Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
  15. Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329(2016).
  16. Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6 (3), 133-135 (2000).
  17. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
  18. Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  19. O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6 (1), 77-78 (2011).
  20. Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
  21. Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81 (18), 1654-1669 (2015).
  22. Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Estratto di Glycyrrhizae RadixAnalisi del volume dell'infartoProtocollo di colorazione con TTCMetodo di colorazione H&EColorazione con violetto di cresileFlussometria laser DopplerSezionamento del tessuto cerebraleSomministrazione tramite gavage orale
Valutare gli effetti Neuroprotective di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma estrarre utilizzando un modello murino di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.