Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.
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Articolo metodologico
Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella candidosi orofaringea, membri del genere Candida devono rispettare e crescere sulla superficie mucosa orale mentre sotto gli effetti del flusso salivare. Mentre sono stati sviluppati modelli per la crescita sotto flusso, molti di questi sistemi sono costosi, o non consentire mentre le cellule sono sotto flusso di imaging. Abbiamo sviluppato un apparato romanzo che ci permette di immagine la crescita e lo sviluppo delle cellule di Candida albicans in flusso e in tempo reale. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per il montaggio e l'uso di questo apparato di flusso, così come la quantificazione dei dati generati. Siamo in grado di quantificare le tariffe che le cellule collegare e staccano dalla diapositiva, come pure di determinare una misura della biomassa sulla diapositiva nel corso del tempo. Questo sistema sia economico e versatile, lavorando con molti tipi di microscopi ottici, compresi microscopi benchtop poco costoso, ed è in grado di estesa volte rispetto ad altri sistemi di flusso di imaging. Nel complesso, questo è un sistema di bassa produttività che può fornire informazioni in tempo reale altamente dettagliate sulla crescita di biofilm delle specie fungine sotto flusso.
Introduzione
Candida albicans (C. albicans) è un agente patogeno fungoso opportunistico degli esseri umani che possono infettare molti tipi di tessuto, comprese le superfici mucose orale, causando la candidosi orofaringea e conseguente a una minore qualità della vita per individui affetti1. Formazione di biofilm è una caratteristica importante per la patogenesi di albicans del c., e numerosi studi sono stati fatti sulla formazione e sulla funzione di c. albicans biofilms2,3,4, 5, molti dei qual....
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Protocollo
1. Montare l'apparecchiatura di flusso
- Configurare le parti elencate nella Tabella materiali seguendo lo schema in Figura 1 con le considerazioni discussione di seguito.
Nota: Per comodità, il flusso apparato è diviso in due lati, il lato verde (tutto a Monte della diapositiva per le beute di media) e l'arancio lato (tutto a valle della diapositiva per le beute di media).- Garantire che tutto l'apparato di flusso è aria stretta per evitare perdite, con la sola eccezione delle beute media (Figura 1, 1). A tale scopo, applicare il nastro idraulici per qualsiasi filettatura m....
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Risultati
Immagini rappresentative di un normale pernottamento time-lapse esperimento utilizzando selvaggio-tipo albicans del c. le cellule a 37 ° C possono essere visto in Figura 2A e supplementare Video 1. Le immagini sono state contrasto aumentato per migliorare la visibilità. Quantificazione dei dati originali è stato effettuato, e grafici rappresentativi possono essere visto in Figura 2
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Discussione
Utilizzando il sistema di flusso come indicato in precedenza consente la generazione di video time-lapse quantitativi della crescita di biofilm fungine e dello sviluppo. Per consentire il confronto tra esperimenti è di importanza critica per garantire che i parametri di imaging vengono mantenuti lo stesso. Ciò include garantire che il microscopio è impostato per l'illuminazione di Köhler per ogni esperimento (molte guide sono disponibili online per questo processo). Oltre a parametri di imaging, ci sono alcuni passi impo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare Dr. Wade Sigurdson per fornire un input prezioso nella progettazione dell'apparato di flusso.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pompa | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Testa della pompa | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubi | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Adattatore per trappola a bolle | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Adattatore per vuoto a bolle d'aria per 1/4" ID linea di vuoto | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| Adattatore per filtro in linea (4 necessari) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Lato arancione Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Lato verde Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Vetrini | ibidi | 80196 | 4 |
| * Luers per vetrini | ibidi | 10802 | 4 |
| Vuoto Trappola a bolle assistita | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Kit trappola a bolle microfluidiche | 3 |
| palloni per terreni | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 &; m filtro dell'aria | Corning | 431229 | 1 |
| Flacone di vetro filettato per PD e pallone filtrante (2 necessari) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Tappo a vite con porte per PD e pallone filtrante (2 necessari) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Connettore per tubi con tappo a vite | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Rondella smussata | Danco | 88579 | 5,10 |
| Connettore per tubi rondella piatta | Danco | 88569 | 5,10 |
| Morsetti per filtri in linea e a valle Y (7 necessari) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Strumento di serraggio | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μ m filtro in linea per fluidi | Strumenti analitici scientifici | 850-1331 | 8 |
| 10 μ m filtro in linea per media | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μ m filtro per mezzi di ingresso | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µ m filtro media | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0,22 µ m filtro media " adattatore" | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Tappo in gomma | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Agitatore con piastra riscaldante con porta sonda esterna | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A Sonda |
| temperatura | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Riferimenti
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304(2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P.
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Ristampe e permessi
