Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per identificare gli eventi di ricombinazione omologa che si è verificato nelle cellule staminali embrionali del mouse usando macchiare del sud e/o PCR. Questo metodo è esemplificato dalla generazione di modelli di non muscolare miosina II sostituzione genetica del mouse utilizzando tradizionale embrionale basati su cellule staminali omologa ricombinazione mediata tecnologia di targeting.
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Articolo metodologico
Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Relativo alle edizioni degli effetti fuori bersaglio e la difficoltà di inserimento di un frammento di DNA lungo nell'applicazione del progettista nucleasi per staminali embrionali, modifica del genoma (ES) basati su cellule gene-targeting tecnologia non ha queste carenze ed è ampiamente utilizzato per modificare il genoma di animali/mouse che vanno da grandi delezioni/inserzioni a sostituzioni di singoli nucleotidi. In particolare, identificazione degli eventi di ricombinazione omologa (HR) relativamente pochi necessari ottenere desiderato ES cloni è un passo fondamentale, che richiede metodi accurati e affidabili. Macchiarsi del sud e/o PCR convenzionale sono spesso utilizzati per questo scopo. Qui, descriviamo le modalità di utilizzo di questi due metodi per identificare gli eventi HR che si sono verificati in cellule di topo ES in cui il gene Myh9 endogeno è destinato ad essere interrotto e sostituito da cDNA codificanti altre catena pesante di miosina non muscolare IIs (IIs NMHC). Tutta la procedura di macchiare del sud comprende la costruzione di targeting tutt', elettroporazione, selezione della droga, l'espansione e la conservazione di cellule ES/cloni, la preparazione, la digestione e macchiare del DNA genomico (gDNA), l'ibridazione e lavaggio della/delle sonde e una fase finale di autoradiografia sulle pellicole di raggi x. PCR può essere eseguita direttamente con gDNA preparato e diluito. Per ottenere risultati ideali, le sonde e l'enzima di restrizione (ri) siti di taglio per macchiare del sud e i primers per la PCR deve essere pianificati con attenzione. Anche se l'esecuzione di macchiare del sud è molto tempo e laborioso e risultati di PCR sono falsi positivi, la corretta identificazione di Southern blotting e screening rapido mediante PCR consentono l'applicazione di sola o in combinazione di questi metodi descritti in questa carta per essere ampiamente utilizzati e consultati dalla maggior parte dei laboratori nell'identificazione di genotipi di cellule ES e geneticamente animali modificati.
Introduzione
La tecnologia del gene targeting per HR in cellule ES murine fornisce un potente strumento per la dissezione delle conseguenze cellulari di specifiche mutazioni genetiche1,2. L'importanza e il significato di questa tecnologia sono riflessi nel suo riconoscimento dal 2007 Premio Nobel in fisiologia o medicina3,4; nel frattempo, rappresenta l'avvento dell'era moderna di ingegneria gene5. Gene targeting attraverso HR può essere utilizzato per progettare virtualmente qualsiasi alterazione che vanno da mutazioni puntiformi a grandi r....
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Protocollo
1. design di Targeting Construct(s), sonde per sud della macchia e primer per PCR
- Selezionare il primo esone codifica (esone 2) del gene Myh9 per rottura o inserimento nell'applicazione di knockout/knock-in segnalato qui.
- Recuperare il 5-kb a Monte e 5-kb a valle sequenze di DNA che circondano l'esone Myh9 2 dal sito Web genome.ucsc.edu .
- Analizzare i modelli di digestione di limitazione degli enzimi (REs) con 1 – 2 tagli in questa regione di 10 kb utilizzando il software pDRAW per determinare RE(s) adatto per digerire il DNA genomic per macchiare del sud.
Nota: Dra soddisfa questo requisito e viene selezionato per lo ....
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Risultati
In questa carta, un protocollo dettagliato di Southern blotting e PCR è descritto, che viene utilizzato per identificare gli eventi HR che si sono verificati in cellule di topo ES per la generazione di modelli murini di NM II sostituzione genetica, utilizzando ES basati su cellule HR-mediato tecnologia di targeting. Anche se Southern blotting e PCR, nonché tradizionale tecnologia gene-targeting, è stati ampiamente utilizzata per diversi decenni, la riuscita applicazione di loro deve esser.......
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Discussione
Attualmente, progettista nucleasi per editing genomico ancora non possono sostituire la tecnologia di gene-targeting basati su cellule ES a causa di suoi problemi di effetti fuori bersaglio e la difficoltà nell'inserimento di un lungo di30,di DNA frammento31. Come i metodi d'oro per identificare gli eventi HR che si sono verificati in cellule di topo ES, questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato di Southern blotting e PCR per il campo. Abbiamo validato l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro ha ricevuto il supporto dal programma generale del National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni No. 31571432), l'umano provinciale Natural Science Foundation della Cina (Grant No. 2015JC3097) e la Fondazione ricerca di formazione Bureau di Hunan Provincia, Cina (Grant n ° 15 K 054).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Kit per costrutti di grandi dimensioni | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmide Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuDNA polimerasi ad altissima fedeltà | Agilent | 600382 | |
| vettore T-easy | Promega | A1360 | |
| Soluzione di lisi dei nuclei | Promega | A7941 | |
| Soluzione di precipitazione proteica | Promega | A7951 | |
| Soluzione di denaturazione del DNA | VWR | 351-013-131 | |
| Soluzione neutralizzante del DNA | VWR | 351-014-131 | |
| Perle di marcatura del DNA pronte all'uso (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmone Sperma DNA Soluzione | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polimerasi Alta Fedeltà | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Non I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman Sistema di trasferimento TurboBlotter, kit grandi | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α 32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro colonne | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Soluzione di ibridazione Hybrisol I | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z& Z Medico | 844 5702 |
Riferimenti
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al.
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Ristampe e permessi
