Qui presentiamo un protocollo per separare solubilizzate thylakoid complessi mediante elettroforesi in Gel verde nativo. Gel verde bande successivamente sono caratterizzati da tempo correlato Single Photon Counting (TCSPC) e vengono forniti i passaggi base per l'analisi dei dati.
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Articolo metodologico
Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le reazioni di luce di fotosintesi sono effettuate da una serie di complessi proteici pigmentati nelle membrane tilacoidali. La stechiometria e l'organizzazione di questi complessi è altamente dinamico su sia in lungo che in breve tempo scale a causa di processi che si adattano fotosintesi al mutare delle condizioni ambientali (cioè, non-fotochimica tempra, transizioni di stato e la risposta a lungo termine). Storicamente, questi processi sono stati descritti spettroscopicamente in termini di cambiamenti in fluorescenza della clorofilla, e spettroscopia rimane un metodo fondamentale per il monitoraggio di parametri fotosintetici. Ci sono un numero limitato di modi in cui possono essere visualizzate le sottostanti dinamiche complesse della proteina. Qui descriviamo un metodo semplice e veloce per la separazione ad alta risoluzione e visualizzazione di thylakoid complessi, elettroforesi del gel verde nativo. Questo metodo è accoppiato con correlati nel tempo singolo fotone conteggio per la dettagliata caratterizzazione delle proprietà di fluorescenza clorofilla di bande separate sul gel verde.
Introduzione
Gli organismi fotosintetici devono regolare costantemente la loro fisiologia alle mutevoli condizioni ambientali, per massimizzare la loro produttività e competere con successo con i vicini1. Questo è particolarmente vero per il macchinario responsabile per le reazioni di luce della fotosintesi, come luce ambientale condizioni possono fluttuare da tre ordini di grandezza tra ombre e pieno sole. Inoltre, fattori ambientali, come siccità, freddo o lo stress da calore possono ridurre la disponibilità di anidride carbonica per la fissazione del carbonio, che è il lavandino elettrone naturale per i prodotti delle reazioni luce. Piante devono, pertan....
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Protocollo
1. magazzino soluzioni preparazione per colata gel verde nativo
- Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per la risoluzione di gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 8.3.
- Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per stacking gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 6,3.
- Memorizzare i buffer a 4 ° C per prevenire la crescita di muffa.
Nota: I buffer sono stabili per mesi a 4 ° C, quindi è consigliato preparazione di 100-200 mL di ogni buffer per uso continuato. - Preparare 1 L di 10 x in esecuzione tampone contenente 250 mM Tris-HCl pH ....
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Risultati
Risultati rappresentativi per elettroforesi del gel di colore verde sono presentati nella Figura 1. Lane 1 fornisce un esempio di risultati ideali per elettroforesi del gel verde di spinaci tilacoidi, in cui è visibile un numero massimo di bande verdi chiare e nitide. Questi risultati sono un po' atipici, in parte perché non tutte le bande vista nel vicolo 1 sono normalmente presenti in un dato campione. Pulitura di esempio aggiuntivi, sotto forma di isolamen.......
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Discussione
Un successo thylakoid solubilizzazione e Natale gel eseguire comporterà la risoluzione di più distinte bande verde visibile sul gel senza distorsione significativa o sbavature delle bande. Sovraccaricare il gel, un'alta concentrazione di detersivo, un pH di esempio errato, non disciolto materiale, correre il gel troppo rapidamente o ad una temperatura troppo elevata, e un gel indebitamente versato sono tutti fattori che possono contribuire alla mal risolto thylakoid complessi. Ottimizzando le condizioni del gel stesso (<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Finanziamento e sostegno sono stati forniti dal dipartimento di chimica presso la Michigan State University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, non dodecil maltoside o alfa decil maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37,5/1 C Soluzione al 40% |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Persolfato di ammonio | BioRad | 161-0700 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma | M2670 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | P9333 |
Riferimenti
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A.
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Ristampe e permessi
